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第课时　微生物的培养技术及应用
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。6.酵母菌的纯培养。7.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
一　培养基
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2．营养成分
(1)一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等。
(2)需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加维生素
霉菌 一般将培养基调至酸性
细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性
厌氧微生物 提供无氧的条件
3.分类
(1)按物理状态分类
培养基种类 特点 用途
液体培养基 不含凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
固体培养基 含凝固剂(如琼脂) 微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
(2)按化学成分分类
培养基种类 特点 用途
天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 微生物的分类、鉴定
(3)按功能分类
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质或缺少某些物质 依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或 化学药品 产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定分解尿素的细菌
二　无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(1)目的：获得纯净的微生物培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
2．消毒和灭菌比较
手段 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的 物理、化学或 生物等方法　 杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 牛奶等不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具、一些金属用具等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
湿热灭菌 法(高压蒸汽灭菌法) 培养基及容器等
3.其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
三　微生物的纯培养
1．相关概念
2．酵母菌的纯培养过程
特别提醒　
1．平板冷凝后，要将平板倒置的原因是：因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2．在培养酵母菌时，取一个灭菌后的未接种的平板，同时培养，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
3．平板划线法
(1)原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
(2)过程
(3)培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将平板倒置，放入培养箱中培养。
(4)注意事项
①灼烧接种环的目的
②接种环灼烧后，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区不要与第一区相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
四　微生物选择培养和计数
1．微生物的选择培养
(1)选择培养基
(2)稀释涂布平板法
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。操作步骤：
②涂布平板操作步骤
(3)培养平板
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养。
特别提醒　两种微生物纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 操作相对简单 可以计数
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同 点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都可在培养基表面形成单菌落，可用于微生物的分离；都可用于观察菌落特征
2．微生物的数量测定
方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
作用 分离微生物；统计活菌数目　　 统计活菌数和死菌数的总和
计数 标准 ①为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板计数；②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
结果 往往比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 一般比实际活菌数值大
五　实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
(2)利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．流程
3．实验结果分析与评价
4．注意事项
(1)将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
(2)要按照无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
(3)本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(4)本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
1．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(×)
2．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(×)
3．利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。(×)
4．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(×)
5．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。(×)
6．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。(×)
7．某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。(√)
8．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。(×)
9．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH。(√)
10．配制固体培养基，加入的琼脂可以充当微生物的营养物质。(×)
11．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。(×)
12．只有湿热灭菌才能杀死微生物的芽孢和孢子。(×)
13．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌。(√)
14．从前一次划线的末端划线时，每次划线前和划线后接种环都要进行灼烧灭菌。(√)
15．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际值偏小。(√)
16．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法。(√)
17．根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型。(√)
18．在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。(×)
19．无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(×)
20．培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。(√)
考向一　围绕培养基的成分、作用和配制，考查理解能力
[例1]　如表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是(　　)
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O
含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g
成分 FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素
含量 0.01 g 30 g 1 L 0.1万单位
A.依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3
D．若用该培养基培养纤维素分解菌，只需除去(CH2O)，再添加纤维素即可
答案：D
解析：由培养基配方可知，该培养基中不含凝固剂，故依物理性质划分，该培养基属于液体培养基，A正确；由培养基的原料可知，(CH2O)属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，酵母菌是异养型微生物，B正确；碳源是指能为微生物提供碳元素的物质，氮源是指能为微生物提供氮元素的物质，结合培养基配方可知，培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3，C正确；该培养基中含有青霉素，细菌对青霉素敏感，青霉素会抑制细菌的生长，因此若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去(CH2O)和青霉素，再添加纤维素，D错误。
考向二　结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
[例2]　如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是(　　)
A．此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B．图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C．每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D．培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
答案：A
解析：根据菌落的生长状态可知，此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②，②处可见单菌落，A正确，B错误；第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，除第一次划线外，每次划线前灼烧接种环的目的都是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，C错误；培养基中的琼脂是凝固剂，不能为细菌提供碳源，D错误。
考向三　结合微生物的选择培养，考查科学思维能力
[例3]　(2023·河北，12)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，下列相关实验设计错误的是(　　)
A．从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌
B．平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境
C．对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定
D．检测目的菌株对消化道环境的耐受力
答案：B
解析：酸奶和泡菜都是利用乳酸菌的发酵原理制作的，内含大量乳酸菌，可从中采样分离获得乳酸菌，A正确；平板倒置的目的是防止皿盖中的冷凝水落入培养基，造成污染，B错误；实验的目的是筛选获得能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，故需对目的菌株进行消化道环境耐受力的检测和胆固醇降解能力的测定，C、D正确。
[例4]　橄榄油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄榄油平板透明圈法”筛选获得两株产脂肪酶的菌株X和Y，检测结果如表。下列相关叙述不正确的是(　　)
酶活性(U·mL－1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A.可将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选
B．培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源
C．图中透明圈大小仅与酶活性的大小成正比
D．以上两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外
答案：C
