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第54讲　微生物的培养技术及应用
一、选择题
1.（2025·重庆联考）防止杂菌污染，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是（　　）
A.实验室里可用紫外线或化学药物对物体表面或空气进行消毒
B.实验室里不可吃东西，离开时一定要洗手以防被微生物感染
C.接种环、接种针等用具应在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
D.使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
2.（2025·福建南平高三联考）下列关于微生物纯培养的叙述，错误的是（　　）
A.倒平板操作应等培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行
B.微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
C.用平板划线法和稀释涂布平板法都能在固体培养基上得到单菌落
D.涂布平板时应先将培养皿盖置于实验操作台上
3.（2025·福建宁德五校联合检测）为加速我国北方冬春季秸秆原位还田的腐化过程，研究人员以冻牛粪为材料筛选出耐低温（10 ℃）的纤维素降解菌。下列相关叙述正确的是（　　）
A.选用冻牛粪为材料与其富含纤维素及含耐低温微生物有关
B.初筛菌种前，要利用固体培养基在37 ℃条件下扩大培养目标菌种
C.用于筛选的培养基是加入刚果红染料的牛肉膏蛋白胨培养基
D.应选择菌落直径与周围透明圈直径比值大的菌落进行纯化
4.（2025·山东淄博模拟）从土壤中分离某种微生物的培养基配方如图，该培养基中，果胶被刚果红染成红色。将土壤稀释液接种在该培养基上，培养一段时间后，平板上出现多个周围有透明圈的菌落。下列分析错误的是（　　）
A.该培养基可用于分离产果胶酶的微生物 B.培养基配方中的X应为琼脂
C.KH2PO4和Na2HPO4能维持培养基的pH D.周围出现透明圈的菌落全部为同一种微生物的克隆
5.（2025·山东济宁模拟）耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。嗜热菌可以在高温环境中生存，其产生的淀粉酶最适温度较高。筛选能产生耐高温淀粉酶的嗜热菌过程如图1所示，其中Ⅰ号培养基用碘液处理的结果如图2所示。下列叙述正确的是（　　）
A.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
B.倒平板后对培养皿进行高压蒸汽灭菌
C.淀粉是图2所示固体培养基的唯一碳源
D.甲、乙试管中均为选择培养基
6.（2025·广东湛江模拟）自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图所示。已知步骤④获得的3个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是（　　）
A.步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B.步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C.1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D.所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
7.（2025·江苏南京、盐城模拟）为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。下列相关叙述正确的是（　　）
A.为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②③
B.图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C.图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D.不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
8.（2025·山东日照模拟）三糖铁培养基（TSI）含有牛肉膏、蛋白胨、糖类（乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10∶10∶1）、酚红（在酸性条件下呈黄色、碱性条件下呈红色）等成分。TSI琼脂试验法通过观察肠杆菌科细菌对三种糖的分解产生酸（少量的酸能被空气缓慢氧化）量的多少来鉴别其种类。操作过程是：用接种针挑取待测菌落后，刺入斜面TSI内，后缓慢抽出接种针，在斜面上进行“之”字划线。下列分析错误的是（　　）
A.牛肉膏可为细菌提供氮源和维生素等
B.穿刺和划线的过程需严格控制杂菌污染
C.若培养基中底层与斜面均呈黄色，推测细菌只能分解乳糖
D.若底层呈黄色、斜面先呈黄色后变红，推测细菌可能只分解葡萄糖
二、非选择题
9.（2025·江苏镇江联考）我国卫生部门规定饮用水标准是1 mL自来水中细菌总数不超过100个（37 ℃培养24 h），1 000 mL自来水中大肠杆菌菌落数不能超过3个（37 ℃培养48 h）。水中大肠杆菌的含量常采用伊红—亚甲蓝琼脂培养基进行检测，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色且带有金属光泽。某校生物兴趣小组开展校园桶装纯净水微生物含量检测活动，请回答问题：
（1）检测饮用水中的细菌，需要配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏和蛋白胨可以为细菌生长提供　　　　　　　　　　　　　　（至少写出两点）等营养物质。从物理状态角度分析，此培养基属于　　　　培养基。
（2）某同学分别向3个培养基中各加入1 mL，未经稀释的待测水样，涂布均匀后置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，结果如图1所示。检测时使用的接种量为1 mL而不是0.1 mL，其理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）下图2为用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目的流程示意图，请完成下表。
实验步骤的目的 简要操作过程
①　　 　　　 将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15 min，共煮沸三次
过滤细菌 装置安装好后，向漏斗内加入1 000 mL水样，加盖抽滤
冲洗漏斗壁 再向漏斗内加等量②　　　　继续抽滤
③　　　　 　 用无菌镊子取滤膜，将其紧贴在伊红—亚甲蓝琼脂平板上，然后将平板④　　　　，37 ℃培养48小时
统计大肠杆菌菌落数 选取⑤　　　　　　　　　　　　　　的菌落进行计数，统计结果为2个
（4）综合（2）（3）测定结果，你认为所测桶装纯净水的微生物含量　　　　（填“能”或“不能”）达到饮用水卫生标准，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （写出两点）。
第54讲　微生物的培养技术及应用
1.C　接种环、接种针等用具应在酒精灯火焰的外焰部位灼烧灭菌，C错误。
2.D　平板划线法通过连续划线操作可得到单菌落，稀释涂布平板法在稀释倍数足够高的情况下，可通过将稀释液涂布在培养基上获得单菌落，即平板划线法和稀释涂布平板法都能在固体培养基上得到单菌落，C正确；涂布平板时不能完全打开培养皿，将皿盖置于实验操作台上，应在火焰附近将培养皿打开一条缝隙，D错误。
3.A　冻牛粪中富含纤维素，有很多微生物，冻牛粪因温度低，其内的微生物是耐低温微生物，故选用冻牛粪为材料筛选耐低温的纤维素降解菌，A正确；初筛菌种前，要利用液体培养基在37 ℃条件下扩大培养目标菌种，B错误；用于筛选的培养基是以纤维素为唯一碳源的固体培养基，加入的刚果红染料起鉴别作用，C错误；由于刚果红染料与纤维素形成红色复合物，因此会出现以纤维素降解菌为中心的透明圈，菌落直径与周围透明圈直径比值越小，菌株分解纤维素的能力越强，故应选择菌落直径与周围透明圈直径比值小的菌落进行纯化，D错误。
4.D　该培养基的唯一碳源为果胶，能够生长的细菌是能分解果胶的细菌，因此该培养基可用于分离产果胶酶的微生物，A正确；该平板培养基为固体培养基，琼脂为凝固剂，因此培养基配方中的X应为琼脂，B正确；KH2PO4、Na2HPO4在提供无机盐的同时还能维持培养基pH稳定，C正确；能产生果胶酶的微生物不止一种，通常情况下，用此培养基筛选出来的微生物种类不一定相同，D错误。
5.A　淀粉与碘液反应呈现蓝色，能分解淀粉的嗜热菌在培养基上生长时可释放淀粉酶，分解培养基中的淀粉，故周围不显蓝色的菌落含有所需菌种，A正确；倒平板时培养皿和培养基都已灭菌处理，因此倒平板后不需要对培养皿再进行高压蒸汽灭菌，B错误；据题图2可知，培养基上出现周围显蓝色的菌落和周围不显蓝色的菌落，因此淀粉可能不是题图2所示固体培养基的唯一碳源，C错误；题图1中①过程是梯度稀释，②过程是接种，因此甲、乙试管主要是对嗜热菌样品进行稀释，不具备选择作用，不属于选择培养基，D错误。
6.C　步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；由题图观察可知，步骤④平板中的菌落分布均匀，故步骤④所用的接种工具是涂布器，接种方法是稀释涂布平板法，B错误；1 g土壤中平均自生固氮菌数约为（90＋95＋100）/3÷0.1×104＝9.5×106（个），C正确；本实验需要分离的自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，故所用培养基中不能加入氮源，D错误。
