资源简介

课时作业
1．大肠杆菌的质粒——环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是(　　)
A．①②③共同组成核糖核苷酸
B．质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C．DNA连接酶会使化学键④重新连接
D．若某种限制酶在质粒上只有一个限制酶切割位点，则质粒被切为两个片段
2．(2023·重庆，12)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶
3．农杆菌Ti质粒上的T DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理
B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置
4．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占15/16
5．科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T DNA的加工和转移，下列叙述正确的是(　　)
A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B．利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C．Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D．利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
6．科学家将常年生活在寒带的比目鱼中的抗冻基因转移到西红柿里，培育出了抗冻番茄，这种西红柿可以在冬季或较寒冷的地区种植，使得人们一年四季都能吃到西红柿。如图为含抗冻基因的外源DNA和质粒DNA的有关信息，其中EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，下列叙述中错误的是(　　)
A．构建基因表达载体时，应用BamHⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒
B．通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在
C．导入抗冻基因的番茄细胞能在含四环素和卡那霉素的培养基上形成愈伤组织
D．可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株
7．(2023·广东，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
8．XhoⅠ和SalⅠ是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述，错误的是(　　)
A．图1中两种限制酶识别的脱氧核苷酸序列不同
B．泳道①是使用SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果
C．图2中电泳移动速度最慢的是泳道②最上方的那条带
D．同时使用SalⅠ和XhoⅠ处理，酶切产物的电泳结果为7条条带
9．为使玉米获得抗除草剂性状，需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是(　　)
A．筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选成功导入表达载体的农杆菌
B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织
C．报告基因在玉米的愈伤组织和农杆菌细胞中均能正确表达
D．诱导幼胚脱分化形成愈伤组织的培养基需添加植物激素
10．如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　)
A．PCR扩增A时可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费
11．(2025·八省联考山西、陕西、宁夏、青海)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径，其基因表达载体如图a，基因1、2和3为该途径的必需基因，基因大小分别为2650 bp、1240 bp和3476 bp。回答下列问题。
(1)图a中，构建基因表达载体时用到的酶是______________，片段X是________。
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种________________________的生理状态，导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落，分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图b。据图可知，PCR时选用的引物对是图a中的______________，选择该引物对进行鉴定的原因是__________________________________________________________；菌落B中未检测到目标条带，其原因是________________________________。
(3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响，请针对其中任一因素，探究其对产物Z产量的影响，写出简要的实验思路___________________________
_________________________________________________________________________________________________________。
12．(2025·八省联考四川)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。
(1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的肽链含有________个氨基酸。通过PCR分别扩增Y基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同的有________(填标号)。
a．模板 b．引物
c．DNA聚合酶 d．反应缓冲液
(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由是__________________________________________________________。
(3)据图步骤一分析，为确保Y－GFP基因插入载体后完整表达，在构建重组基因表达载体时不能选择EcoRⅠ限制酶，理由是_________________________________________________
___________________________________。
(4)为检测Y－GFP蛋白的激酶活性，用Y－GFP蛋白、A蛋白和ATP组合实验，四组实验的条件及电泳结果如图步骤二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别。若Y－GFP蛋白有激酶活性，则后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是________泳道(从泳道①～④中选填序号)，从Y－GFP蛋白功能角度分析，理由是______________________________________________________________________，利用表达的具有绿色荧光的Y－GFP蛋白还可开展的实验有________________(答出1个即可)。
13．诱导干细胞定向分化具有重要的医学价值。基因Pdx1在胰腺发育阶段的胰腺组织中大量表达，对胰腺定向发育和成熟有重要作用。研究者将Pdx1基因构建到含Tet诱导型启动子的基因表达载体(GV347)中，转入小鼠胚胎干细胞(ES)，以期实现Pdx1基因在胚胎干细胞中的定时和定量表达。回答下列问题：
(1)培养ES时，应将ES置于含有95%________和5% CO2的混合气体的CO2培养箱中培养。CO2的主要作用是______________________。
(2)提取胰腺细胞的总mRNA，经过________过程可获得cDNA。为特异性的扩增Pdx1基因的cDNA，引物设计的依据是________________________________。为使基因表达载体能成功表达Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白，应将________(填“含”或“不含”)终止子的cDNA插入到GV347的限制酶切割位点(如下图)。
注：Tet诱导的启动子是在四环素存在条件下，可以激活基因表达。嘌呤霉素可抑制翻译过程。
(3)将重组载体导入ES，然后将细胞置于含有________的培养基内培养，以筛选出成功导入载体的细胞。当四环素存在时，有利于________与Tet诱导的启动子结合，驱动下游序列转录出mRNA。可通过显微镜检测________________来确定目的基因是否翻译。