解析：可利用稀释涂布平板法将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选，A正确；橄榄油的主要成分是甘油三酯，要筛选产脂肪酶的菌株X和Y，则培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源，B正确；图中透明圈大小不仅与酶活性的大小有关，也和产酶量相关，C错误；两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外，对培养基中的橄榄油进行分解，D正确。
[例5]　土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态(如磷酸钙等难溶态，在水中呈白色沉淀)存在，溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷。
(1)磷是植物生长发育的必需元素，可组成________等化合物。(填出2种即可)
(2)从土壤中筛选溶磷菌的一般步骤如下：
溶磷菌的分离：依次配备浓度为10－3、10－4、10－5的土壤稀释液，分别取0.1 mL均匀涂布于含难溶磷的固体培养基上培养2 d。待菌落长出后挑取________________的菌落，于基础培养基上采用________法进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，对照组的培养基接入________菌悬液，5 d后测定培养液中可溶性磷含量。若接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为________。选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)将适量目的菌接入已灭菌的含难溶磷的液体培养基中培养，每天取样测定溶磷量和pH变化情况，结果见下图。
①结果表明目的菌分解难溶磷的能力呈现________的趋势。
②根据培养液的pH变化情况，可对目的菌的解磷原理作出的推测是______________________
____________________________________。
(4)请预期该溶磷菌在农业生产方面可能的应用：____________________________。
答案：(1)核酸(DNA、RNA)、ATP、磷脂、NADPH(任意2种即可)
(2)具有透明解磷圈　平板划线　等量灭活　a－b
(3)①先升高后降低　②解磷菌通过产生酸性代谢产物分解难溶性磷
(4)制成微生物菌肥促进植物对磷元素的吸收
解析：(1)土壤中的磷元素被植物直接吸收后，可用于组成核酸、磷脂、ATP、NADPH等化合物。
(2)溶磷菌的分离：据题意，土壤中的磷大部分以磷酸钙等难溶态存在，在水中呈白色沉淀，故加入含难溶磷的固体培养基浑浊不透明，而溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷，故一段时间后，可挑选平板上形成透明溶磷圈的菌落，即为筛选出的溶磷菌。纯化常用平板划线法和稀释涂布平板法，如平板划线法将挑选出的菌落于基础培养基上采用连续划线进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，为成功筛选到能高效溶解难溶磷的溶磷菌，对照组的培养基接入等量灭活的菌悬液，以作比较。若5 d后接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为a－b。差值越大，说明菌体溶磷量越大，选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)据图可知，自变量为培养时间，因变量为溶磷量和pH。①据图可知，在1～4天内溶磷量随时间增加而增多，即分解能力升高，第4天后，溶磷量开始减少，即分解能力降低，但比最开始仍更强。②据图可知，在加入溶磷菌后溶液pH迅速降低，溶磷量开始增加，随着pH回升，溶磷量就开始降低，据此推测溶磷菌可能通过产生酸性代谢产物分解难溶性磷。
(4)据题意，土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态如磷酸钙等难溶态存在，而溶磷菌可将难溶态磷分解为可被植物直接利用的可溶性磷，故可将其制成微生物菌肥促进植物对磷元素的吸收。
1．选择培养基四种常见制备方法或实例 (1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分) (2)改变培养基的营养成分 (3)利用培养基中的“特定化学成分”进行分离 (4)通过某些“特殊环境”进行分离 2．几种微生物的营养和能量来源 微生物碳源氮源能源蓝细菌CO2NH、NO等光能硝化细菌CO2NH3NH3的氧化根瘤菌糖类等有机物N2有机物酵母菌糖类等有机物蛋白质等有机物
考向四　围绕微生物的分离和计数，考查科学探究能力
[例6]　自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。相关叙述正确的是(　　)
A．步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B．步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D．所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
答案：C
解析：由图可知，步骤②振荡20 min的目的是让样品中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；由图可知，步骤④获得菌落分散在平板上，利用的是稀释涂布平板法，使用的接种工具是涂布器，使用前需要灼烧灭菌，B错误；1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)÷3÷0.1×104＝9.5×106(个)，C正确；由题干信息可知，该实验的目的是分离土壤中自生固氮菌和固氮能力的测定，自生固氮菌能够利用空气中的氮作为氮源，故培养基中不需要加入氮源，D错误。
[例7]　(2025·八省联考四川)根据抗菌特性可将抗菌剂分为抑菌剂和杀菌剂，其中抑菌剂可抑制细菌生长，杀菌剂能杀死细菌。为分析抗菌剂的抗菌特性，有人将不同抗菌剂分别添加到培养的细菌悬液中，用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法测定细菌数量，评估细菌的生长情况，变化趋势曲线如图所示(不考虑抗菌剂残留对计数的影响)，其中曲线1为仅添加无菌水的实验结果。下列叙述错误的是(　　)
A．添加抑菌剂后，通过稀释涂布平板法进行计数，统计的细菌数量会保持不变
B．若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数
C．曲线2代表添加抑菌剂后的细菌数量，曲线3代表添加杀菌剂后的细菌数量
D．若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均下降，推测细菌出现裂解而死亡
答案：A
解析：添加抑菌剂后，抑菌剂会抑制细菌的生长，细菌的正常死亡仍会发生，且通过稀释涂布平板法进行计数时会存在误差等因素，统计的细菌数量不会保持不变，A错误；稀释涂布平板法计数的是活菌，而显微镜直接计数法统计的是死菌和活菌的总数，若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数，B正确；稀释涂布平板法计数的是活菌，而显微镜直接计数法统计的是死菌和活菌的总数，若细菌裂解死亡，则死细菌无法被计数，因此若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均下降，推测细菌出现裂解而死亡，D正确。
课时作业
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
难度 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★★ ★★ ★★ ★★★ ★★
对点 平板划线法 微生物的选择培养 土壤中微生物种类探究 消毒方法探究实验 特定微生物筛选 微生物的选择培养与计数 营养缺陷型微生物培养 微生物的选择培养与计数 微生物的选择培养 微生物的选择培养 微生物的选择培养(影印法) 微生物培养与计数 微生物培养相关实验探究 微生物的选择培养实验探究
1．如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是(　　)
A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
C．步骤②应多次划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤③划线结束后在培养皿盖上做好标注
答案：C
解析：图中步骤①是倒平板，步骤②是进行平板划线，步骤③是培养。对实验操作的空间、操作者的衣着和手需要进行消毒处理，A错误；倒完平板后立即盖上培养皿盖，待培养基冷却凝固后将培养皿倒过来放置，B错误；图中操作结束后需在培养皿底标注菌种及接种日期等信息，而不是在培养皿盖上做标注，D错误。
2．(2023·浙江1月，19)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是(　　)
A．培养基pH需偏碱性
B．泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C．需在无氧条件下培养
D．分离得到的微生物均为乳酸菌
答案：C
解析：培养乳酸菌的培养基应偏酸性，A错误；划线接种时，泡菜汁无需进行多次稀释，B错误；乳酸菌是厌氧菌，需在无氧条件下培养，C正确；泡菜汁中还有酵母菌等，因此分离得到的微生物不只有乳酸菌，D错误。
3．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　)
A．采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B．培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
答案：C
解析：牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的菌体分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
4．根据国家标准(GB 19645－2010)每毫升合格的巴氏杀菌乳中细菌总数不得超过50000个。某兴趣小组进行了新鲜牛奶最合适的消毒温度和时间组合的探究，相关实验操作不合理的是(　　)
A．为了使计数更标准，通常要用同一稀释度下的牛奶接种3个平板，重复计数
B．将等量的新鲜牛奶分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒温水浴锅中处理适宜的时间
C．对处理后的牛奶利用平板划线法进行接种后，在37 ℃下培养24 h，然后计数
D．统计培养基上全部菌落数，不一定以菌落数最少组的处理温度作为最适消毒温度
答案：C
解析：为了使计数更标准，通常要用同一稀释度下的牛奶接种3个平板，重复计数，然后取平均值，这样可以减小误差，A合理；该实验的自变量是温度，将等量的新鲜牛奶分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒温水浴锅中处理适宜的时间，B合理；对处理后的牛奶进行梯度稀释后，利用涂布法接种平板并在37 ℃下培养24 h，然后计数，C不合理；由于温度过高会影响蛋白质的结构，进而破坏牛奶中的营养成分，所以菌落数最少的组对应的温度不一定是最适的消毒温度，最适的消毒温度应保证每毫升巴氏杀菌乳中细菌总数不得超过50000个，同时还需保证牛奶的营养价值不被破坏，D合理。
5．菜籽粕含有35%～45%蛋白质，是畜禽饲料的重要原料，但其中的单宁等限制了菜籽粕的应用。研究者将不同菌种接种到菜籽粕与麸皮制成的固体培养基中发酵48 h，测定菜籽粕中单宁的含量，结果如下图。
下列相关叙述错误的是(　　)
A．菜籽粕与麸皮可为微生物提供碳源和氮源
B．避免发酵过程受到杂菌污染，培养基添加适量抗生素
C．黑曲霉菌对单宁的去除效果最为理想
D．对照组应为不接种微生物的固体培养基
答案：B
6．研究人员从青藏高原班戈桥地区的土壤中分离到一株能利用原油为碳源生长的细菌(BGQ－6)，该菌对原油的总降解率为74.14%，且对直链烷烃、支链烷烃、环烷烃和芳香烃等60种烃类有较高的降解率。下列说法错误的是(　　)
A．利用添加石油的普通培养基能从被石油污染的土壤中筛选BGQ－6
B．可采用稀释涂布平板法对BGQ－6进行计数
C．一般选择菌落数为30～300的平板进行BGQ－6菌落计数
D．由单一的BGQ－6繁殖所获得的微生物群体称为BGQ－6纯培养物
答案：A
解析：利用以石油为唯一碳源的选择培养基能从被石油污染的土壤中筛选出BGQ－6，A错误；对微生物进行计数时，应该选择的接种方法是稀释涂布平板法，B正确；为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，C正确；由单一的BGQ－6繁殖所获得的微生物群体称为BGQ－6纯培养物，D正确。
7．将两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌(菌株a和b)进行如图所示实验。下列叙述正确的是(　　)
A．实验中接种至基本培养基的方法是平板划线法
B．基本培养基上出现的少量菌落一定是单菌落
C．基本培养基中包含菌株a和b所需的特殊营养物质
D．菌株a和b需要的特殊营养物质有所不同
答案：D
解析：根据菌株a和菌株b混合后菌落的分布情况可知，接种至基本培养基时宜用稀释涂布平板法，A错误；基本培养基出现的少量菌落不一定都为单菌落，也有可能是重叠的菌落，B错误；单独培养菌株a和b时，培养基中均无法生长菌落，而当菌株a和b共同培养时，培养基中有少量菌落产生，因此培养基中无法提供它们单独生长所需的特殊营养物质，C错误；菌株a单独培养和菌株b单独培养均不能生长，菌株a和b混合培养能生长，说明它们能够相互提供相应的特殊营养物质，因此它们所需要的特殊营养物质有所不同，D正确。
8．开展深海微生物研究对于开发海洋资源具有重要意义。我国科考船采集了深海冷泉附近的沉积物样品，从中分离微生物，并进一步研究了其生物学特性，具体过程如图所示，图中Ⅰ～Ⅴ是操作步骤。下列相关叙述错误的是(　　)
A．培养基②与培养基①相比，需要添加琼脂
B．若操作过程中以平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数相同
C．若培养基①在培养过程中通入并充满N2，则此时的培养基是选择培养基
D．Ⅴ过程可用稀释涂布平板法对微生物进行分离和计数
答案：B