7.D　为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中①酒精灯（操作需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌）、③培养基和④涂布器，②为接种环（接种工具），是平板划线法接种时需要使用的接种工具，用平板划线法不能获得长满测试菌的平板，A错误；图2中Ⅱ处透明圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误。
8.C　牛肉膏可为细菌提供碳源、氮源、磷酸盐和维生素等，A正确；本实验通过TSI琼脂试验法，观察肠杆菌科细菌对三种糖的分解产生酸（少量的酸能被空气缓慢氧化）量的多少来鉴别其种类，故穿刺和划线的过程需严格控制杂菌污染，B正确；由于酚红在酸性条件下呈黄色、碱性条件下呈红色，若培养基的中底层与斜面均呈黄色，说明细菌产酸的量多，推测细菌也可能分解乳糖、蔗糖和葡萄糖，或分解含量较多的乳糖和蔗糖（或其中之一），C错误；若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，因培养基中葡萄糖的含量较少，其产酸的量也较少，斜面上所生成的少量酸被空气缓慢氧化，使斜面由黄色变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所产生的酸一时不能被空气氧化而仍保持黄色。故若底层呈黄色、斜面先呈黄色后变红，推测细菌可能只分解葡萄糖，D正确。
9.（1）碳源、氮源、磷酸盐、维生素　固体　（2）0.1 mL水样中细菌数目较少，经培养后平板菌落数可能达不到30个　（3）①滤膜消毒　②无菌水　③培养大肠杆菌　④倒置　⑤呈深紫色且带有金属光泽　　（4）能　1 mL水样中细菌总数约为98个，没有超过100个；1 000 mL水样中大肠杆菌为2个，没有超过3个
解析：（1）该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨，其中蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，故蛋白胨可以为微生物的生长提供碳源、氮源和维生素等营养物质；该培养基含有琼脂，故属于固体培养基。（2）微生物计数时，应统计30～300之间的菌落，由于0.1 mL水样中细菌数目较少，经培养后平板菌落数可能达不到30个，故检测时使用的接种量为1 mL而不是0.1 mL。（3）①“滤膜法”测定饮用水中大肠杆菌的数量时首先应进行滤膜消毒，以保持实验过程中的无菌环境，主要是通过加热煮沸的方法进行；②冲洗漏斗壁时向漏斗内加等量无菌水继续抽滤；③培养大肠杆菌时可加入伊红—亚甲蓝作为指示剂，两者反应呈深紫色且带有金属光泽；④培养基培养时应将其倒置；⑤选取呈深紫色且带有金属光泽的菌落进行计数。（4）分析题意可知，我国卫生部门规定饮用水标准是1 mL自来水中细菌总数不超过100个（37 ℃培养24 h），1 000 mL自来水中大肠杆菌菌落数不能超过3个（37 ℃培养48 h），故该同学认为所测桶装纯净水的微生物含量已达到了饮用水卫生标准，是因为：1 mL 水样中细菌总数约为（96＋106＋92）÷3＝98个，没有超过100个；1 000 mL水样中大肠杆菌菌落数为2个，没有超过3个。
2 / 3第54讲　微生物的培养技术及应用
课程标准
1.阐明在发酵工程中防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的前提。
2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
5.概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一　微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
（2）种类及用途
（3）营养组成
①一般都含有　　　、　　　　、　　　　和无机盐等营养物质。
②需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸菌 添加　　　
霉菌 将培养基调至　　　性
细菌 将培养基调至　　　　　　　性
厌氧微生物 提供　　　　的条件
提醒 ①牛肉膏、蛋白胨提供的主要营养物质有氮源、碳源、维生素等，牛肉膏还可以提供磷酸盐。
②可通过培养基中碳源、氮源类型判断培养对象类型。如培养基中无有机碳源，则培养物为自养生物；若培养基中无有机氮源，则培养物一般为固氮微生物。
2.无菌技术
（1）目的：获得纯净的微生物培养物。
（2）关键：防止　　　　　　。
（3）常用方法
【教材拾遗】 （选择性必修3 P10相关信息）生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。
3.微生物的纯培养
（1）概念辨析
（2）酵母菌的纯培养操作步骤
提醒 ①平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
②倒平板整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
（3）平板划线法操作步骤
提醒 培养基中微生物数量过多或成片可能的原因
①菌液浓度过高。
②培养过程中被杂菌污染。
③利用接种环划线时，每次划线前未灼烧接种环灭菌。
1.（选择性必修3 P9正文）微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。（　　）
2.（选择性必修3 P10正文）在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。（　　）
3.（选择性必修3 P10正文）为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。（　　）
4.（选择性必修3 P10正文）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和灭菌。（　　）
5.（选择性必修3 P12～13探究·实践）倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。（　　）
6.（选择性必修3 P12～13探究·实践）培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。（　　）
1.（2025·河北高三联考）下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是（　　）
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4
含量 10 g 10 g 2 g
成分 伊红 亚甲基蓝 蒸馏水
含量 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A.从物理性质看该培养基属于固体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基
B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C.该培养基缺少提供无机盐的物质
D.该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
2.（2025·辽宁沈阳高三期末）在做微生物实验时，为了防止杂菌污染，需要做好消毒和灭菌工作。下表中有关消毒和灭菌方法的使用，错误的是（　　）
选项 材料或器具 方法
A 水源 氯气消毒
B 培养皿 干热灭菌
C 牛奶 高压蒸汽灭菌
D 涂布器 灼烧灭菌
3.（2025·河北邢台高三月考）如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述错误的是（　　）
A.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒处理
B.步骤①倒平板操作过程中，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，防止周围环境中杂菌的污染
C.步骤③应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D.步骤③划线结束后在培养皿皿盖上做好标注，培养皿需要倒置培养
题后归纳
平板划线操作的注意事项
（1）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（2）第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（3）划线时最后一次划线不要与第一次划线相连。
（4）划线时力度大小要适当，避免用力过大将培养基划破。
（5）操作第一步即取菌种之前以及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的不同：
4.（2025·安徽安庆高三联考）在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述，错误的是（　　）
A.玻璃和金属材质等实验器具可放入干热灭菌箱中干热灭菌
B.接种环在接种前后，均需在酒精灯的火焰上进行灼烧消毒
C.没有将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽将影响培养基的灭菌效果
D.适量喷洒苯酚同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果
考点二　微生物的选择培养和计数
1.微生物的选择培养
（1）选择培养基
（2）稀释涂布平板法
（3）培养观察
待涂布的菌液被培养基　　　　后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的　　　　。
2.微生物的数量测定
提醒 ①每隔一定的时间（如24 h）统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落数目。
②当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。稀释涂布平板法统计的菌落数目比活菌实际数目少。