(4)研究者检测了不同条件处理下的Pdx1表达量(如下表所示)，证明转基因细胞能定时表达Pdx1。下表中①②③应分别为________、________、________。
组别 1 2 3 4
细胞类型 ES ① ES PDX1＋
四环素 有 ② 无 ③
融合蛋白
表达量 － ＋＋＋＋ － －
注：ES为非转基因的胚胎干细胞；PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞；“＋”越多表示表达量越高，“－”表示未表达。
(5)为验证可通过改变四环素浓度实现对Pdx1表达量的控制，研究者用一系列浓度梯度的四环素溶液处理PDX1＋。预期结果是______________________________________________
______________________________。
课时作业（解析版）
1．大肠杆菌的质粒——环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是(　　)
A．①②③共同组成核糖核苷酸
B．质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C．DNA连接酶会使化学键④重新连接
D．若某种限制酶在质粒上只有一个限制酶切割位点，则质粒被切为两个片段
答案：B
解析：①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切割位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。
2．(2023·重庆，12)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶
答案：B
解析：由于引物只能引导子链从5′到3′合成，分析图中扩增获得的DNA片段可知，其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′，A正确；根据三种限制酶的识别序列和酶切后的DNA片段左右侧的黏性末端可知，步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；用步骤①的两种酶对载体进行酶切，至少切断2处，切割之后至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶对黏性末端均可连接，D正确。
3．农杆菌Ti质粒上的T DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理
B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置
答案：C
解析：PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置，D正确。
4．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占15/16
答案：D
解析：由于复制过程中子链的合成方向是从5′端向3′端，所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端，A正确；图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，复制出的子链的长短从引物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链，以此单链为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，B正确；如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则会降低与模板链结合的效率，因此不能有效扩增目的基因，C正确；第三轮扩增共形成8个DNA分子，共16条链，除去原来的模板链，应该有新形成的14条链，且这14条链中均含有引物，两种引物使用的频率是相同的，即有7条单链含有引物A，每一条单链参与组成1个DNA分子，因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占7/8，D错误。
5．科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T DNA的加工和转移，下列叙述正确的是(　　)
A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B．利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C．Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D．利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
答案：C
解析：使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，Vir区的基因活化能促进T DNA的加工和转移，是T DNA转移整合到受体细胞DNA上必不可少的，不能选限制酶Ⅱ，A错误；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列即可，B错误；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C正确；在培养基中添加四环素，可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，卡那霉素抗性基因位于T DNA之外，不会插入千禧果细胞染色体上，D错误。
6．科学家将常年生活在寒带的比目鱼中的抗冻基因转移到西红柿里，培育出了抗冻番茄，这种西红柿可以在冬季或较寒冷的地区种植，使得人们一年四季都能吃到西红柿。如图为含抗冻基因的外源DNA和质粒DNA的有关信息，其中EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，下列叙述中错误的是(　　)
A．构建基因表达载体时，应用BamHⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒
B．通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在
C．导入抗冻基因的番茄细胞能在含四环素和卡那霉素的培养基上形成愈伤组织
D．可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株
答案：C
解析：据图可知，选择限制酶SalⅠ会破坏目的基因，故右端只能选择限制酶XhoⅠ，但该酶会破坏卡那霉素抗性基因，则应保证四环素抗性基因的完整性，则不能选择EcoRⅠ，故构建基因表达载体时，应选择用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒，A正确；通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在，B正确；由于基因表达载体上的卡那霉素基因已被破坏，故含有抗冻基因的番茄细胞并不具有卡那霉素的抗性，因此导入抗冻基因的番茄细胞不能在含卡那霉素的培养基上形成愈伤组织，C错误；可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株，该鉴定方法是个体生物学水平的鉴定，D正确。
7．(2023·广东，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案：D
解析：进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
8．XhoⅠ和SalⅠ是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述，错误的是(　　)
A．图1中两种限制酶识别的脱氧核苷酸序列不同
B．泳道①是使用SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果
C．图2中电泳移动速度最慢的是泳道②最上方的那条带
D．同时使用SalⅠ和XhoⅠ处理，酶切产物的电泳结果为7条条带
答案：D
解析：不同的限制酶识别并切割的脱氧核苷酸序列不同，图1中两种酶识别的脱氧核苷酸序列不同，A正确；根据图2分析泳道①中是用SalⅠ处理(其有3处切割位点，切割后产生4个DNA片段)得到的酶切产物，B正确；电泳移动速度快慢主要与DNA片段大小有关，泳道②最上方的那条带离点样孔最近，所以移动速度最慢，C正确；由题图可知，若用SalⅠ和XhoⅠ同时切割该DNA，该DNA的每个酶切位点都会被切开，则将被切成6个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带，如果其中有片段分子大小相同，则条带数目小于6条，D错误。
9．为使玉米获得抗除草剂性状，需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是(　　)
A．筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选成功导入表达载体的农杆菌