解析：培养基②是固体培养基，培养基①是液体培养基，培养基②与培养基①相比，需要添加琼脂，A正确；每次划线前后均需要对接种环灼烧，接种环的灼烧次数比划线次数多一次，B错误；若培养基①在培养过程中充满N2，则此时的培养基是选择培养基，C正确；Ⅴ过程测定种群密度，可用稀释涂布平板法对微生物进行分离和计数，D正确。
9．滥用抗生素会导致“超级细菌”(对多种抗生素有高耐药性)的产生。某实验小组研究细菌产生青霉素抗性与青霉素之间的关系，过程及结果如下图。下列叙述正确的是(　　)
A．可通过提高抗生素浓度避免超级细菌的产生
B．用接种环在培养基上连续划线获得实验菌落
C．图中含青霉素的培养基的菌落周围会出现抑菌圈
D．细菌培养基在使用前、后均需经过灭菌处理
答案：D
解析：用接种环在培养基上连续划线获得单个菌落是平板划线法，图示实验菌落(分布较均匀)不是通过平板划线法获得的，是用稀释涂布平板法获得的，B错误；图示在含有青霉素的培养基中有菌落存活，说明菌体对青霉素具有抗性，菌落周围没有抑菌圈，C错误；细菌培养基在使用前灭菌是为了防止杂菌污染，使用后灭菌是为了防止污染环境和感染操作人员，D正确。
10．(2021·山东等级考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
答案：B
解析：根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标为菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。
11．氨基酸营养缺陷型菌株是野生型菌株突变后失去合成某种氨基酸的能力，只能在完全培养基或补充相应氨基酸的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。如图是获得并纯化色氨酸营养缺陷型突变株的过程，①②③④是培养基编号，甲、乙代表菌落。下列说法错误的是(　　)
A．①②是完全培养基，③是添加色氨酸的基本培养基，④是基本培养基
B．紫外线处理的目的是提高突变率，以获得色氨酸营养缺陷型菌株
C．将①置于摇床中，有利于菌体充分利用培养基中的营养物质
D．甲是色氨酸营养缺陷型菌落，可用划线法进一步纯化培养
答案：A
解析：由题图可知，野生型菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型菌株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基或补充相应氨基酸的基本培养基上生长，图中①②为完全培养基，③是基本培养基，④是添加色氨酸的基本培养基，A错误；紫外线可以提高突变率，故紫外线处理的目的是提高突变率，以获得色氨酸营养缺陷型菌株，B正确；将①置于摇床中，通过振荡，有利于菌体与营养物质充分接触，C正确；由图可知，甲在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，这说明甲是色氨酸营养缺陷型菌落，可用划线法进一步纯化培养，D正确。
12．(2025·八省联考云南)中国名茶普洱茶的主要活性成分——茶褐素，具有降脂减肥、抗氧化和提高免疫力等功能，在功能食品领域具有广阔的应用前景。研究人员在制作普洱熟茶的固体发酵过程中分离得到优势菌塔宾曲霉，其可在绿茶浸提液(富含茶多酚、可溶性糖、氨基酸、蛋白质和咖啡碱等)中生长繁殖，之后分泌胞外氧化酶催化茶多酚生成茶褐素。不同发酵温度下塔宾曲霉生成茶褐素的浓度如图。
回答下列问题：
(1)绿茶浸提液中的氨基酸和蛋白质可为塔宾曲霉生长提供的营养物质为____________。
(2)塔宾曲霉为好氧微生物，用绿茶浸提液进行液体培养时应采用________(填“静置”或“摇床”)培养。培养过程中茶褐素在发酵前两天均无显著增加的原因是______________________
______________________________________。
(3)为检测发酵1天时塔宾曲霉的数量，将发酵液稀释1×103倍后，分别取0.1 mL稀释液均匀涂布于3个培养基平板上，培养后菌落数量分别为48、45和42个，则每毫升发酵液中活菌数量为__________个。
(4)从实际生产角度出发，由图可知在第________天结束发酵即可获得较高浓度的茶褐素。为探索生产茶褐素的最适温度，需设计下一步实验，写出实验思路_______________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
答案：(1)碳源和氮源
(2)摇床　塔宾曲霉先进行生长繁殖，之后才分泌胞外氧化酶催化茶多酚生成茶褐素
(3)4.5×105
(4)6　在30～42 ℃之间设置一系列温度梯度，用同样的方式培养塔宾曲霉，并检测不同发酵温度下塔宾曲霉生成茶褐素的浓度，找到生成茶褐素的浓度最高时的温度即为生产茶褐素的最适温度
解析：(1)氨基酸和蛋白质是组成元素为C、H、O、N的有机物，可以为塔宾曲霉生长提供碳源和氮源。
(2)塔宾曲霉为好氧微生物，用绿茶浸提液进行液体培养时应采用摇床培养，可以为培养液增加溶氧量，有利于塔宾曲霉的繁殖。培养过程中前两天塔宾曲霉进行生长繁殖，之后才分泌氧化酶催化茶多酚生成茶褐素。
(3)培养后菌落数量分别为48、45和42个，平均值为(48＋45＋42)÷3＝45，发酵液稀释1×103倍后，取0.1 mL稀释液进行涂布，因此每毫升发酵液中活菌数量为45×103×10＝4.5×105个。
(4)分析题图可知，发酵效率较高的是37 ℃和42 ℃，此时发酵至第6天，结束发酵即可获得较高浓度的茶褐素。
13．链格孢菌可导致烟草赤星病的发生。研究人员在烟草根部土壤中分离纯化出芽孢杆菌L，发现其对链格孢菌有抑制作用。
(1)称取烟草根部土样加入________制成悬液，接种在________(物理性质)培养基上培养，挑取不同形态的菌落。
(2)为探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理，实验组将芽孢杆菌L接种在A1平板上，B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落，把两个培养皿对扣，菌株无接触，5 d后观察菌株生长情况，结果如图。
①将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是______________。
②对照组处理为A2平板________________________，B2平板________________________
________。
③根据实验结果推测，芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理是______________________
____________________________________。
(3)除上述原因外，研究人员认为芽孢杆菌L的发酵液中可能也存在抑制链格孢菌生长的物质。他们将芽孢杆菌L发酵液离心后，取上清液过滤，获得无菌滤液进行如下实验：
组别 实验处理 接种 检测
甲组 a 将直径为0.5 cm的链格孢菌菌落接种在平板中心，在恒温培养箱内培养 测量b，计算抑菌率
乙组 无菌水＋固体培养基
请补充完善该实验方案，a为________________________________，b为__________________
______________。
(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治，还需研究哪些问题？_______________
_________________(答出一点即可)。
答案：(1)无菌水　固体
(2)①平板划线法　②不接种微生物(接种无菌水)　中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落　③芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长
(3)无菌滤液＋固体培养基　链格孢菌的菌落直径
(4)芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量(芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期、芽孢杆菌L对烟草生长的影响等，合理即可)
解析：(2)①从A1平板上菌落的分布可看出，将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是平板划线法。②实验目的是探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理，根据实验遵循单一变量原则的要求，A1平板接种有芽孢杆菌L，则A2平板不接种微生物(接种无菌水)；B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落，则B2平板中央也应接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落。③实验组和对照组内两培养皿菌株均无接触，对照组链格孢菌菌落直径明显大于实验组，据此可推测芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长。
(3)实验的目的是证明芽孢杆菌L的发酵液中可能也存在抑制链格孢菌生长的物质，根据实验遵循单一变量原则的要求，a组应添加无菌滤液＋固体培养基。因变量为抑菌率，则实验中要测量甲、乙组中链格孢菌的菌落直径，以计算抑菌率。
(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治，还要考虑芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量、芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期、芽孢杆菌L对烟草生长的影响等。
14．(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成______________________(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_______________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是____________________________________________________________。
答案：(1)石油　DNA、RNA、蛋白质
(2)N0·2n
(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
(4)A　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
解析：(1)培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和水等营养物质，从组成培养基的物质所含化学元素可知，只有石油含有碳元素。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
(3)由表格分析可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路即可。
(4)由表格分析可知，在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力大于B菌株，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解石油，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株。
1第课时　微生物的培养技术及应用
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。6.酵母菌的纯培养。7.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
一　培养基
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2．营养成分
(1)一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等。
(2)需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加维生素
霉菌 一般将培养基调至酸性
细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性
厌氧微生物 提供无氧的条件
3.分类
(1)按物理状态分类
培养基种类 特点 用途
液体培养基 不含凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
固体培养基 含凝固剂(如琼脂) 微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
(2)按化学成分分类
培养基种类 特点 用途
天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 微生物的分类、鉴定
(3)按功能分类
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质或缺少某些物质 依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计 从众多微生物中分离所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或 化学药品 产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定分解尿素的细菌
二　无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(1)目的：获得纯净的微生物培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
2．消毒和灭菌比较
手段 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的 物理、化学或 生物等方法　 杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 牛奶等不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具、一些金属用具等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