3.活动：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）实验原理
（2）操作步骤
（3）实验结果分析与评价
1.（选择性必修3 P16正文）选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。（　　）
2.（选择性必修3 P18正文）菌液的稀释度足够高时，培养基表面会获得单菌落。（　　）
3.（选择性必修3 P20概念检测2）稀释涂布平板法计数时，平板上的一个菌落就是一个细菌。（　　）
4.（选择性必修3 P18正文）利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。（　　）
5.（选择性必修3 P18相关信息）利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。（　　）
6.（选择性必修3 P20拓展应用2）纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈越大，说明该类纤维素分解菌分解纤维素的能力越强。（　　）
1.（2023·广东高考10题）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（　　）
A.a点时取样、尿素氮源培养基 B.b点时取样、角蛋白氮源培养基
C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D.c点时取样、角蛋白氮源培养基
2.（2025·福建福州高三质检）某研究小组用马铃薯琼脂培养基对新酿米酒中的酵母菌进行初步分离，结果如图所示，下列叙述正确的是（　　）
A.图a中下一次划线总是从上一次划线的首端开始
B.配制马铃薯琼脂培养基时，其pH需要调节到中性
C.浸泡在酒精中消毒的涂布器使用前需要在火焰上灼烧
D.图a、图b的方法都可以实现对酵母菌的分离和计数
题后归纳
两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
3.（2025·河北唐山高三一模）为了从土壤中筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，研究人员利用土壤浸出液进行了下图所示操作。下列说法错误的是（　　）
A.用稀释涂布平板法或平板划线法将土壤浸出液接种在X培养基上
B.菌落①可能是硝化细菌，因不能产生淀粉酶所以无透明圈
C.X培养基是含有淀粉和抗生素的固体培养基，Y培养基是不含琼脂的液体培养基
D.图中降解淀粉最高效的是菌落⑤，可根据菌落特征初步判断微生物类型
1.（2024·海南高考12题）某小组为检测1株粗糙脉孢霉突变株的氨基酸缺陷类型，在相同培养温度和时间的条件下进行实验，结果见表。下列有关叙述错误的是（　　）
组别 培养条件 实验结果
① 基础培养基 无法生长
② 基础培养基＋甲、乙、丙3种氨基酸 正常生长
③ 基础培养基＋甲、乙2种氨基酸 无法生长
④ 基础培养基＋甲、丙2种氨基酸 正常生长
⑤ 基础培养基＋乙、丙2种氨基酸 正常生长
A.组别①是②③④⑤的对照组
B.培养温度和时间属于无关变量
C.①②结果表明，甲、乙、丙3种氨基酸中有该突变株正常生长所必需的氨基酸
D.①～⑤结果表明，该突变株为氨基酸甲缺陷型
2.（2024·黑吉辽高考19题改编）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是（　　）
A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感染植株上采集样品
B.将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C.将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D.判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
3.（2024·湖南高考6题）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是（　　）
A.①②⑤⑥　　　　　　　 B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
4.（2023·山东高考15题）平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是（　　）
A.不含氮源的平板不能用于微生物培养
B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
溯源教材
（1）培养基的配方不同，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。（见选择性必修3 P10正文）
（2）将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。（见选择性必修3 P17图1－7）
（3）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。（见选择性必修3 P13正文）
（4）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。（见选择性必修3 P18探究·实践）
5.（2023·辽宁高考9题）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m3）。下列叙述错误的是（　　）
A.采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B.细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C.同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D.稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
6.（2024·全国甲卷37题，节选）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
（1）该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为　　　　个/mL。
（3）菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是　　　　　　　　　　　　　　，冷却的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　。
（4）据图可知杀菌效果最好的消毒液是　　　　，判断依据是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答出2点即可）。
　（1）从试管取菌种前，先在火焰旁拔棉塞，再将试管口迅速通过火焰以灭菌。 （2024·江苏高考）（　　）
（2）血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。 （2023·江苏高考）（　　）
（3）某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。 （2022·江苏高考）（　　）
（4）为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。 （2022·湖北高考）（　　）
（5）稀释涂布平板法既可分离菌株，又可用于计数。 （2024·贵州高考）（　　）
第54讲　微生物的培养技术及应用
【破考点·抓必备】
考点一
知识梳理夯基
1.（2） 液体　 天然　 合成　 选择　 鉴别　 抑制或阻止　（3）①水　碳源　氮源　②维生素　酸　中性或弱碱　无氧
2.（2）杂菌污染　（3）巴氏消毒　灼烧灭菌　湿热灭菌
3.（1）单一个体　固体培养基　（2） 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）法　 干热灭菌法　 酒精灯火焰　 灼烧灭菌　 平板划线法　 恒温培养箱
概念检测
1.√　2.×
3.×　提示：接种环灼烧灭菌后，应冷却后再挑取菌落，以免高温杀死菌种。
4.×　提示：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
5.×　提示：倒平板时，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基（10～20 mL）倒入培养皿，立即盖上培养皿的皿盖，不能完全打开皿盖。
6.√
典题演练应用
1.B　该培养基成分中不含琼脂，不是固体培养基，A错误；培养基成分中的K2HPO4为其提供无机盐，C错误；培养基调节合适的pH后需要灭菌后才能接种使用，D错误。
2.C　可用氯气对水源进行消毒，A正确；培养皿可在干热灭菌箱中160～170 ℃灭菌1～2 h，B正确；培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，牛奶一般用巴氏消毒法进行消毒，C错误；涂布器需采用灼烧灭菌的方法，冷却后才能进行涂布操作，D正确。
3.D　步骤①倒平板操作过程中，用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，防止周围环境中杂菌的污染，B正确；步骤③应多个方向划线，划三至五条平行线，注意不要将最后一区的划线与第一区相连，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落，C正确；步骤③划线结束后应在皿底上做好标注，D错误。