B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织
C．报告基因在玉米的愈伤组织和农杆菌细胞中均能正确表达
D．诱导幼胚脱分化形成愈伤组织的培养基需添加植物激素
答案：C
解析：据图分析可知，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，可以作为标记基因，因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选成功导入表达载体的农杆菌，A正确；根据提供信息可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织，B正确；Ti质粒上的报告基因含有内含子，作为原核生物的农杆菌不具备切割内含子的能力，因此具有内含子的报告基因无法在农杆菌细胞中正确表达，C错误；植物组织培养过程包括脱分化和再分化过程，两个过程都需要加入植物激素，D正确。
10．如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　)
A．PCR扩增A时可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费
答案：C
解析：由图可知，A基因插入到了质粒的PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点之间，因此PCR扩增A时，需在其两侧加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点，A正确；重组质粒中含有卡那霉素抗性基因，因此可以用含卡那霉素的培养基初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题可知，GUS基因表达产物可催化底物呈蓝色，但是重组质粒中不含GUS基因，导入重组质粒的愈伤组织中也不含该基因，故不会出现蓝色组织，C错误；A为抗除草剂基因，若启动子为除草剂诱导启动子，即只有在除草剂存在的情况下才诱导其表达，没有除草剂时不表达，这就减少了细胞物质和能量的浪费，D正确。
11．(2025·八省联考山西、陕西、宁夏、青海)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径，其基因表达载体如图a，基因1、2和3为该途径的必需基因，基因大小分别为2650 bp、1240 bp和3476 bp。回答下列问题。
(1)图a中，构建基因表达载体时用到的酶是______________，片段X是________。
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种________________________的生理状态，导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落，分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图b。据图可知，PCR时选用的引物对是图a中的______________，选择该引物对进行鉴定的原因是__________________________________________________________；菌落B中未检测到目标条带，其原因是________________________________。
(3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响，请针对其中任一因素，探究其对产物Z产量的影响，写出简要的实验思路___________________________
_________________________________________________________________________________________________________。
答案：(1)限制酶、DNA连接酶　复制原点
(2)能吸收周围环境中DNA分子　引物2和引物5　两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段　菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒
(3)将工程菌株随机分成若干份，分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中，其他环境条件相同且适宜，一段时间后测定产物Z的产量
解析：(2)电泳检测的目的是判断3个抗性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3)，电泳结果显示，菌落A和C电泳条带显示基因大小介于2000～3000之间，结合目的基因上的引物分析，应该选择引物2和引物5，两种引物扩增了基因2(1240 bp)以及基因1和基因3的部分片段，片段大小应该在2000～3000之间，且两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段，这样可以很好的判断大肠杆菌中是否成功导入了目的基因。菌落B中未检测到目标条带，即不含目的基因但含抗性基因，其原因是菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒。
(3)本实验的实验目的是探究温度、pH和溶解氧等发酵条件对产物Z产量的影响，实验自变量是温度或pH或溶解氧，检测指标是产物Z产量。
12．(2025·八省联考四川)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。
(1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的肽链含有________个氨基酸。通过PCR分别扩增Y基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同的有________(填标号)。
a．模板 b．引物
c．DNA聚合酶 d．反应缓冲液
(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由是__________________________________________________________。
(3)据图步骤一分析，为确保Y－GFP基因插入载体后完整表达，在构建重组基因表达载体时不能选择EcoRⅠ限制酶，理由是_________________________________________________
___________________________________。
(4)为检测Y－GFP蛋白的激酶活性，用Y－GFP蛋白、A蛋白和ATP组合实验，四组实验的条件及电泳结果如图步骤二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别。若Y－GFP蛋白有激酶活性，则后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是________泳道(从泳道①～④中选填序号)，从Y－GFP蛋白功能角度分析，理由是______________________________________________________________________，利用表达的具有绿色荧光的Y－GFP蛋白还可开展的实验有________________(答出1个即可)。
答案：(1)245　ab
(2)核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能翻译出来
(3)Y基因结构内部含有EcoRⅠ限制酶的酶切位点，Y基因结构会被EcoRⅠ限制酶破坏
(4)④　磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，A蛋白的磷酸化需要蛋白激酶Y和ATP同时存在　分析A蛋白被磷酸化的水平
解析：(1)基因片段上的碱基数目与转录出的mRNA上的碱基数目与翻译出的氨基酸数目比例为6∶3∶1，不考虑终止密码子，则该蛋白质最多由735÷3＝245个氨基酸组成。PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。进行PCR扩增目的基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板(待扩增的DNA片段)、引物。
(4)Y－GFP蛋白具有使A蛋白被磷酸化的功能，利用这一特性，还可用表达具有绿色荧光的Y－GFP蛋白来分析A蛋白被磷酸化的水平。
13．诱导干细胞定向分化具有重要的医学价值。基因Pdx1在胰腺发育阶段的胰腺组织中大量表达，对胰腺定向发育和成熟有重要作用。研究者将Pdx1基因构建到含Tet诱导型启动子的基因表达载体(GV347)中，转入小鼠胚胎干细胞(ES)，以期实现Pdx1基因在胚胎干细胞中的定时和定量表达。回答下列问题：
(1)培养ES时，应将ES置于含有95%________和5% CO2的混合气体的CO2培养箱中培养。CO2的主要作用是______________________。
