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第2节
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
本节聚焦
1
2
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
【从社会中来】
转基因抗虫棉与普通棉花
提示：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
Bt抗虫蛋白基因、简称Bt基因
苏云金杆菌
与载体拼接
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
【从社会中来】
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
4 3 2 1
目 录
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预
期表达产物等的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
1.目的基因
第一步 目的基因的筛选与获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因
科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解
随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知。
2.筛选合适的目的基因
第一步 目的基因的筛选与获取
（1）常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
发明者：穆里斯；
PCR是聚合酶链式反应的缩写；
PCR的含义：依据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（2）还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
（3）人工合成目的基因
3. 获取目的基因的方法
第一步 目的基因的筛选与获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。
3. 获取目的基因的方法
（2）还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
基因组文库
cDNA文库
某生物体内全部DNA
限制酶
与载体 连接导入
许多DNA片段
受体菌群体
某生物某时期的mRNA
逆转录等
与载体 连接导入
cDNA（互补DNA）
受体菌群体
在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段。
☆仅适用于较短的DNA，如：PCR引物、基因探针。
3. 获取目的基因的方法
（3）人工合成目的基因
3′
5′
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。
由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸连接成链，因此子链合成需要引物（一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸）。
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
说明：PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似，可通过基团转移为反应提供能量。
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
引物
（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲溶液、Mg2+（激活DNA聚合酶）
4.利用PCR获取和扩增目的基因
dNTP的作用：既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
4种脱氧核苷酸
(实质是4种脱氧核苷三磷酸dNTP)
原料：
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
1）变性：
当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
第一步：变性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
扩增过程：
2）复性：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通 过 与两条单链DNA结合。
第二步：复性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
5’
5’
思考：什么是引物？为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
②因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
③引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
3’
3’
3）延伸：
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
脱氧核苷酸
5’
5’
DNA聚合酶
72℃
3’
3’
3’
3’
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
A
G
C
T
待扩增的DNA片段
4种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA聚合酶
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
变性
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
复性
温度降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度升至72℃左右，溶液中4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下合成新的DNA链
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
受热变性
引物
耐高温的
DNA聚合酶
（2）过程：
PCR小结
4.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）条件：
缓冲溶液、DNA模板、与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮循环，以_____形式扩增，可以扩增出 个DNA片段。　　　　
指数
2n
PCR小结
（4）仪器：　　　
PCR扩增仪（PCR仪）
（5）鉴定PCR产物的方法：　　　
琼脂糖凝胶电泳
4.利用PCR获取和扩增目的基因
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
标准
样品1
样品2
样品3
较小的DNA片段在凝胶中移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
深入思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA在进行扩增。
由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：
第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
PCR反应过程视频讲解
重难点：利用PCR获得和扩增目的基因
【素养提升①】获得所需的目的基因：
一
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
目的片段
第一轮
【思考】第几轮PCR循环结束时，可出现两条单链等长的目的片段？
5'
3'
5'
3'
引物A
3'
5'
5'
3'
引物B
目的片段
1.若两条引物均从DNA分子端部结合，
则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。
重难点：利用PCR获得和扩增目的基因
【素养提升①】获得所需的目的基因：
2.若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合，
则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。
5'
3'
5'
3'
引物A
3'
5'
5'
3'
引物B
目的片段
第一轮
第二轮
目的片段
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
二
5'
3'
5'
3'
5'
3'
目的片段
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
引物A
引物B
扩增一次
重难点：利用PCR获得和扩增目的基因
【素养提升①】获得所需的目的基因：
3.若两条引物均从DNA分子中间部位结合时，
则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
扩增两次
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
出现完整的目的基因
扩增三次
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