湿热灭菌 法(高压蒸汽灭菌法) 培养基及容器等
3.其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
三　微生物的纯培养
1．相关概念
2．酵母菌的纯培养过程
特别提醒　
1．平板冷凝后，要将平板倒置的原因是：因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2．在培养酵母菌时，取一个灭菌后的未接种的平板，同时培养，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
3．平板划线法
(1)原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
(2)过程
(3)培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将平板倒置，放入培养箱中培养。
(4)注意事项
①灼烧接种环的目的
②接种环灼烧后，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区不要与第一区相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
四　微生物选择培养和计数
1．微生物的选择培养
(1)选择培养基
(2)稀释涂布平板法
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。操作步骤：
②涂布平板操作步骤
(3)培养平板
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养。
特别提醒　两种微生物纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 操作相对简单 可以计数
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同 点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都可在培养基表面形成单菌落，可用于微生物的分离；都可用于观察菌落特征
2．微生物的数量测定
方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
作用 分离微生物；统计活菌数目　　 统计活菌数和死菌数的总和
计数 标准 ①为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板计数；②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
结果 往往比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 一般比实际活菌数值大
五　实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
(2)利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．流程
3．实验结果分析与评价
4．注意事项
(1)将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
(2)要按照无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
(3)本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(4)本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
1．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。( )
2．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。( )
3．利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。( )
4．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。( )
5．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。( )
6．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。( )
7．某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。( )
8．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。( )
9．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH。( )
10．配制固体培养基，加入的琼脂可以充当微生物的营养物质。( )
11．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。( )
12．只有湿热灭菌才能杀死微生物的芽孢和孢子。( )
13．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌。( )
14．从前一次划线的末端划线时，每次划线前和划线后接种环都要进行灼烧灭菌。( )
15．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际值偏小。( )
16．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法。( )
17．根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型。( )
18．在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。( )
19．无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。( )
20．培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。( )
考向一　围绕培养基的成分、作用和配制，考查理解能力
[例1]　如表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是(　　)
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O
含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g
成分 FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素
含量 0.01 g 30 g 1 L 0.1万单位
A.依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3
D．若用该培养基培养纤维素分解菌，只需除去(CH2O)，再添加纤维素即可
考向二　结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
[例2]　如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是(　　)
A．此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B．图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C．每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D．培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
考向三　结合微生物的选择培养，考查科学思维能力
[例3]　(2023·河北，12)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，下列相关实验设计错误的是(　　)
A．从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌
B．平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境
C．对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定
D．检测目的菌株对消化道环境的耐受力
[例4]　橄榄油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄榄油平板透明圈法”筛选获得两株产脂肪酶的菌株X和Y，检测结果如表。下列相关叙述不正确的是(　　)
酶活性(U·mL－1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A.可将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选
B．培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源
C．图中透明圈大小仅与酶活性的大小成正比
D．以上两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外
[例5]　土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态(如磷酸钙等难溶态，在水中呈白色沉淀)存在，溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷。
(1)磷是植物生长发育的必需元素，可组成________等化合物。(填出2种即可)
(2)从土壤中筛选溶磷菌的一般步骤如下：
溶磷菌的分离：依次配备浓度为10－3、10－4、10－5的土壤稀释液，分别取0.1 mL均匀涂布于含难溶磷的固体培养基上培养2 d。待菌落长出后挑取________________的菌落，于基础培养基上采用________法进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，对照组的培养基接入________菌悬液，5 d后测定培养液中可溶性磷含量。若接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为________。选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)将适量目的菌接入已灭菌的含难溶磷的液体培养基中培养，每天取样测定溶磷量和pH变化情况，结果见下图。
①结果表明目的菌分解难溶磷的能力呈现________的趋势。
②根据培养液的pH变化情况，可对目的菌的解磷原理作出的推测是______________________
____________________________________。
(4)请预期该溶磷菌在农业生产方面可能的应用：____________________________。
考向四　围绕微生物的分离和计数，考查科学探究能力
[例6]　自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。相关叙述正确的是(　　)
A．步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B．步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D．所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
[例7]　(2025·八省联考四川)根据抗菌特性可将抗菌剂分为抑菌剂和杀菌剂，其中抑菌剂可抑制细菌生长，杀菌剂能杀死细菌。为分析抗菌剂的抗菌特性，有人将不同抗菌剂分别添加到培养的细菌悬液中，用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法测定细菌数量，评估细菌的生长情况，变化趋势曲线如图所示(不考虑抗菌剂残留对计数的影响)，其中曲线1为仅添加无菌水的实验结果。下列叙述错误的是(　　)
A．添加抑菌剂后，通过稀释涂布平板法进行计数，统计的细菌数量会保持不变
B．若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数
C．曲线2代表添加抑菌剂后的细菌数量，曲线3代表添加杀菌剂后的细菌数量
D．若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均下降，推测细菌出现裂解而死亡
答案及解析
1．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(×)
2．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(×)
3．利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。(×)
4．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(×)
5．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。(×)
6．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。(×)
7．某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。(√)
8．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。(×)
9．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH。(√)
10．配制固体培养基，加入的琼脂可以充当微生物的营养物质。(×)
11．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。(×)
12．只有湿热灭菌才能杀死微生物的芽孢和孢子。(×)