(2)提取胰腺细胞的总mRNA，经过________过程可获得cDNA。为特异性的扩增Pdx1基因的cDNA，引物设计的依据是________________________________。为使基因表达载体能成功表达Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白，应将________(填“含”或“不含”)终止子的cDNA插入到GV347的限制酶切割位点(如下图)。
注：Tet诱导的启动子是在四环素存在条件下，可以激活基因表达。嘌呤霉素可抑制翻译过程。
(3)将重组载体导入ES，然后将细胞置于含有________的培养基内培养，以筛选出成功导入载体的细胞。当四环素存在时，有利于________与Tet诱导的启动子结合，驱动下游序列转录出mRNA。可通过显微镜检测________________来确定目的基因是否翻译。
(4)研究者检测了不同条件处理下的Pdx1表达量(如下表所示)，证明转基因细胞能定时表达Pdx1。下表中①②③应分别为________、________、________。
组别 1 2 3 4
细胞类型 ES ① ES PDX1＋
四环素 有 ② 无 ③
融合蛋白
表达量 － ＋＋＋＋ － －
注：ES为非转基因的胚胎干细胞；PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞；“＋”越多表示表达量越高，“－”表示未表达。
(5)为验证可通过改变四环素浓度实现对Pdx1表达量的控制，研究者用一系列浓度梯度的四环素溶液处理PDX1＋。预期结果是______________________________________________
______________________________。
答案：(1)空气　维持培养液的pH
(2)逆转录　与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对　不含
(3)嘌呤霉素　RNA聚合酶　是否发出绿色荧光　(4)PDX1＋　有　无
(5)一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高
解析：(2)mRNA经过逆转录可以得到cDNA；引物需要与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对；Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白共用一个启动子和终止子，因此Pdx1基因的cDNA应不含终止子，否则绿色荧光蛋白基因无法表达。
(3)载体上含有嘌呤霉素抗性基因，应将细胞置于含有嘌呤霉素的培养基上进行培养和筛选；RNA聚合酶与启动子结合，启动基因的转录；由于目的基因与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，因此可通过显微镜检测是否发出绿色荧光来反映目的基因是否翻译。
(4)PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞，①表达融合蛋白，①为PDX1＋，因此②为有四环素，诱导基因的表达；组别4的结果无相应蛋白的表达，因此③为无四环素。
(5)由于四环素可以促进基因的表达，因此一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高。
1第课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.DNA的粗提取与鉴定。5.DNA片段的扩增及电泳鉴定。
一　基因工程的概念及基本工具
1．基因工程概念
(1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。
知识拓展　基因工程的理论基础
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称：限制酶)
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
②类型
常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能 “缝合”黏性末端和平末端。E.coli DNA连接酶连接平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶
结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒(常用载体，是环状双链DNA分子)、噬菌体、动植物病毒等。
②质粒
③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②常用PCR(聚合酶链式反应)特异性地快速扩增目的基因
PCR定义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
PCR原理 DNA半保留复制
条件 模板 目的基因的两条链
原料 4种脱氧核苷酸
酶 耐高温的DNA聚合酶
引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2种
在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化
PCR反应过程 变性 当温度超过90__℃时，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50__℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 72 ℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成
扩增 方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸
方式 指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)
结果 短时间内大量扩增目的基因
产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳
知识拓展
1．在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
2．引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
3．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
③还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心工作
(1)操作目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体组成
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
细胞类型 方法 原理/操作步骤
植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
农杆菌 转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞
动物细胞(受精卵) 显微注射 技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
微生物 细胞(原 核细胞) Ca2＋ 处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中
4.目的基因的检测与鉴定
三　实验
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)实验步骤(以洋葱为例)
特别提醒　
1．加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
2．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)PCR仪
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
(2)电泳鉴定PCR产物的原理
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理。
②电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③鉴定原理
PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300 nm的紫外灯下被检测出来。
(3)实验步骤
①PCR实验操作步骤
②DNA的电泳鉴定
(4)注意事项
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。( )
2．质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。( )
3．目的基因一定是编码蛋白质的基因。( )
4．基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。( )
5．Ti质粒上的T DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。( )