4.B　在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌，一些金属材质的实验器具也可以灼烧灭菌，A正确；为了防止杂菌污染和感染操作者，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌（不是消毒），B错误；若未将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽，会因达不到规定温度而影响灭菌的效果，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间常采用紫外线照射消毒，适量喷洒苯酚同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果，D正确。
考点二
知识梳理夯基
1.（1） 尿素　 氮源　 细菌　 高温　（2）②酒精　冷却　（3）吸收　单菌落
2.（1） 30～300　 平均值　 少　 菌落　（2） 血细胞计数板　 血细胞计数板　 显微镜　 活菌　 死菌
3.（1）脲酶　尿素　（2）稀释涂布平板　菌落数目稳定
概念检测
1.×　2.√　3.×
4.×　提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，故稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
5.×　提示：显微镜直接计数法不能区分细菌的死活，因此统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
6.√
典题演练应用
1.D　由图可知，随着堆肥时间的延长，堆肥温度先升高后保持稳定，a点时堆肥温度最低，c点时堆肥温度最高。该实验的目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，应该用以角蛋白为唯一氮源的培养基进行筛选培养，且应该在高温条件下取样，即c点时取样，D符合题意。
2.C　图a的接种方法为平板划线法，下一次划线总是从上一次划线的末端开始，起到逐级稀释菌种的目的，A错误；配制马铃薯琼脂培养基用于培养酵母菌时，其pH需要调节到酸性，B错误；涂布器需要酒精浸泡再放在酒精灯火焰上灼烧灭菌，以防止杂菌污染，C正确；图a（平板划线法）、图b（稀释涂布平板法）的方法都可以实现对酵母菌的分离，但图a平板划线法不能用于计数，D错误。
3.A　根据X培养基上形成的菌落分布特征可知，将含目的菌的土壤浸出液接种在X培养基上采用的是稀释涂布平板法，A错误；菌落①周围无透明圈，说明其不能降解淀粉，可能是硝化细菌，因不能产生淀粉酶所以无透明圈，B正确；实验目的是筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，可知X培养基上含有淀粉和抗生素，Y培养基用于将筛选到的目的菌扩大培养，为不含琼脂的液体培养基，C正确；碘液遇淀粉会变蓝，淀粉被分解，形成透明圈，题图中菌落⑤的透明圈最大，说明菌落⑤降解淀粉的能力最强，不同菌落的特征不同，因此可根据菌落特征初步判断微生物类型，D正确。
【研真题·扣教材】
1.D　由表可知，除了组别①之外，其他组别的基础培养基中都添加了氨基酸，因此组别①是②③④⑤的对照组，A正确；由题意表中信息可知，实验的自变量为培养条件，各组别的培养温度和时间均相同，说明培养温度和时间均属于无关变量，B正确；由①②结果可知：粗糙脉孢霉突变株在基础培养基中无法生长，但在添加了甲、乙、丙3种氨基酸的基础培养基中能正常生长，这表明甲、乙、丙3种氨基酸中有该突变株正常生长所必需的氨基酸，C正确；与组别①相比，在基础培养基中，若添加的氨基酸中含有丙种氨基酸，则粗糙脉孢霉突变株都能正常生长，但在只添加甲、乙2种氨基酸的基础培养基中无法生长，说明该突变株为氨基酸丙缺陷型，D错误。
2.B　根据题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，若要筛选出该内生菌，应该从未感染香蕉枯萎病的植株上采样，A正确。要筛选内生菌，同时防止样品表面杂菌对实验结果的影响，需要对样品进行消毒，用无菌水冲洗样品表面，收集冲洗液，对冲洗液进行无菌检测，B错误。稀释涂布平板法可用于分离微生物，将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离能获得内生菌的单菌落，C正确。要想判断内生菌对病原菌的抗性效果，需要比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小，D正确。
3.D　由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。
4.D　不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
5.D　为防止杂菌感染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌处理，对实验操作者的双手进行消毒处理，A正确；纯化培养时，为防止污染培养基和水分蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，B正确；微生物计数时在同一稀释度下，应至少需要对3个菌落数目在30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确；使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。
6.（1）用菌落计数法计数时，只有活菌被统计，且两个或多个细胞可能连在一起形成一个菌落；用显微镜直接计数法计数时，不能区分死菌和活菌，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和　（2）5×103　（3）灭菌，以防止杂菌污染　避免杀死菌种　（4）A　活细菌减少量最大且减少得最快
解析：（1）用菌落计数法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故活菌统计值比实际值小；用显微镜直接计数法计数时，不能区分死菌和活菌，故测定的细菌数量往往大于实际的活菌数，因此使用显微镜直接计数法计数的结果比菌落计数法计数的结果大。（2）100个菌落代表100个活菌，其来自200 μL（0.2 mL）稀释液，推出1 mL稀释液中大约有500个活菌，稀释液由细菌原液稀释10倍获得，进而推出细菌原液中细菌浓度为5×103个/mL。（3）将涂布器放在火焰上灼烧的目的是灭菌，以防止杂菌污染；涂布器冷却后再进行涂布的目的是避免高温杀死菌种。（4）由曲线图可以直接看出，用消毒液A处理后活细菌减少量最大且活细菌减少得最快，说明消毒液A杀菌效果最好。
真题重组练
　（1）√
（2）×　提示：血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。
（3）√
（4）×　提示：高温变性的蛋白质仍可作为微生物的氮源，可以用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。
（5）√
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第54讲　
微生物的培养技术及应用
高中总复习·生物
课程标准
1. 阐明在发酵工程中防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的前提。
2. 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污
染的技术。
3. 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
4. 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的
常用方法。
5. 概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用
方法。
1. 破考点·抓必备
2. 研真题·扣教材
3. 验收效·提能力
目录
Contents
01
破考点·抓必备
梳理归纳， 巩固基本知识
考点一　微生物的基本培养技术
1. 培养基的配制
（1）培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的
供其生长繁殖的营养基质。
（2）种类及用途
（3）营养组成
①一般都含有 、 、 和无机盐等营养物质。
②需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
水　
碳源　
氮源　
微生物 对培养基的需求
乳酸菌 添加
霉菌 将培养基调至 性
　细菌 将培养基调至 性
厌氧微生物 提供 的条件
维生素　
酸　
中性或弱碱　
无氧　
提醒 ①牛肉膏、蛋白胨提供的主要营养物质有氮源、碳源、维生素等，牛
肉膏还可以提供磷酸盐。
②可通过培养基中碳源、氮源类型判断培养对象类型。如培养基中无有机
碳源，则培养物为自养生物；若培养基中无有机氮源，则培养物一般为固
氮微生物。
2. 无菌技术
（1）目的：获得纯净的微生物培养物。
（2）关键：防止 。
杂菌污染　
（3）常用方法
【教材拾遗】 （选择性必修3 P10相关信息）生物消毒法是指利用生物或
其代谢物除去环境中部分微生物的方法。
3. 微生物的纯培养
（1）概念辨析
（2）酵母菌的纯培养操作步骤
提醒 ①平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿
盖上的水珠落入培养基，造成污染。
②倒平板整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
（3）平板划线法操作步骤
提醒 培养基中微生物数量过多或成片可能的原因
①菌液浓度过高。
②培养过程中被杂菌污染。
③利用接种环划线时，每次划线前未灼烧接种环灭菌。
1. （选择性必修3 P9正文）微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可
以形成肉眼可见的菌落。 （　√　）
2. （选择性必修3 P10正文）在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性