13．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌。(√)
14．从前一次划线的末端划线时，每次划线前和划线后接种环都要进行灼烧灭菌。(√)
15．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际值偏小。(√)
16．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法。(√)
17．根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型。(√)
18．在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。(×)
19．无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(×)
20．培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。(√)
考向一　围绕培养基的成分、作用和配制，考查理解能力
[例1]　如表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是(　　)
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O
含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g
成分 FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素
含量 0.01 g 30 g 1 L 0.1万单位
A.依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3
D．若用该培养基培养纤维素分解菌，只需除去(CH2O)，再添加纤维素即可
答案：D
解析：由培养基配方可知，该培养基中不含凝固剂，故依物理性质划分，该培养基属于液体培养基，A正确；由培养基的原料可知，(CH2O)属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，酵母菌是异养型微生物，B正确；碳源是指能为微生物提供碳元素的物质，氮源是指能为微生物提供氮元素的物质，结合培养基配方可知，培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3，C正确；该培养基中含有青霉素，细菌对青霉素敏感，青霉素会抑制细菌的生长，因此若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去(CH2O)和青霉素，再添加纤维素，D错误。
考向二　结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
[例2]　如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是(　　)
A．此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B．图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C．每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D．培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
答案：A
解析：根据菌落的生长状态可知，此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②，②处可见单菌落，A正确，B错误；第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，除第一次划线外，每次划线前灼烧接种环的目的都是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，C错误；培养基中的琼脂是凝固剂，不能为细菌提供碳源，D错误。
考向三　结合微生物的选择培养，考查科学思维能力
[例3]　(2023·河北，12)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，下列相关实验设计错误的是(　　)
A．从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌
B．平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境
C．对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定
D．检测目的菌株对消化道环境的耐受力
答案：B
解析：酸奶和泡菜都是利用乳酸菌的发酵原理制作的，内含大量乳酸菌，可从中采样分离获得乳酸菌，A正确；平板倒置的目的是防止皿盖中的冷凝水落入培养基，造成污染，B错误；实验的目的是筛选获得能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，故需对目的菌株进行消化道环境耐受力的检测和胆固醇降解能力的测定，C、D正确。
[例4]　橄榄油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄榄油平板透明圈法”筛选获得两株产脂肪酶的菌株X和Y，检测结果如表。下列相关叙述不正确的是(　　)
酶活性(U·mL－1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A.可将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选
B．培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源
C．图中透明圈大小仅与酶活性的大小成正比
D．以上两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外
答案：C
解析：可利用稀释涂布平板法将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选，A正确；橄榄油的主要成分是甘油三酯，要筛选产脂肪酶的菌株X和Y，则培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源，B正确；图中透明圈大小不仅与酶活性的大小有关，也和产酶量相关，C错误；两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外，对培养基中的橄榄油进行分解，D正确。
[例5]　土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态(如磷酸钙等难溶态，在水中呈白色沉淀)存在，溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷。
(1)磷是植物生长发育的必需元素，可组成________等化合物。(填出2种即可)
(2)从土壤中筛选溶磷菌的一般步骤如下：
溶磷菌的分离：依次配备浓度为10－3、10－4、10－5的土壤稀释液，分别取0.1 mL均匀涂布于含难溶磷的固体培养基上培养2 d。待菌落长出后挑取________________的菌落，于基础培养基上采用________法进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，对照组的培养基接入________菌悬液，5 d后测定培养液中可溶性磷含量。若接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为________。选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)将适量目的菌接入已灭菌的含难溶磷的液体培养基中培养，每天取样测定溶磷量和pH变化情况，结果见下图。
①结果表明目的菌分解难溶磷的能力呈现________的趋势。
②根据培养液的pH变化情况，可对目的菌的解磷原理作出的推测是______________________
____________________________________。
(4)请预期该溶磷菌在农业生产方面可能的应用：____________________________。
答案：(1)核酸(DNA、RNA)、ATP、磷脂、NADPH(任意2种即可)
(2)具有透明解磷圈　平板划线　等量灭活　a－b
(3)①先升高后降低　②解磷菌通过产生酸性代谢产物分解难溶性磷
(4)制成微生物菌肥促进植物对磷元素的吸收
解析：(1)土壤中的磷元素被植物直接吸收后，可用于组成核酸、磷脂、ATP、NADPH等化合物。
(2)溶磷菌的分离：据题意，土壤中的磷大部分以磷酸钙等难溶态存在，在水中呈白色沉淀，故加入含难溶磷的固体培养基浑浊不透明，而溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷，故一段时间后，可挑选平板上形成透明溶磷圈的菌落，即为筛选出的溶磷菌。纯化常用平板划线法和稀释涂布平板法，如平板划线法将挑选出的菌落于基础培养基上采用连续划线进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，为成功筛选到能高效溶解难溶磷的溶磷菌，对照组的培养基接入等量灭活的菌悬液，以作比较。若5 d后接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为a－b。差值越大，说明菌体溶磷量越大，选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)据图可知，自变量为培养时间，因变量为溶磷量和pH。①据图可知，在1～4天内溶磷量随时间增加而增多，即分解能力升高，第4天后，溶磷量开始减少，即分解能力降低，但比最开始仍更强。②据图可知，在加入溶磷菌后溶液pH迅速降低，溶磷量开始增加，随着pH回升，溶磷量就开始降低，据此推测溶磷菌可能通过产生酸性代谢产物分解难溶性磷。
(4)据题意，土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态如磷酸钙等难溶态存在，而溶磷菌可将难溶态磷分解为可被植物直接利用的可溶性磷，故可将其制成微生物菌肥促进植物对磷元素的吸收。
1．选择培养基四种常见制备方法或实例 (1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分) (2)改变培养基的营养成分 (3)利用培养基中的“特定化学成分”进行分离 (4)通过某些“特殊环境”进行分离 2．几种微生物的营养和能量来源 微生物碳源氮源能源蓝细菌CO2NH、NO等光能硝化细菌CO2NH3NH3的氧化根瘤菌糖类等有机物N2有机物酵母菌糖类等有机物蛋白质等有机物
考向四　围绕微生物的分离和计数，考查科学探究能力
[例6]　自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。相关叙述正确的是(　　)
A．步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B．步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D．所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
答案：C
解析：由图可知，步骤②振荡20 min的目的是让样品中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；由图可知，步骤④获得菌落分散在平板上，利用的是稀释涂布平板法，使用的接种工具是涂布器，使用前需要灼烧灭菌，B错误；1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)÷3÷0.1×104＝9.5×106(个)，C正确；由题干信息可知，该实验的目的是分离土壤中自生固氮菌和固氮能力的测定，自生固氮菌能够利用空气中的氮作为氮源，故培养基中不需要加入氮源，D错误。
[例7]　(2025·八省联考四川)根据抗菌特性可将抗菌剂分为抑菌剂和杀菌剂，其中抑菌剂可抑制细菌生长，杀菌剂能杀死细菌。为分析抗菌剂的抗菌特性，有人将不同抗菌剂分别添加到培养的细菌悬液中，用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法测定细菌数量，评估细菌的生长情况，变化趋势曲线如图所示(不考虑抗菌剂残留对计数的影响)，其中曲线1为仅添加无菌水的实验结果。下列叙述错误的是(　　)
A．添加抑菌剂后，通过稀释涂布平板法进行计数，统计的细菌数量会保持不变
B．若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数
C．曲线2代表添加抑菌剂后的细菌数量，曲线3代表添加杀菌剂后的细菌数量
D．若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均下降，推测细菌出现裂解而死亡
答案：A
解析：添加抑菌剂后，抑菌剂会抑制细菌的生长，细菌的正常死亡仍会发生，且通过稀释涂布平板法进行计数时会存在误差等因素，统计的细菌数量不会保持不变，A错误；稀释涂布平板法计数的是活菌，而显微镜直接计数法统计的是死菌和活菌的总数，若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数，B正确；稀释涂布平板法计数的是活菌，而显微镜直接计数法统计的是死菌和活菌的总数，若细菌裂解死亡，则死细菌无法被计数，因此若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均下降，推测细菌出现裂解而死亡，D正确。
1(共92张PPT)
　　　　　　　　　　　　　
选择性必修3　生物技术与工程
第十单元　生物技术与工程
小单元1　发酵工程
第2课时　微生物的培养技术及应用
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。6.酵母菌的纯培养。7.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
目录
CONTENTS
02
经典考题训练
01
知识自主梳理
03
课时作业
01
知识自主梳理
一　培养基