6．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。( )
7．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。( )
8．基因工程中所用的质粒大都是天然质粒，在受体细胞中自我复制。( )
9．限制酶只能用于切割目的基因。( )
10．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定。( )
11．载体质粒的标记基因可以有一个或多个。( )
12．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )
13．PCR中加热到50 ℃左右的目的是在Taq DNA聚合酶作用下合成子链。( )
14．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物常采用的方法。( )
15．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定。( )
16．只有用相同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒。( )
17．构建重组质粒时，使用两种限制酶可避免质粒和目的基因的环化，还能避免目的基因与质粒反向连接。( )
18．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法。( )
19．只要目的基因进入受体细胞就能实现表达。( )
20．限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。( )
21．DNA连接酶是将单个脱氧核苷酸连接在已有DNA片段上的酶。( )
22．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。( )
23．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动DNA的复制过程。( )
24．构建基因表达载体是基因工程的核心工作。( )
25．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。( )
26．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。( )
27．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。( )
28．用二苯胺试剂鉴定DNA时，溶液蓝色深浅反映DNA含量的多少。( )
29．粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。( )
30．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。( )
31．电泳时，应有一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。( )
32．以新鲜洋葱为材料进行DNA粗提取实验，若研磨、过滤不充分，则会直接影响提取的DNA量。( )
33．DNA粗提取所依据的原理是加入体积分数为70%的冷酒精，DNA会从溶液中析出。( )
考向一　结合基因工程所需工具酶和载体，考查科学思维能力
[例1]　(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
[例2]　第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别如图所示。下列分析错误的是(　　)
A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
考向二　结合PCR技术的操作和应用，考查科学思维能力
[例3]　(2022·辽宁，12)抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
[例4]　PCR反应中使用的引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，而5′端则无严格限制，常用于给目的基因两侧添加限制酶切点等序列。下列相关叙述正确的是(　　)
A．PCR第3个循环，消耗了7对引物
B．反应体系中游离的脱氧核苷酸作为PCR扩增的原料会依次连接到引物的5′端
C．耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上
D．用图中引物扩增仅需2个循环后就能获得两端均添加限制酶切点的目的基因
考向三　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究能力
[例5]　(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
[例6]　(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占
考向四　围绕基因工程的基本操作程序，考查科学思维能力
[例7]　(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
[例8]　(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
[例9]　锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2＋的功能。为研究该植物某种锌转运蛋白与吸收Zn2＋相关的生物学功能，通过基因工程对锌吸收缺陷型酵母进行转化。回答下列问题：
(1)扩增锌转运蛋白基因时，以该植物________为材料提取并纯化mRNA，通过________合成cDNA。设计引物进行PCR扩增，PCR完成以后产物通常采用________________来鉴定。
(2)为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在PCR引物的________端加上限制酶识别序列，且两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现____________________________(答出一点即可)。为保证锌转运蛋白基因的表达，常利用酵母质粒作为载体，并借助质粒上原有基因的________________，需将目的基因插入在它们之间。
(3)酵母菌转化，取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，活化、培养后用重组表达载体转化酵母菌。转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感受态，目的是____________________，通过____________________检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白水平的高低。
(4)已知锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，通过设置一个固体培养基来鉴定转化酵母是否赋予了锌吸收特性。配置含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，在适宜的条件下培养一段时间后，如何判断有转化成功的酵母？________________________________。
考向五　围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
[例10]　(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
[例11]　多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是(　　)
A．研磨液可通过离心去除固体杂物
B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA
C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA
D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色
答案及解析
1．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(×)
2．质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。(×)
3．目的基因一定是编码蛋白质的基因。(×)
4．基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。(×)
5．Ti质粒上的T DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(√)
6．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)
7．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。(×)
8．基因工程中所用的质粒大都是天然质粒，在受体细胞中自我复制。(×)