短链-短链DNA______个
扩增四次
2
8
15
15
6
扩增次数 1次 2次 3次 4次 n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2n-2
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
长链条数：始终是最初DNA分子的两条链。
中链条数：始终是最初DNA分子的两条长链为模板形成的，并且每复制一次，新形成的中链增加两条。
短链条数：所有的DNA分子中，除长链和中链外，余下的即为短链。
复制过程中共需引物_______对
2n-1
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中等长链DNA分子数为：______个
②子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_______个
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_______个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物________个
⑥第n次复制需要引物_________个
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR扩增DNA规律
重难点：利用PCR获得和扩增目的基因
【素养提升②】引物的设计：
1．PCR扩增的 (填“是”或“不是”)
完整的模板DNA分子，
理由是 。
2．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是 。
3.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别
添加上 。
不是
PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段
根据目的基因两端（ ′端）的核苷酸序列设计引物
5′端
限制酶的识别序列
3
重难点：利用PCR获得和扩增目的基因
【素养提升③】引物的设计：
4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，
第1组不合理的原因： 。
第2组不合理的原因： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
设计引物的原则：
①两种引物之间:
；
②每种引物内部:
；
不能在局部发生碱基互补配对
不能在局部发生碱基互补配对
1．PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是（ ）
A．都遵循碱基互补配对原则
B．DNA聚合酶作用的最适温度不同
C．都是边解旋边复制的过程
D．复制方式都是半保留复制
C
获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
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目 录
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
第二步 基因表达载体的构建
1.目的
2.基因表达载体的组成
☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作
（1）让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
U
A
A
G
U
C
C
C
T
T
G
G
A
A
A
游离的核糖核苷酸
RNA聚合酶
mRNA
DNA
1. 解旋
RNA聚合酶与编码蛋白质的一段DNA结合，使DNA双链解开，碱基暴露出来。
游离的核糖核苷酸与DNA模板链上的碱基互补配对，在RNA聚合酶的作用下开始mRNA的合成。
新结合的核糖核苷酸连接到正在合成的mRNA分子上。
4. 释放
3. 连接
2. 配对
合成的mRNA从DNA链上释放。而后，DNA双螺旋恢复。
真核生物基因的结构
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
mRNA
目的基因
标记基因
启动子：
终止子：
复制原点
是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
一段特殊DNA序列，位于基因的下游，终止转录。
2.基因表达载体的组成
有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
便于重组DNA分子的筛选
DNA复制的起始位点。
载体≠表达载体：
1.二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
2.表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
辨析
目的基因插入位点是随意的吗？应注意什么？
思考
提示： 随意的；
目的基因的表达需要 与 的调控，
所以目的基因应插入到启动子和终止子 的部位。
不是
启动子
终止子
之间
易错提醒
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 ______ _____ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
目的基因
限制酶切割位点
先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶（同尾酶）切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
3.基因表达载体的构建程序
1、单酶切（同一种酶）：
（1）目的（结果）：
产生相同的黏性末端，以便进行连接
（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：
①目的基因——载体连接物
②载体——载体连接物
③目的基因——目的基因连接物
②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化
拓展：限制酶的选择
单酶切缺点：
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
问题探讨
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
-G
-CTTAA
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切的优点:
① 防止质粒重新环化
② 防止质粒与目的基因反向连接
③ 防止目的基因自身环化
知识扩展：限制酶的选择原则
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中 ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择 和 两种限制酶。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
SmaⅠ
PstⅠ
PstⅠ
EcoRⅠ
根据常规质粒的结构确定限制酶的种类
3．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是（ ）

A．荧光蛋白基因
B．启动子
C．限制酶
D．起始密码子
B
4．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是（ ）

A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
B
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目 录
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。基因工程中不同生物转化方法不同。
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法(受精卵)
——Ca2+处理法（大肠杆菌）
1.转化
2.目的基因导入受体细胞的方法
第三步 将目的基因导入受体细胞
复习：
1.基因工程的基本操作程序；
2.获取目的基因的方法；
3.PCR原理、条件、过程、结果；
4.构建基因表达载体的目的
5.基因表达载体的组成；
6.如何构建基因表达载体；
7.将目的基因导入受体细胞的方法？
导入植物细胞（植物细胞转化方法）：
花粉管通道法
第三步 将目的基因导入受体细胞
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
有多种操作方式：
例如可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
导入植物细胞（植物细胞转化方法）：
花粉管通道法
第三步 将目的基因导入受体细胞
适用生物：开花植物
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
T-DNA
T i 质 粒
目的基因
导入植物细胞（植物细胞转化方法）：
2.农杆菌转化法
第三步 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
Ti质粒
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现新性状的植物
植物细胞
染色体DNA
植物叶片切下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，或将花序培养在农杆菌溶液中，获得种子，然后筛选、鉴定
第三步 将目的基因导入受体细胞