1．概念：人们按照微生物对___________的不同需求，配制出供其生长繁殖的___________，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2．营养成分
(1)一般都含有_________________和无机盐等。
营养物质
营养基质
水、碳源、氮源
(2)需要满足微生物生长对______、特殊营养物质以及_____的需求。
pH
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加__________
霉菌 一般将培养基调至_____性
细菌 一般将培养基调至______________性
厌氧微生物 提供______的条件
O2
维生素
酸
中性或弱碱
无氧
培养基种类 特点 用途
_____培养基 不含凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
_____培养基 含凝固剂(如琼脂) 微生物分离、_____，活菌计数，菌种保藏
3.分类
(1)按物理状态分类
液体
固体
鉴定
(2)按化学成分分类
培养基种类 特点 用途
天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 微生物的分类、鉴定
(3)按功能分类
分离
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 培养基中加入某些化学物质或缺少某些物质 依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计 从众多微生物中_____所需的微生物 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基 培养基中加入某种指示剂或化学药品 产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定分解尿素的细菌
二　无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有______________的方法。
(1)目的：获得______的微生物培养物。
(2)关键：防止_______污染。
防止杂菌污染
纯净
杂菌
手段 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为_____的______________________等方法　 杀死物体表面或内部__________ 煮沸消毒法 日常用品
____________法 牛奶等不耐高温的液体
化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 ______的理化方法 杀死物体内外____________，包括________ ____ ____________法 接种工具、一些金属用具等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
____________法 (高压蒸汽灭菌法) 培养基及容器等
2．消毒和灭菌比较
温和
物理、化学或生物
一部分微生物
巴氏消毒
强烈
所有的微生物
芽孢和孢子
灼烧灭菌
湿热灭菌
3.其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与_______________接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在_____________附近进行。
周围的物品
酒精灯火焰
三　微生物的纯培养
1．相关概念
固体培养基
一定形态结构
2．酵母菌的纯培养过程
15~20 g琼脂
湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌法）
干热灭菌法
酒精灯火焰
灼烧灭菌
平板划线法
恒温培养箱
28
特别提醒　
1．平板冷凝后，要将平板倒置的原因是：因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2．在培养酵母菌时，取一个灭菌后的未接种的平板，同时培养，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。
3．平板划线法
(1)原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
(2)过程
灼烧
火焰旁
火焰
棉塞
平行线
第一次
第一次
(3)培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将平板_____，放入培养箱中培养。
(4)注意事项
①灼烧接种环的目的
倒置
②接种环灼烧后，待其冷却后才能伸入菌液，以免___________________。
③第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐_______，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
④划线时最后一区不要与_________相连。
⑤划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
温度太高杀死菌种
减少
第一区
四　微生物选择培养和计数
1．微生物的选择培养
(1)选择培养基
抑制或阻止
尿素
氮源
细菌
高温
(2)稀释涂布平板法
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量_____，细胞得以分散。操作步骤：
减少
②涂布平板操作步骤
(3)培养平板
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板______，放入恒温培养箱中培养。
倒置
特别提醒　两种微生物纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 操作相对简单 可以计数
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都可在培养基表面形成单菌落，可用于微生物的分离；都可用于观察菌落特征 方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
作用 分离微生物；统计_____数目　　 统计___________________的总和
计数 标准 ①为保证结果准确，一般选择菌落数为_______的平板计数；②在同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______ 利用特定的___________________
_______，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
结果 往往比实际值偏_____，原因是_________ ____________________________________________________________ 一般比实际活菌数值_____
2．微生物的数量测定
活菌
活菌数和死菌数
30～300
3
平均值
细菌计数板或血细胞计数板
小
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
大
五　实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
(1)只有能合成_______的微生物才能分解尿素。
(2)利用以_______为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
脲酶
尿素
2．流程
3~8
30~300
涂布平板
30~37
菌落数目稳定
3．实验结果分析与评价
无
有
少于
30~300
4．注意事项
(1)将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
(2)要按照无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要______。操作完成后，一定要洗手。
(3)本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前___________。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和________________________等。
(4)本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
灭菌
做好标记
平板上培养样品的稀释度
1．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(　　　)
2．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(　　　)
3．利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。
(　　)
4．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。
(　　　)
5．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。(　　　)
6．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。(　　　)
×
×
×
×
×
×
7．某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。(　　)
8．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。
(　　)
9．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH。(　　)
10．配制固体培养基，加入的琼脂可以充当微生物的营养物质。(　　)
11．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。
(　　)
12．只有湿热灭菌才能杀死微生物的芽孢和孢子。(　　)
13．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌。
(　　)
×
√
√
×
×
×
√
14．从前一次划线的末端划线时，每次划线前和划线后接种环都要进行灼烧灭菌。(　　)
15．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际值偏小。(　　)
16．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法。(　　)
17．根据培养基上菌落的特征可初步判断和鉴别细菌的类型。(　　)
18．在培养霉菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。(　　)
19．无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(　　)
20．培养酵母菌时，可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入适宜温度的恒温培养箱中培养24～48 h。(　　)
×
√
√
√
√
×
√
经典考题训练
02
考向一　围绕培养基的成分、作用和配制，考查理解能力
[例1]　如表为培养某种微生物
的培养基配方，下列相关叙述错误
的是(　　)
A.依物理性质划分，该培养基
属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3
D．若用该培养基培养纤维素分解菌，只需除去(CH2O)，再添加纤维素即可
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O
含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g
成分 FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素
含量 0.01 g 30 g 1 L 0.1万单位
解析：由培养基配方可知，该培养基中不含凝固剂，故依物理性质划分，该培养基属于液体培养基，A正确；由培养基的原料可知，(CH2O)属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，酵母菌是异养型微生物，B正确；碳源是指能为微生物提供碳元素的物质，氮源是指能为微生物提供氮元素的物质，结合培养基配方可知，培养基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3，C正确；该培养基中含有青霉素，细菌对青霉素敏感，青霉素会抑制细菌的生长，因此若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去(CH2O)和青霉素，再添加纤维素，D错误。
考向二　结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
[例2]　如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是
(　　)
A．此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B．图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C．每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D．培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
解析：根据菌落的生长状态可知，此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②，②处可见单菌落，A正确，B错误；第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，除第一次划线外，每次划线前灼烧接种环的目的都是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，C错误；培养基中的琼脂是凝固剂，不能为细菌提供碳源，D错误。
考向三　结合微生物的选择培养，考查科学思维能力