或弱碱性。 （　×　）
3. （选择性必修3 P10正文）为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热
快速挑取菌落。 （　×　）
提示：接种环灼烧灭菌后，应冷却后再挑取菌落，以免高温杀死菌种。
√
×
×
4. （选择性必修3 P10正文）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进
行清洁和灭菌。 （　×　）
提示：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
5. （选择性必修3 P12～13探究·实践）倒平板时，应将打开的皿盖放到一
边，以免培养基溅到皿盖上。 （　×　）
提示：倒平板时，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将
锥形瓶中的培养基（10～20 mL）倒入培养皿，立即盖上培养皿的皿盖，
不能完全打开皿盖。
6. （选择性必修3 P12～13探究·实践）培养酵母菌时，可将接种后的平板
和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。
（　√　）
×
×
√
1. （2025·河北高三联考）下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是（　　）
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4
含量 10 g 10 g 2 g
成分 伊红 亚甲基蓝 蒸馏水
含量 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A. 从物理性质看该培养基属于固体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基
B. 该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C. 该培养基缺少提供无机盐的物质
D. 该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
√
解析：　该培养基成分中不含琼脂，不是固体培养基，A错误；培养基成
分中的K2HPO4为其提供无机盐，C错误；培养基调节合适的pH后需要灭菌
后才能接种使用，D错误。
2. （2025·辽宁沈阳高三期末）在做微生物实验时，为了防止杂菌污染，需要做好消毒和灭菌工作。下表中有关消毒和灭菌方法的使用，错误的是（　　）
选项 材料或器具 方法
A 水源 氯气消毒
B 培养皿 干热灭菌
C 牛奶 高压蒸汽灭菌
D 涂布器 灼烧灭菌
√
解析：　可用氯气对水源进行消毒，A正确；培养皿可在干热灭菌箱中160～170 ℃灭菌1～2 h，B正确；培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，牛奶一般用巴氏消毒法进行消毒，C错误；涂布器需采用灼烧灭菌的方法，冷却后才能进行涂布操作，D正确。
3. （2025·河北邢台高三月考）如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步
骤，下列相关叙述错误的是（　　）
A. 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒处理
B. 步骤①倒平板操作过程中，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口
的缝隙，防止周围环境中杂菌的污染
C. 步骤③应多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D. 步骤③划线结束后在培养皿皿盖上做好标注，培养皿需要倒置培养
√
解析：　步骤①倒平板操作过程中，用左手的拇指和食指将培养皿打开
一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即
盖上培养皿的皿盖，防止周围环境中杂菌的污染，B正确；步骤③应多个
方向划线，划三至五条平行线，注意不要将最后一区的划线与第一区相
连，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落，C正确；步骤③划线结束
后应在皿底上做好标注，D错误。
题后归纳
平板划线操作的注意事项
（1）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（2）第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生
物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来
的菌落。
（3）划线时最后一次划线不要与第一次划线相连。
（4）划线时力度大小要适当，避免用力过大将培养基划破。
（5）操作第一步即取菌种之前以及每次划线之前都需要将接种环进行火
焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的不同：
4. （2025·安徽安庆高三联考）在生产、生活和科研实践中，经常通过消
毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述，错误的是（　　）
A. 玻璃和金属材质等实验器具可放入干热灭菌箱中干热灭菌
B. 接种环在接种前后，均需在酒精灯的火焰上进行灼烧消毒
C. 没有将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽将影响培养基的灭菌效果
D. 适量喷洒苯酚同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果
√
解析：　在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以放入干热灭菌箱
中进行干热灭菌，一些金属材质的实验器具也可以灼烧灭菌，A正确；为
了防止杂菌污染和感染操作者，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌
（不是消毒），B错误；若未将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽，会因达
不到规定温度而影响灭菌的效果，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭
空间常采用紫外线照射消毒，适量喷洒苯酚同时配合紫外线照射可提高对
接种室的消毒效果，D正确。
考点二　微生物的选择培养和计数
1. 微生物的选择培养
（1）选择培养基
（2）稀释涂布平板法
（3）培养观察
待涂布的菌液被培养基 后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培
养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离
的 。
吸收　
单菌落　
2. 微生物的数量测定
提醒 ①每隔一定的时间（如24 h）统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定
时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落数目。
②当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。稀释涂
布平板法统计的菌落数目比活菌实际数目少。
3. 活动：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）实验原理
（2）操作步骤
（3）实验结果分析与评价
1. （选择性必修3 P16正文）选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。
（　×　）
2. （选择性必修3 P18正文）菌液的稀释度足够高时，培养基表面会获得
单菌落。 （　√　）
3. （选择性必修3 P20概念检测2）稀释涂布平板法计数时，平板上的一个
菌落就是一个细菌。 （　×　）
4. （选择性必修3 P18正文）利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计
的菌落数就是活菌的实际数。 （　×　）
提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落，故稀
释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
×
√
×
×
5. （选择性必修3 P18相关信息）利用显微镜直接计数法统计的细菌数量
就是活菌的数量。 （　×　）
提示：显微镜直接计数法不能区分细菌的死活，因此统计的结果一般是活
菌数和死菌数的总和。
6. （选择性必修3 P20拓展应用2）纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的
透明圈越大，说明该类纤维素分解菌分解纤维素的能力越强。
（　√　）
×
√
1. （2023·广东高考10题）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽
毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和
选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是
（　　）
A. a点时取样、尿素氮源培养基
B. b点时取样、角蛋白氮源培养基
C. b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D. c点时取样、角蛋白氮源培养基
√
解析：　由图可知，随着堆肥时间的延长，堆肥温度先升高后保持稳
定，a点时堆肥温度最低，c点时堆肥温度最高。该实验的目的是筛选能高