植物组织培养
第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入
两次拼接：
两次导入：
表现出新性状的植株
第二次拼接：指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作)。
第二次导入：指含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)。
导入动物细胞（动物细胞转化方法） ：
常用显微注射法将目的基因注入受精卵
第三步 将目的基因导入受体细胞
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射法将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）
获得具有新性状的动物
导入原核细胞（细菌转化方法）
一般用Ca2+处理使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态），然后将重组的基因表达载体导入其中。
第三步 将目的基因导入受体细胞
利用转基因大肠杆菌生产药物
实例：
5．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（ ）

A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
B．③侵染植物细胞后，重组 Ti 质粒整合到④的染色体DNA上
C．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了定向的可遗传变异
D．若④的染色体上含抗虫基因，⑤就表现出抗虫性状
C
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目 录
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
1.目的
2.检测内容及方法
第四步 目的基因的检测与鉴定
逆转录
①PCR等技术检测
提取
待测DNA
转基因
生物
PCR
通过电泳检测是否扩增出目的基因
提取
待测mRNA
转基因
生物
PCR
利用目的基因的核苷酸序列设计引物。
PCR中的引物应该根据什么进行设计？
思考
②DNA分子杂交技术
将受体DNA/RNA提取出来，进行PCR扩增
探针
使探针与PCR扩增后的产物进行杂交，如果出现杂交带，就说明目的基因整合到受体生物的染色体DNA上或者转录出了mRNA
基因探针：简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。
基因是否翻译为蛋白质——抗原-抗体杂交技术
Bt抗虫蛋白
个体生物学水平的鉴定
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
第四步 目的基因的检测与鉴定
抗性鉴定
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作程序
转基因抗虫棉在世界范围被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫中存在对Bt抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题：
1．在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
2．科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
【到社会中去】
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
【提示】外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
普通大米（左）和“黄金大米”（右）
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN 12424的作用是______ 。
【提示】ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
【提示】不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
二、拓展应用
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
【提示】维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广黄金大米”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
二、拓展应用
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
（1）DNA片段的扩增
①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。
②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
③PCR仪实质就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA片段的电泳鉴定
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色（EB染色），可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
实验原理
加样孔
电源
材料用具：试剂
①PCR反应体系的配方
材料 用量
10倍浓缩的扩增缓冲液（含 ） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为 ） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即 的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
Mg2+
dNTP
耐高温
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具：试剂
②无菌水、琼脂糖；
③电泳缓冲液（TAE或TBE）；
④凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝和蔗糖）；
⑤核酸染料（常用核酸染料为溴化乙锭，简称EB）；
→配制凝胶；
→增加导电性；维持电泳过程中合适的pH;
→溴酚蓝作为前沿指示剂可以预测电泳进程；蔗糖：可以增加样品密度；
→使核酸染色，便于观察；
材料用具：用具
①PCR仪
②微量离心管
③微量移液器
④一次性吸液枪头
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
→自动控温，实现DNA的扩增
→实际上是进行PCR反应的场所
→用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
→微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1pg～1μg 1．PCR加样操作
按照右表，用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。）
方法步骤
2．离心
盖严离心管，离心10s，使反应液集中在离心管底部。
3 ．PCR
参照上表设置PCR循环程序。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
电泳
4．制备凝胶
根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制适合浓度的琼脂糖溶液（一般为0.8%～1.2%）。琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。
将琼脂糖溶液倒入模具，并插入大小合适的梳子（用以形成加样孔）。
待凝胶凝固后，将梳子拔出。
5．电泳加样
将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液没过凝胶约1mm。将PCR扩增产物与凝胶载样缓冲液（内含有指示剂）混合，用移液器缓慢注入加样孔。其中一个加样孔中加入Maker（指示分子大小的参照物）。
6．电泳
接通电源，设定电压（一般1～5V/cm），待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时，停止电泳。
7．观察、照相
取出凝胶在紫外灯下观察、照相。
注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
提示：可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
结果分析与评价
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达
载体的构建
（核心工作）
将目的基因
导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
筛选
获取
有效方法
从相关已知结构和功能清晰的基因中筛选
人工合成
构建基因文库
PCR
含义
条件
过程
结果
仪器
产物鉴定方法
变性
复性
延伸
循环
目的
构建步骤
组成
植物
微生物
动物
花粉管通道法
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2+
处
理
分子水平
个体水平
DNA
mRNA
蛋白质
PCR
等技术
抗原-抗体
杂交法

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