[例3]　(2023·河北，12)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，下列相关实验设计错误的是(　　)
A．从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌
B．平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境
C．对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定
D．检测目的菌株对消化道环境的耐受力
解析：酸奶和泡菜都是利用乳酸菌的发酵原理制作的，内含大量乳酸菌，可从中采样分离获得乳酸菌，A正确；平板倒置的目的是防止皿盖中的冷凝水落入培养基，造成污染，B错误；实验的目的是筛选获得能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，故需对目的菌株进行消化道环境耐受力的检测和胆固醇降解能力的测定，C、D正确。
[例4]　橄榄油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄榄油平板透明圈法”筛选获得两株产脂肪酶的菌株X和Y，检测结果如表。下列相关叙述不正确的是
(　　)
A.可将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选
B．培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源
C．图中透明圈大小仅与酶活性的大小成正比
D．以上两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外
酶活性(U·mL－1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
解析：可利用稀释涂布平板法将样液梯度稀释后涂布于平板进行筛选，A正确；橄榄油的主要成分是甘油三酯，要筛选产脂肪酶的菌株X和Y，则培养基中的橄榄油提供微生物生长的碳源，B正确；图中透明圈大小不仅与酶活性的大小有关，也和产酶量相关，C错误；两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外，对培养基中的橄榄油进行分解，D正确。
[例5]　土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态(如磷酸钙等难溶态，在水中呈白色沉淀)存在，溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷。
(1)磷是植物生长发育的必需元素，可组成______________________________________
______________________等化合物。(填出2种即可)
(2)从土壤中筛选溶磷菌的一般步骤如下：
溶磷菌的分离：依次配备浓度为10－3、10－4、10－5的土壤稀释液，分别取0.1 mL均匀涂布于含难溶磷的固体培养基上培养2 d。待菌落长出后挑取________________的菌落，于基础培养基上采用___________法进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，对照组的培养基接入________菌悬液，5 d后测定培养液中可溶性磷含量。若接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为________。选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　核酸(DNA、RNA)、ATP、磷脂、NADPH(任意2种即可)
具有透明解磷圈
平板划线
等量灭活
a－b
(3)将适量目的菌接入已灭菌的含难溶磷的
液体培养基中培养，每天取样测定溶磷量和pH
变化情况，结果见右图。
①结果表明目的菌分解难溶磷的能力呈现
______________的趋势。
②根据培养液的pH变化情况，可对目的菌
的解磷原理作出的推测是_______________________________________________。
(4)请预期该溶磷菌在农业生产方面可能的应用：______________________
___________________。
先升高后降低
解磷菌通过产生酸性代谢产物分解难溶性磷
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　制成微生物菌肥促进植物对磷元素的吸收
解析：(1)土壤中的磷元素被植物直接吸收后，可用于组成核酸、磷脂、ATP、NADPH等化合物。
(2)溶磷菌的分离：据题意，土壤中的磷大部分以磷酸钙等难溶态存在，在水中呈白色沉淀，故加入含难溶磷的固体培养基浑浊不透明，而溶磷菌能够把无效态的磷转化为可被直接利用的可溶性磷，故一段时间后，可挑选平板上形成透明溶磷圈的菌落，即为筛选出的溶磷菌。纯化常用平板划线法和稀释涂布平板法，如平板划线法将挑选出的菌落于基础培养基上采用连续划线进行多次纯化。
溶磷菌的筛选：将分离获得的溶磷菌分别配制成菌悬液，接入已灭菌的含难溶磷液体培养基中，为成功筛选到能高效溶解难溶磷的溶磷菌，对照组的培养基接入等量灭活的菌悬液，以作比较。若5 d后接菌培养液可溶性磷含量为a，对照组可溶性磷含量为b，则菌株溶磷量为a－b。差值越大，说明菌体溶磷量越大，选择溶磷量最大的菌种为目的菌。
(3)据图可知，自变量为培养时间，因变量为溶磷量和pH。①据图可知，在1～4天内溶磷量随时间增加而增多，即分解能力升高，第4天后，溶磷量开始减少，即分解能力降低，但比最开始仍更强。②据图可知，在加入溶磷菌后溶液pH迅速降低，溶磷量开始增加，随着pH回升，溶磷量就开始降低，据此推测溶磷菌可能通过产生酸性代谢产物分解难溶性磷。
(4)据题意，土壤中的磷大部分以难被植物吸收利用的无效态如磷酸钙等难溶态存在，而溶磷菌可将难溶态磷分解为可被植物直接利用的可溶性磷，故可将其制成微生物菌肥促进植物对磷元素的吸收。
1．选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基中的“特定化学成分”进行分离
(4)通过某些“特殊环境”进行分离
2．几种微生物的营养和能量来源
考向四　围绕微生物的分离和计数，考查科学探究能力
[例6]　自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。相关叙述正确的是(　　)
A．步骤②振荡20 min的目的是扩大菌
种数量，属于选择培养
B．步骤④使用接种环划线接种，使用
前需要灼烧灭菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D．所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
解析：由图可知，步骤②振荡20 min的目的是让样品中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；由图可知，步骤④获得菌落分散在平板上，利用的是稀释涂布平板法，使用的接种工具是涂布器，使用前需要灼烧灭菌，B错误；1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)÷3÷0.1×104＝9.5×106(个)，C正确；由题干信息可知，该实验的目的是分离土壤中自生固氮菌和固氮能力的测定，自生固氮菌能够利用空气中的氮作为氮源，故培养基中不需要加入氮源，D错误。
[例7]　(2025·八省联考四川)根据抗菌特性可将抗菌剂分为
抑菌剂和杀菌剂，其中抑菌剂可抑制细菌生长，杀菌剂能杀死
细菌。为分析抗菌剂的抗菌特性，有人将不同抗菌剂分别添加到
培养的细菌悬液中，用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法测定
细菌数量，评估细菌的生长情况，变化趋势曲线如图所示(不考
虑抗菌剂残留对计数的影响)，其中曲线1为仅添加无菌水的实
验结果。下列叙述错误的是 (　　)
A．添加抑菌剂后，通过稀释涂布平板法进行计数，统计的细菌数量会保持不变
B．若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数
C．曲线2代表添加抑菌剂后的细菌数量，曲线3代表添加杀菌剂后的细菌数量
D．若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均下降，推测细菌出现裂解而死亡
解析：添加抑菌剂后，抑菌剂会抑制细菌的生长，细菌的正常死亡仍会发生，且通过稀释涂布平板法进行计数时会存在误差等因素，统计的细菌数量不会保持不变，A错误；稀释涂布平板法计数的是活菌，而显微镜直接计数法统计的是死菌和活菌的总数，若添加某抗菌剂后两种方法计数结果为曲线2和3，其差异是由于死菌被计数，B正确；稀释涂布平板法计数的是活菌，而显微镜直接计数法统计的是死菌和活菌的总数，若细菌裂解死亡，则死细菌无法被计
数，因此若添加某抗菌剂后两种方法统计的细菌数量均
下降，推测细菌出现裂解而死亡，D正确。
课时作业
03
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
难度 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★★ ★★ ★★ ★★★ ★★
对点 平板划线法 微生物的选择培养 土壤中微生物种类探究 消毒方法探究实验 特定微生物筛选 微生物的选择培养与计数 营养缺陷型微生物培养 微生物的选择培养与计数 微生物的选择培养 微生物的选择培养 微生物的选择培养 (影印法) 微生物培养与计数 微生物培养相关实验探究 微生物的选择培养实验探究
1．如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是
(　　)
A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
C．步骤②应多次划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤③划线结束后在培养皿盖上做好标注
解析：图中步骤①是倒平板，步骤②是进行平板划线，步骤③是培养。对实验操作的空间、操作者的衣着和手需要进行消毒处理，A错误；倒完平板后立即盖上培养皿盖，待培养基冷却凝固后将培养皿倒过来放置，B错误；图中操作结束后需在培养皿底标注菌种及接种日期等信息，而不是在培养皿盖上做标注，D错误。
2．(2023·浙江1月，19)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是(　　)
A．培养基pH需偏碱性 B．泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C．需在无氧条件下培养 D．分离得到的微生物均为乳酸菌
解析：培养乳酸菌的培养基应偏酸性，A错误；划线接种时，泡菜汁无需进行多次稀释，B错误；乳酸菌是厌氧菌，需在无氧条件下培养，C正确；泡菜汁中还有酵母菌等，因此分离得到的微生物不只有乳酸菌，D错误。
3．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(　　)
A．采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B．培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C．土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D．鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
解析：牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的菌体分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
4．根据国家标准(GB 19645－2010)每毫升合格的巴氏杀菌乳中细菌总数不得超过50000个。某兴趣小组进行了新鲜牛奶最合适的消毒温度和时间组合的探究，相关实验操作不合理的是(　　)
A．为了使计数更标准，通常要用同一稀释度下的牛奶接种3个平板，重复计数
B．将等量的新鲜牛奶分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒温水浴锅中处理适宜的时间
C．对处理后的牛奶利用平板划线法进行接种后，在37 ℃下培养24 h，然后计数
D．统计培养基上全部菌落数，不一定以菌落数最少组的处理温度作为最适消毒温度
解析：为了使计数更标准，通常要用同一稀释度下的牛奶接种3个平板，重复计数，然后取平均值，这样可以减小误差，A合理；该实验的自变量是温度，将等量的新鲜牛奶分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒温水浴锅中处理适宜的时间，B合理；对处理后的牛奶进行梯度稀释后，利用涂布法接种平板并在37 ℃下培养24 h，然后计数，C不合理；由于温度过高会影响蛋白质的结构，进而破坏牛奶中的营养成分，所以菌落数最少的组对应的温度不一定是最适的消毒温度，最适的消毒温度应保证每毫升巴氏杀菌乳中细菌总数不得超过50000个，同时还需保证牛奶的营养价值不被破坏，D合理。
5．菜籽粕含有35%～45%蛋白质，是畜禽饲料的重要原料，但其中的单宁等限制了菜籽粕的应用。研究者将不同菌种接种到菜籽粕与麸皮制成的固体培养基中发酵48 h，测定菜籽粕中单宁的含量，结果如下图。
下列相关叙述错误的是(　　)
A．菜籽粕与麸皮可为微生物提供碳源和氮源
B．避免发酵过程受到杂菌污染，培养基添加
适量抗生素
C．黑曲霉菌对单宁的去除效果最为理想
D．对照组应为不接种微生物的固体培养基
6．研究人员从青藏高原班戈桥地区的土壤中分离到一株能利用原油为碳源生长的细菌(BGQ－6)，该菌对原油的总降解率为74.14%，且对直链烷烃、支链烷烃、环烷烃和芳香烃等60种烃类有较高的降解率。下列说法错误的是(　　)
A．利用添加石油的普通培养基能从被石油污染的土壤中筛选BGQ－6
B．可采用稀释涂布平板法对BGQ－6进行计数
C．一般选择菌落数为30～300的平板进行BGQ－6菌落计数
D．由单一的BGQ－6繁殖所获得的微生物群体称为BGQ－6纯培养物
解析：利用以石油为唯一碳源的选择培养基能从被石油污染的土壤中筛选出BGQ－6，A错误；对微生物进行计数时，应该选择的接种方法是稀释涂布平板法，B正确；为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，C正确；由单一的BGQ－6繁殖所获得的微生物群体称为BGQ－6纯培养物，D正确。