效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，应该用以角蛋白为唯一氮
源的培养基进行筛选培养，且应该在高温条件下取样，即c点时取样，D符
合题意。
2. （2025·福建福州高三质检）某研究小组用马铃薯琼脂培养基对新酿米
酒中的酵母菌进行初步分离，结果如图所示，下列叙述正确的是（　　）
A. 图a中下一次划线总是从上一次划线的首端开始
B. 配制马铃薯琼脂培养基时，其pH需要调节到中性
C. 浸泡在酒精中消毒的涂布器使用前需要在火焰上灼烧
D. 图a、图b的方法都可以实现对酵母菌的分离和计数
√
解析：　图a的接种方法为平板划线法，下一次划线总是从上一次划线的
末端开始，起到逐级稀释菌种的目的，A错误；配制马铃薯琼脂培养基用
于培养酵母菌时，其pH需要调节到酸性，B错误；涂布器需要酒精浸泡再
放在酒精灯火焰上灼烧灭菌，以防止杂菌污染，C正确；图a（平板划线
法）、图b（稀释涂布平板法）的方法都可以实现对酵母菌的分离，但图a
平板划线法不能用于计数，D错误。
题后归纳
两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续
划线 ①一系列的梯度稀释；②
涂布平板操作
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌
进行分离 可以计数，可以观察菌落
特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个
平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基
表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
3. （2025·河北唐山高三一模）为了从土壤中筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，研究人员利用土壤浸出液进行了如图所示操作。下列说法错误的是（　　）
A. 用稀释涂布平板法或平板划线法将土壤浸出液接种在X培养基上
B. 菌落①可能是硝化细菌，因不能产生淀粉酶所以无透明圈
C. X培养基是含有淀粉和抗生素的固体培养基，Y培养基是不含琼脂的液体培养基
D. 图中降解淀粉最高效的是菌落⑤，可根据菌落特征初步判断微生物类型
√
解析：　根据X培养基上形成的菌落分布特征可知，将含目的菌的土壤浸出液接种在X培养基上采用的是稀释涂布平板法，A错误；菌落①周围无透明圈，说明其不能降解淀粉，可能是硝化细菌，因不能产生淀粉酶所以无透明圈，B正确；实验目的是筛选对抗生素有抗性、能高效降解淀粉的微生物，可知X培养基上含有淀粉和抗生素，Y培养基用于将筛选到的目的菌扩大培养，为不含琼脂的液体培养基，C正确；碘液遇淀粉会变蓝，淀粉被分解，形成透明圈，题图中菌落⑤的透明圈最大，说明菌落⑤降解淀粉的能力最强，不同菌落的特征不同，因此可根据菌落特征初步判断微生物类型，D正确。
02
研真题·扣教材
探究分析， 培养核心技能
1. （2024·海南高考12题）某小组为检测1株粗糙脉孢霉突变株的氨基酸缺陷类型，在相同培养温度和时间的条件下进行实验，结果见表。下列有关叙述错误的是（）
组别 培养条件 实验结果
① 基础培养基 无法生长
② 基础培养基＋甲、乙、丙3种氨基酸 正常生长
③ 基础培养基＋甲、乙2种氨基酸 无法生长
④ 基础培养基＋甲、丙2种氨基酸 正常生长
⑤ 基础培养基＋乙、丙2种氨基酸 正常生长
A. 组别①是②③④⑤的对照组
B. 培养温度和时间属于无关变量
C. ①②结果表明，甲、乙、丙3种氨基酸中有该突变株正常生长所必需的氨基酸
D. ①～⑤结果表明，该突变株为氨基酸甲缺陷型
√
解析：　由表可知，除了组别①之外，其他组别的基础培养基中都添加
了氨基酸，因此组别①是②③④⑤的对照组，A正确；由题意表中信息可
知，实验的自变量为培养条件，各组别的培养温度和时间均相同，说明培
养温度和时间均属于无关变量，B正确；由①②结果可知：粗糙脉孢霉突
变株在基础培养基中无法生长，但在添加了甲、乙、丙3种氨基酸的基础
培养基中能正常生长，这表明甲、乙、丙3种氨基酸中有该突变株正常生
长所必需的氨基酸，C正确；与组别①相比，在基础培养基中，若添加的
氨基酸中含有丙种氨基酸，则粗糙脉孢霉突变株都能正常生长，但在只添
加甲、乙2种氨基酸的基础培养基中无法生长，说明该突变株为氨基酸丙
缺陷型，D错误。
2. （2024·黑吉辽高考19题改编）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是（　　）
A. 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感染植株上采集样品
B. 将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C. 将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D. 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
√
解析：　根据题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，若要筛选出该内生菌，应该从未感染香蕉枯萎病的植株上采样，A正确。要筛选内生菌，同时防止样品表面杂菌对实验结果的影响，需要对样品进行消毒，用无菌水冲洗样品表面，收集冲洗液，对冲洗液进行无菌检测，B错误。稀释涂布平板法可用于分离微生物，将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离能获得内生菌的单菌落，C正确。要想判断内生菌对病原菌的抗性效果，需要比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小，D正确。
3. （2024·湖南高考6题）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下
列操作正确的是（　　）
A. ①②⑤⑥ B. ③④⑥⑦
C. ①②⑦⑧ D. ①③④⑤
√
解析：　由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能
将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线
不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。
4. （2023·山东高考15题）平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确
的是（　　）
A. 不含氮源的平板不能用于微生物培养
B. 平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C. 接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D. 利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
√
解析：　不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布
器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，
不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行
灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分
解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获
得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生
长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
溯源教材
（1）培养基的配方不同，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物
质。　（见选择性必修3 P10正文）
（2）将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂
布。　（见选择性必修3 P17图1－7）
（3）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。　
（见选择性必修3 P13正文）
（4）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源
的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。　（见选择性必修
3 P18探究·实践）
5. （2023·辽宁高考9题）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面
的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并
检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m3）。下列叙述错误的是（　　）
A. 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B. 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C. 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D. 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
√
解析：　为防止杂菌感染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样