9．限制酶只能用于切割目的基因。(×)
10．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定。(×)
11．载体质粒的标记基因可以有一个或多个。(√)
12．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(√)
13．PCR中加热到50 ℃左右的目的是在Taq DNA聚合酶作用下合成子链。(×)
14．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物常采用的方法。(√)
15．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定。(√)
16．只有用相同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒。(×)
17．构建重组质粒时，使用两种限制酶可避免质粒和目的基因的环化，还能避免目的基因与质粒反向连接。(√)
18．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法。(√)
19．只要目的基因进入受体细胞就能实现表达。(×)
20．限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(×)
21．DNA连接酶是将单个脱氧核苷酸连接在已有DNA片段上的酶。(×)
22．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(√)
23．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动DNA的复制过程。(×)
24．构建基因表达载体是基因工程的核心工作。(√)
25．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(√)
26．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(√)
27．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。(×)
28．用二苯胺试剂鉴定DNA时，溶液蓝色深浅反映DNA含量的多少。(√)
29．粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(×)
30．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。(√)
31．电泳时，应有一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。(√)
32．以新鲜洋葱为材料进行DNA粗提取实验，若研磨、过滤不充分，则会直接影响提取的DNA量。(√)
33．DNA粗提取所依据的原理是加入体积分数为70%的冷酒精，DNA会从溶液中析出。(×)
考向一　结合基因工程所需工具酶和载体，考查科学思维能力
[例1]　(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
答案：C
解析：用酶3切割质粒和目的基因产生的是平末端，而E.coli DNA连接酶连接平末端的效率低，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。
[例2]　第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别如图所示。下列分析错误的是(　　)
A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
答案：C
解析：用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒，产生的片段可连接成重组DNA分子，A正确；质粒为环状DNA，其上含有一个EcoRⅠ的切点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条核苷酸链上含有1个游离的磷酸基团，故切割后的质粒DNA含有2个游离的磷酸基团，B正确；用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接后能有多种连接产物，如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向或反向连接等，C错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D正确。
1．与DNA有关的几种酶的比较 2．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
考向二　结合PCR技术的操作和应用，考查科学思维能力
[例3]　(2022·辽宁，12)抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案：B
解析：预变性的温度为94 ℃，在这个温度下，双链DNA解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制，A错误；延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过程需要引物与模板链结合，使耐高温的DNA聚合酶在引物的3′端加上相应的脱氧核苷酸，C错误；转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市，D错误。
[例4]　PCR反应中使用的引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，而5′端则无严格限制，常用于给目的基因两侧添加限制酶切点等序列。下列相关叙述正确的是(　　)
A．PCR第3个循环，消耗了7对引物
B．反应体系中游离的脱氧核苷酸作为PCR扩增的原料会依次连接到引物的5′端
C．耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上
D．用图中引物扩增仅需2个循环后就能获得两端均添加限制酶切点的目的基因
答案：C
解析：该DNA是双链，第一次循环需要1对引物，第二次需要2对，第三次需要4对，第四次需要8对，即PCR第3个循环，消耗了4对引物，A错误；进行PCR时，扩增是从引物的3′端延伸，因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3′端，B错误；耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，C正确；由图示可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即用图中引物扩增至少3个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的基因，D错误。
考向三　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究能力
[例5]　(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案：A
解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的，对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移，而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段(带负电)越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
[例6]　(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占
答案：D
解析：根据题意可知，2对等位基因的遗传遵循自由组合定律。设电泳图中从上部到下部分别是基因a1、a2、b1、b2的PCR产物的电泳结果，则P1、P2的基因型分别为a1a1b2b2、a2a2b1b1，F1的基因型为a1a2b1b2，①～⑧的基因型分别为a1a2b1b1、a1a2b2b2、a1a1b1b2、a2a2b1b1、a1a1b1b1、a1a1b2b2、a2a2b2b2、a1a2b1b2。由试题分析可知，①②个体的基因型分别为a1a2b1b1、a1a2b2b2，均为杂合体，F1的基因型为a1a2b1b2，F1自交所得F2中③(a1a1b1b2)所占的比例为1/4×1/2＝1/8，⑤(a1a1b1b1)所占的比例为1/4×1/4＝1/16，A正确；F2个体的基因型有9种，电泳图中未显示的F2个体的基因型为a2a2b1b2，其相关基因的PCR产物电泳结果有3条带，B正确；③(a1a1b1b2)和⑦(a2a2b2b2)杂交，子代的基因型有2种，分别为a1a2b2b2、a1a2b1b2，③和⑦杂交子代相关基因的PCR产物电泳结果与②(a1a2b2b2)和⑧(a1a2b1b2)电泳结果相同，C正确；①(a1a2b1b1)自交，子代的基因型为1/4a1a1b1b1、1/2a1a2b1b1、1/4a2a2b1b1，①自交子代相关基因的PCR产物电泳结果与④(a2a2b1b1)电泳结果相同的占1/4，D错误。