7．将两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌(菌株a和b)进行如图所示实验。下列叙述正确的是(　　)
A．实验中接种至基本培养基的方法是平板划线法
B．基本培养基上出现的少量菌落一定是单菌落
C．基本培养基中包含菌株a和b所需的特殊营养物质
D．菌株a和b需要的特殊营养物质有所不同
解析：根据菌株a和菌株b混合后菌落的分布情况可知，接种至基本培养基时宜用稀释涂布平板法，A错误；基本培养基出现的少量菌落不一定都为单菌落，也有可能是重叠的菌落，B错误；单独培养菌株a和b时，培养基中均无法生长菌落，而当菌株a和b共同培养时，培养基中有少量菌落产生，
因此培养基中无法提供它们单独生长所需的特殊营养
物质，C错误；菌株a单独培养和菌株b单独培养均不
能生长，菌株a和b混合培养能生长，说明它们能够相
互提供相应的特殊营养物质，因此它们所需要的特殊
营养物质有所不同，D正确。
8．开展深海微生物研究对于开发海洋
资源具有重要意义。我国科考船采集了深
海冷泉附近的沉积物样品，从中分离微生
物，并进一步研究了其生物学特性，具体
过程如图所示，图中Ⅰ～Ⅴ是操作步骤。
下列相关叙述错误的是(　　)
A．培养基②与培养基①相比，需要添加琼脂
B．若操作过程中以平板划线法纯化菌种，接种环的灼烧次数与划线次数相同
C．若培养基①在培养过程中通入并充满N2，则此时的培养基是选择培养基
D．Ⅴ过程可用稀释涂布平板法对微生物进行分离和计数
解析：培养基②是固体培养基，培养基①是液体培养基，培养基②与培养基①相比，需要添加琼脂，A正确；每次划线前后均需要对接种环灼烧，接种环的灼烧次数比划线次数多一次，B错误；若培养基①在培养过程中充满N2，则此时的培养基是选择培养基，C正确；Ⅴ过程测定种群密度，可用稀释涂布平板法对微生物进行分离和计数，D正确。
9．滥用抗生素会导致“超级细菌”(对多种抗生素有高耐药性)的产生。某实验小组研究细菌产生青霉素抗性与青霉素之间的关系，过程及结果如下图。下列叙述正确的是(　　)
A．可通过提高抗生素浓度避免超级细菌的产生
B．用接种环在培养基上连续划线获得实验菌落
C．图中含青霉素的培养基的菌落周围会出现抑菌圈
D．细菌培养基在使用前、后均需经过灭菌处理
解析：用接种环在培养基上连续划线获得单个菌落是平板划线法，图示实验菌落(分布较均匀)不是通过平板划线法获得的，是用稀释涂布平板法获得的，B错误；图示在含有青霉素的培养基中有菌落存活，说明菌体对青霉素具有抗性，菌落周围没有抑菌圈，C错误；细菌培养基在使用前灭菌是为了防止杂菌污染，使用后灭菌是为了防止污染环境和感染操作人员，D正确。
10．(2021·山东等级考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　)
A．甲菌属于解脂菌
B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源
C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比
D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
解析：根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标为菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。　
11．氨基酸营养缺陷型菌株是野生型
菌株突变后失去合成某种氨基酸的能力，
只能在完全培养基或补充相应氨基酸的基
本培养基中才能正常生长的变异菌株。如
图是获得并纯化色氨酸营养缺陷型突变株的过程，①②③④是培养基编号，甲、乙代表菌落。下列说法错误的是(　　)
A．①②是完全培养基，③是添加色氨酸的基本培养基，④是基本培养基
B．紫外线处理的目的是提高突变率，以获得色氨酸营养缺陷型菌株
C．将①置于摇床中，有利于菌体充分利用培养基中的营养物质
D．甲是色氨酸营养缺陷型菌落，可用划线法进一步纯化培养
解析：由题图可知，野生型菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型菌株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基或补充相应氨基酸的基本培养基上生长，图中①②为完全培养基，③是基本培养基，④是添加色氨酸的基本培养基，A错误；紫外线可以提高突变率，故紫外线处理的目的是提高突变率，以获得色氨酸营养缺陷型菌株，B正确；将①置于摇床中，通过振荡，有利于菌体与营养物质充分接触，C正确；由图可知，甲在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，这说明甲是色氨酸营养缺陷型菌落，可用划线法进一步纯化培养，D正确。
12．(2025·八省联考云南)中国名茶普洱茶的主要活性成分——茶褐素，具有降脂减肥、抗氧化和提高免疫力等功能，在功能食品领域具有广阔的应用前景。研究人员在制作普洱熟茶的固体发酵过程中分离得到优势菌塔宾曲霉，其可在绿茶浸提液(富含茶多酚、可溶性糖、氨基酸、蛋白质和咖啡碱等)中生长繁殖，之后分泌胞外氧化酶催化茶多酚生成茶褐素。不同发酵温度下塔宾曲霉生成茶褐素的浓度如图。
回答下列问题：
(1)绿茶浸提液中的氨基酸和蛋白质可为塔宾曲霉
生长提供的营养物质为____________。
碳源和氮源
(2)塔宾曲霉为好氧微生物，用绿茶浸提液进行液体
培养时应采用________(填“静置”或“摇床”)培养。培养过
程中茶褐素在发酵前两天均无显著增加的原因是________
___________________________________________________
_________。
(3)为检测发酵1天时塔宾曲霉的数量，将发酵液稀释1×103倍后，分别取0.1 mL稀释液均匀涂布于3个培养基平板上，培养后菌落数量分别为48、45和42个，则每毫升发酵液中活菌数量为__________个。
摇床
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　塔宾曲霉先进行生长繁殖，之后才分泌胞外氧化酶催化茶多酚生成茶褐素
4.5×105
(4)从实际生产角度出发，由图可知在第________天结束发酵即可获得较高浓度的茶褐素。为探索生产茶褐素的最适温度，需设计下一步实验，写出实验思路_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
6
在30～42 ℃之间设置一系列温度梯度，用同样的方式培养塔宾曲霉，并检测不同发酵温度下塔宾曲霉生成茶褐素的浓度，找到生成茶褐素的浓度最高时的温度即为生产茶褐素的最适温度
解析：(1)氨基酸和蛋白质是组成元素为C、H、O、N的有机物，可以为塔宾曲霉生长提供碳源和氮源。
(2)塔宾曲霉为好氧微生物，用绿茶浸提液进行液体培养时应采用摇床培养，可以为培养液增加溶氧量，有利于塔宾曲霉的繁殖。培养过程中前两天塔宾曲霉进行生长繁殖，之后才分泌氧化酶催化茶多酚生成茶褐素。
(3)培养后菌落数量分别为48、45和42个，平均值为(48＋45＋42)÷3＝45，发酵液稀释1×103倍后，取0.1 mL稀释液进行涂布，因此每毫升发酵液中活菌数量为45×103×10＝4.5×105个。
(4)分析题图可知，发酵效率较高的是37 ℃和42 ℃，此时发酵至第6天，结束发酵即可获得较高浓度的茶褐素。
13．链格孢菌可导致烟草赤星病的发生。
研究人员在烟草根部土壤中分离纯化出芽孢
杆菌L，发现其对链格孢菌有抑制作用。
(1)称取烟草根部土样加入________制
成悬液，接种在________(物理性质)培养基上培养，挑取不同形态的菌落。
(2)为探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理，实验组将芽孢杆菌L接种在A1平板上，B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落，把两个培养皿对扣，菌株无接触，5 d后观察菌株生长情况，结果如图。
①将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是______________。
②对照组处理为A2平板______________________________，B2平板________________________________________。
③根据实验结果推测，芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理是__________________________________________________________。
无菌水
固体
平板划线法
不接种微生物(接种无菌水)
中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落
芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长
(3)除上述原因外，研究人员认为芽孢杆菌L的发酵液中可能也存在抑制链格孢菌生长的物质。他们将芽孢杆菌L发酵液离心后，取上清液过滤，获得无菌滤液进行如下实验：
请补充完善该实验方案，a为____________________，b为_________________。
(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治，还需研究哪些问题？___________________________________________________________________________________________________(答出一点即可)。
无菌滤液＋固体培养基
组别 实验处理 接种 检测
甲组 a 将直径为0.5 cm的链格孢菌菌落接种在平板中心，在恒温培养箱内培养 测量b，计算抑菌率
乙组 无菌水＋固体培养基 链格孢菌的菌落直径
芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量(芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期、芽孢杆菌L对烟草生长的影响等，合理即可)
解析：(2)①从A1平板上菌落的分布可看出，将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是平板划线法。②实验目的是探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理，根据实验遵循单一变量原则的要求，A1平板接种有芽孢杆菌L，则A2平板不接种微生物(接种无菌水)；B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落，则B2平板中央也应接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落。③实验组和对照组内两培养皿菌株均无接触，对照组链格孢菌菌落直径明显大于实验组，据此可推测芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长。
(3)实验的目的是证明芽孢杆菌L的发酵液中可能也存在抑制链格孢菌生长的物质，根据实验遵循单一变量原则的要求，a组应添加无菌滤液＋固体培养基。因变量为抑菌率，则实验中要测量甲、乙组中链格孢菌的菌落直径，以计算抑菌率。
(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治，还要考虑芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量、芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期、芽孢杆菌L对烟草生长的影响等。
14．(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成______________________
(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。
石油
DNA、RNA、蛋白质
N0·2n
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用
步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示
(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，
“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是_____，理由是___________________________________________
___________________________________。
在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
菌株 透明圈大小 平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
A
　　　　　　　　　　　　　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
解析：(1)培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和水等营养物质，从组成培养基的物质所含化学元素可知，只有石油含有碳元素。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
(3)由表格分析可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路即可。
(4)由表格分析可知，在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力大于B菌株，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解石油，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株。

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