器进行灭菌处理，对实验操作者的双手进行消毒处理，A正确；纯化培养
时，为防止污染培养基和水分蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培
养，B正确；微生物计数时在同一稀释度下，应至少需要对3个菌落数目在
30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确；使用稀释涂布平
板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起
时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。
6. （2024·全国甲卷37题，节选）合理使用消毒液有
助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、
B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。
回答下列问题。
（1）该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细
菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是


。
用菌落计数法计
数时，只有活菌被统计，且两个或多个细胞可能连在一起形成一个菌落；
用显微镜直接计数法计数时，不能区分死菌和活菌，统计的结果一般是活
菌数和死菌数的总和
解析：用菌落计数法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故活菌统计值比实际值小；用显微镜直接计数法计数时，不能区分死菌和活菌，故测定的细菌数量往往大于实际的活菌数，因此使用显微镜直接计数法计数的结果比菌落计数法计数的结果大。
（2）该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌
液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算
细菌原液中细菌浓度为 个/mL。
解析：100个菌落代表100个活菌，其来自200 μL（0.2 mL）稀释液，推出1 mL稀释液中大约有500个活菌，稀释液由细菌原液稀释10倍获得，进而推出细菌原液中细菌浓度为5×103个/mL。
5×103
（3）菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼
烧的目的是 ，冷却的目的是 。
解析：将涂布器放在火焰上灼烧的目的是灭菌，以防止杂菌污染；涂布器冷却后再进行涂布的目的是避免高温杀死菌种。
灭菌，以防止杂菌污染
避免杀死菌种
（4）据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是
（答出2点即可）。
解析： 由曲线图可以直接看出，用消毒
液A处理后活细菌减少量最大且活细菌减少得
最快，说明消毒液A杀菌效果最好。
A
活细菌减少
量最大且减少得最快
（1）从试管取菌种前，先在火焰旁拔棉塞，再将试管口迅速通过火焰以
灭菌。　（2024·江苏高考） （　√　）
（2）血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测
定。　（2023·江苏高考） （　×　）
提示：血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。
（3）某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮
源。　（2022·江苏高考） （　√　）
√
×
√
（4）为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行
灭菌。　（2022·湖北高考） （　×　）
提示：高温变性的蛋白质仍可作为微生物的氮源，可以用湿热灭菌法对牛
肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。
（5）稀释涂布平板法既可分离菌株，又可用于计数。　（2024·贵州高
考） （　√　）
×
√
03
验收效·提能力
跟踪训练，检验学习效果
一、选择题
1. （2025·重庆联考）防止杂菌污染，获得纯净的培养物，是研究和应用
微生物的前提。下列叙述错误的是（　　）
A. 实验室里可用紫外线或化学药物对物体表面或空气进行消毒
B. 实验室里不可吃东西，离开时一定要洗手以防被微生物感染
C. 接种环、接种针等用具应在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
D. 使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
解析：　接种环、接种针等用具应在酒精灯火焰的外焰部位灼烧灭菌，C
错误。
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√
2. （2025·福建南平高三联考）下列关于微生物纯培养的叙述，错误的是
（　　）
A. 倒平板操作应等培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行
B. 微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
C. 用平板划线法和稀释涂布平板法都能在固体培养基上得到单菌落
D. 涂布平板时应先将培养皿盖置于实验操作台上
√
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解析：　平板划线法通过连续划线操作可得到单菌落，稀释涂布平板法
在稀释倍数足够高的情况下，可通过将稀释液涂布在培养基上获得单菌
落，即平板划线法和稀释涂布平板法都能在固体培养基上得到单菌落，C
正确；涂布平板时不能完全打开培养皿，将皿盖置于实验操作台上，应在
火焰附近将培养皿打开一条缝隙，D错误。
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3. （2025·福建宁德五校联合检测）为加速我国北方冬春季秸秆原位还田
的腐化过程，研究人员以冻牛粪为材料筛选出耐低温（10 ℃）的纤维素降
解菌。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 选用冻牛粪为材料与其富含纤维素及含耐低温微生物有关
B. 初筛菌种前，要利用固体培养基在37 ℃条件下扩大培养目标菌种
C. 用于筛选的培养基是加入刚果红染料的牛肉膏蛋白胨培养基
D. 应选择菌落直径与周围透明圈直径比值大的菌落进行纯化
√
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解析：　冻牛粪中富含纤维素，有很多微生物，冻牛粪因温度低，其内
的微生物是耐低温微生物，故选用冻牛粪为材料筛选耐低温的纤维素降解
菌，A正确；初筛菌种前，要利用液体培养基在37 ℃ 条件下扩大培养目标
菌种，B错误；用于筛选的培养基是以纤维素为唯一碳源的固体培养基，
加入的刚果红染料起鉴别作用，C错误；由于刚果红染料与纤维素形成红
色复合物，因此会出现以纤维素降解菌为中心的透明圈，菌落直径与周围
透明圈直径比值越小，菌株分解纤维素的能力越强，故应选择菌落直径与
周围透明圈直径比值小的菌落进行纯化，D错误。
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4. （2025·山东淄博模拟）从土壤中分离某种微生物的培养基配方如图，
该培养基中，果胶被刚果红染成红色。将土壤稀释液接种在该培养基上，
培养一段时间后，平板上出现多个周围有透明圈的菌落。下列分析错误的
是（　　）
A. 该培养基可用于分离产果胶酶的微生物
B. 培养基配方中的X应为琼脂
C. KH2PO4和Na2HPO4能维持培养基的pH
D. 周围出现透明圈的菌落全部为同一种微生物的克隆
√
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解析：　该培养基的唯一碳源为果胶，能够生长的细菌是能分解果胶的
细菌，因此该培养基可用于分离产果胶酶的微生物，A正确；该平板培养
基为固体培养基，琼脂为凝固剂，因此培养基配方中的X应为琼脂，B正
确；KH2PO4、Na2HPO4在提供无机盐的同时还能维持培养基pH稳定，C正
确；能产生果胶酶的微生物不止一种，通常情况下，用此培养基筛选出来
的微生物种类不一定相同，D错误。
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5. （2025·山东济宁模拟）耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实
用性。嗜热菌可以在高温环境中生存，其产生的淀粉酶最适温度较高。筛
选能产生耐高温淀粉酶的嗜热菌过程如图1所示，其中Ⅰ号培养基用碘液处
理的结果如图2所示。下列叙述正确的是（　　）
A. 图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
B. 倒平板后对培养皿进行高压蒸汽灭菌
C. 淀粉是图2所示固体培养基的唯一碳源
D. 甲、乙试管中均为选择培养基
√
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解析：　淀粉与碘液反应呈现蓝色，能分解淀粉的嗜热菌在培养基上生
长时可释放淀粉酶，分解培养基中的淀粉，故周围不显蓝色的菌落含有所
需菌种，A正确；倒平板时培养皿和培养基都已灭菌处理，因此倒平板后
不需要对培养皿再进行高压蒸汽灭菌，B错误；据题图2可知，培养基上出
现周围显蓝色的菌落和周围不显蓝色的菌落，因此淀粉可能不是题图2所
示固体培养基的唯一碳源，C错误；题图1中①过程是梯度稀释，②过程是
接种，因此甲、乙试管主要是对嗜热菌样品进行稀释，不具备选择作用，
不属于选择培养基，D错误。