考向四　围绕基因工程的基本操作程序，考查科学思维能力
[例7]　(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案：(1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)
(2)F2和R1(或F1和R2)　a链
(3)J－V5融合蛋白　不是
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体，需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。
(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2、R1或F1、R2，若选用引物F1、R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′端，引物要与DNA的3′端互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。
(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J－V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
[例8]　(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案：D
解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。
[例9]　锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2＋的功能。为研究该植物某种锌转运蛋白与吸收Zn2＋相关的生物学功能，通过基因工程对锌吸收缺陷型酵母进行转化。回答下列问题：
(1)扩增锌转运蛋白基因时，以该植物________为材料提取并纯化mRNA，通过________合成cDNA。设计引物进行PCR扩增，PCR完成以后产物通常采用________________来鉴定。
(2)为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在PCR引物的________端加上限制酶识别序列，且两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现____________________________(答出一点即可)。为保证锌转运蛋白基因的表达，常利用酵母质粒作为载体，并借助质粒上原有基因的________________，需将目的基因插入在它们之间。
(3)酵母菌转化，取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，活化、培养后用重组表达载体转化酵母菌。转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感受态，目的是____________________，通过____________________检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白水平的高低。
(4)已知锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，通过设置一个固体培养基来鉴定转化酵母是否赋予了锌吸收特性。配置含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，在适宜的条件下培养一段时间后，如何判断有转化成功的酵母？________________________________。
答案：(1)根部细胞　逆转录　琼脂糖凝胶电泳
(2)5′　目的基因自身环化；质粒的自身环化；目的基因的反向连接　启动子与终止子
(3)使细胞易于吸收外源DNA　抗原—抗体杂交法
(4)b区有些菌落明显大于a区的菌落
解析：(1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，逆转录合成cDNA。PCR完成以后产物通常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(2)PCR过程中，由于DNA子链是从引物的3′端延伸，因此在设计引物时，只能在两条引物的5′端加上限制酶识别序列。两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现目的基因自身环化、质粒的自身环化或目的基因的反向连接。要将锌转运蛋白基因插入到质粒的启动子和终止子之间，才能保证锌转运蛋白基因的表达。
(3)转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感受态，目的是改变细胞膜的通透性，使细胞易于吸收外源DNA。可采用抗原—抗体杂交法检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白的水平。
(4)配置含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，由于锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，转化成功的酵母赋予了锌吸收特性后增殖较快，在适宜的条件下培养一段时间后，b区有些菌落明显大于a区的菌落，说明有转化成功的酵母。
如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。 (3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考向五　围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
[例10]　(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案：A
解析：DNA的提取过程中可以不使用离心机，可将研磨液过滤后在4 ℃冰箱中放置几分钟后，直接取上清液放入烧杯中，A正确，B错误；鉴定过程需要沸水浴加热，DNA分子在高温下会解螺旋，双螺旋结构会发生改变，C错误；设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
[例11]　多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是(　　)
A．研磨液可通过离心去除固体杂物
B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA
C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA
D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色
答案：C
1(共115张PPT)
　　　　　　　　　　　　　
选择性必修3　生物技术与工程
第十单元　生物技术与工程
小单元3　基因工程
第1课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.DNA的粗提取与鉴定。5.DNA片段的扩增及电泳鉴定。
目录
CONTENTS
02
经典考题训练
01
知识自主梳理
03
课时作业
01
知识自主梳理
一　基因工程的概念及基本工具
1．基因工程概念
(1)手段：按照____________，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的___________和__________。
(3)水平：______水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作_____________技术。
人们的愿望
转基因
生物类型
生物产品
分子
重组DNA
知识拓展　基因工程的理论基础
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称：_________)
限制酶
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 ___________ T4噬菌体
功能 “缝合”___________________。E.coli DNA连接酶连接平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的____________ (2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段_____________________。
②类型
拼接成新的DNA分子
大肠杆菌
黏性末端和平末端
磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒(常用载体，是环状双链DNA分子)、________、动植物病毒等。
②质粒
③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
重组DNA分子的筛选