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6. （2025·广东湛江模拟）自生固氮菌
是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研
人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和
固氮能力测定的研究，部分实验流程如图所示。已知步骤④获得的3个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是（　）
A. 步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B. 步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C. 1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D. 所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
√
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解析：　步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到
无菌水中，A错误；由题图观察可知，步骤④平板中的菌落分布均匀，故
步骤④所用的接种工具是涂布器，接种方法是稀释涂布平板法，B错误；1
g土壤中平均自生固氮菌数约为（90＋95＋100）/3÷0.1×104＝9.5×106
（个），C正确；本实验需要分离的自生固氮菌可以利用空气中的氮气作
为氮源，故所用培养基中不能加入氮源，D错误。
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7. （2025·江苏南京、盐城模拟）为了
解病原微生物对四种抗生素的敏感程
度，某研究小组进行了相关药敏实验，
图1为部分实验器材。将含有相同浓度
的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②③
B. 图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C. 图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D. 不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
√
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解析：　为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中①酒精灯（操作需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌）、③培养基和④涂布器，②为接种环（接种工具），是平板划线法接种时需要使用的接种工具，用平板划线法不能获得长满测试菌的平板，A错误；图2中Ⅱ处透明圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误。
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8. （2025·山东日照模拟）三糖铁培养基（TSI）含有牛肉膏、蛋白胨、糖
类（乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10∶10∶1）、酚红（在酸性条件下呈
黄色、碱性条件下呈红色）等成分。TSI琼脂试验法通过观察肠杆菌科细
菌对三种糖的分解产生酸（少量的酸能被空气缓慢氧化）量的多少来鉴别
其种类。操作过程是：用接种针挑取待测菌落后，刺入斜面TSI内，后缓
慢抽出接种针，在斜面上进行“之”字划线。下列分析错误的是（　　）
A. 牛肉膏可为细菌提供氮源和维生素等
B. 穿刺和划线的过程需严格控制杂菌污染
C. 若培养基中底层与斜面均呈黄色，推测细菌只能分解乳糖
D. 若底层呈黄色、斜面先呈黄色后变红，推测细菌可能只分解葡萄糖
√
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解析：　牛肉膏可为细菌提供碳源、氮源、磷酸盐和维生素等，A正确；本实验通过TSI琼脂试验法，观察肠杆菌科细菌对三种糖的分解产生酸（少量的酸能被空气缓慢氧化）量的多少来鉴别其种类，故穿刺和划线的过程需严格控制杂菌污染，B正确；由于酚红在酸性条件下呈黄色、碱性条件下呈红色，若培养基的中底层与斜面均呈黄色，说明细菌产酸的量多，推测细菌也可能分解乳糖、蔗糖和葡萄糖，或分解含量较多的乳糖和蔗糖（或其中之一），C错误；若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，因培养基中葡萄糖的含量较少，其产酸的量也较少，斜面上所生成的少量酸被空气缓慢氧化，使斜面由黄色变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所产生的酸一时不能被空气氧化而仍保持黄色。故若底层呈黄色、斜面先呈黄色后变红，推测细菌可能只分解葡萄糖，D正确。
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二、非选择题
9. （2025·江苏镇江联考）我国卫生部门规定饮用水标准是1 mL自来水中
细菌总数不超过100个（37 ℃培养24 h），1 000 mL自来水中大肠杆菌菌落
数不能超过3个（37 ℃培养48 h）。水中大肠杆菌的含量常采用伊红—亚
甲蓝琼脂培养基进行检测，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色且
带有金属光泽。某校生物兴趣小组开展校园桶装纯净水微生物含量检测活
动，请回答问题：
（1）检测饮用水中的细菌，需要配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉
膏和蛋白胨可以为细菌生长提供
（至少写出两点）等营养物质。从物理状态角度分析，此培养基属
于 培养基。
碳源、氮源、磷酸盐、维生素
固体
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解析： 该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨，其中蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，故蛋白胨可以为微生物的生长提供碳源、氮源和维生素等营养物质；该培养基含有琼脂，故属于固体培养基。
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（2）某同学分别向3个培养基中各加入1 mL，未经稀释的待测水样，涂布
均匀后置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，结果如图1所示。检测时使用
的接种量为1 mL而不是0.1 mL，其理由是
。
解析：微生物计数时，应统计30～300之间的菌落，由于0.1 mL水样
中细菌数目较少，经培养后平板菌落数可能达不到30个，故检测时使用的
接种量为1 mL而不是0.1 mL。
0.1 mL水样中细菌数目较少，
经培养后平板菌落数可能达不到30个
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（3）如图2为用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目的流程示意图，请完成
下表。
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实验步骤
的目的 简要操作过程
①
将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15 min，共煮沸
三次
过滤细菌 装置安装好后，向漏斗内加入1 000 mL水样，加盖抽滤
冲洗漏斗壁 再向漏斗内加等量② 继续抽滤
③
用无菌镊子取滤膜，将其紧贴在伊红—亚甲蓝琼脂平板上，然后将平板④ ，37 ℃培养48小时
统计大肠杆菌菌落数 选取⑤ 的菌落进行计数，统计结果为2个
滤膜
消毒
无菌水
培养大肠
杆菌
倒置
呈深紫色且带有金属光泽
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解析： ①“滤膜法”测定饮用水中大肠杆菌的数量时首先应进行
滤膜消毒，以保持实验过程中的无菌环境，主要是通过加热煮沸的方
法进行；②冲洗漏斗壁时向漏斗内加等量无菌水继续抽滤；③培养大
肠杆菌时可加入伊红—亚甲蓝作为指示剂，两者反应呈深紫色且带有
金属光泽；④培养基培养时应将其倒置；⑤选取呈深紫色且带有金属
光泽的菌落进行计数。
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（4）综合（2）（3）测定结果，你认为所测桶装纯净水的微生物含
量 （填“能”或“不能”）达到饮用水卫生标准，理由是

（写出两点）。
解析： 分析题意可知，我国卫生部门规定饮用水标准是1 mL自来水
中细菌总数不超过100个（37 ℃培养24 h），1 000 mL自来水中大肠杆菌菌
落数不能超过3个（37 ℃培养48 h），故该同学认为所测桶装纯净水的微
生物含量已达到了饮用水卫生标准，是因为：1 mL 水样中细菌总数约为
（96＋106＋92）÷3＝98个，没有超过100个；1 000 mL水样中大肠杆菌菌
落数为2个，没有超过3个。
能
1 mL水
样中细菌总数约为98个，没有超过100个；1 000 mL水样中大肠杆菌为2
个，没有超过3个
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谢谢观看！

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