二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞______或获得预期__________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
从相关的已知________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②常用______(聚合酶链式反应)特异性地快速扩增目的基因
性状
表达产物
结构和功能清晰
PCR
PCR定义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
PCR原理 DNA____________
条件 模板 ___________________
原料 4种脱氧核苷酸
酶 耐高温的____________
引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链______。2种
在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 半保留复制
目的基因的两条链
DNA聚合酶
核酸
PCR反应过程 变性 当温度__________时，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到______左右时，两种引物通过_____________与两条单链DNA结合
延伸 72 ℃左右时，在___________________作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成
超过90 ℃
50 ℃
碱基互补配对
耐高温的DNA聚合酶
扩增 方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的___________延伸
方式 指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)
结果 ___________________________
产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳
5′端向3′端
短时间内大量扩增目的基因
知识拓展
1．在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
2．引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
3．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
③还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心工作
(1)操作目的
使目的基因在受体细胞中__________，并且______给下一代，同时，使目的基因能够______和发挥作用。
(2)基因表达载体组成
稳定存在
遗传
表达
启动子
上游
RNA聚合酶
转录
终止子
下游
RNA聚合酶
转录
标记基因
目的基因
(3)构建过程
标记
基因
限制酶
DNA连接
细胞 类型 方法 原理/操作步骤
植物 细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入_____中；
②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在___________，使目的基因借助____________进入胚囊
3．将目的基因导入受体细胞
子房
花柱切面上
花粉管通道
植物细胞 农杆菌 转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的_________(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的_____________上。如果将目的基因插入Ti质粒的T DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞
T DNA
染色体DNA
动物细胞 (受精卵) _________技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
微生物细胞 (原核细胞) Ca2＋ 处理法 用______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中
显微注射
Ca2＋
4.目的基因的检测与鉴定
三　实验
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在________________方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于______，但某些蛋白质溶于______；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol·L－1的___________。
②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。
物理和化学性质
酒精
NaCl溶液
酒精
二苯胺
(2)实验步骤(以洋葱为例)
研磨液
上清液
95%
一个方向
2 mol/L
二苯胺
5 min
蓝色
特别提醒　
1．加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
2．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)PCR仪
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
(2)电泳鉴定PCR产物的原理
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理。
②电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的______下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相____的电极移动，这个过程就是电泳。
③鉴定原理
PCR的产物一般通过____________电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与__________________________________等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300 nm的紫外灯下被检测出来。
pH
琼脂糖凝胶
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
反
(3)实验步骤
①PCR实验操作步骤
②DNA的电泳鉴定
紫外灯
(4)注意事项
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行__________处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在______ ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
高压灭菌
－20
1．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(　　)
2．质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。(　　)
3．目的基因一定是编码蛋白质的基因。(　　)
4．基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。(　　)
5．Ti质粒上的T DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　)
6．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(　　)
×
√
×
×
×
×
7．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。(　　)
8．基因工程中所用的质粒大都是天然质粒，在受体细胞中自我复制。(　　)
9．限制酶只能用于切割目的基因。(　　)
10．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定。(　　)
11．载体质粒的标记基因可以有一个或多个。(　　)
×
√
×
×
×
12．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(　　)
13．PCR中加热到50 ℃左右的目的是在Taq DNA聚合酶作用下合成子链。(　　)
14．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物常采用的方法。(　　)
15．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定。(　　)
16．只有用相同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒。(　　)
×
√
√
√
×
17．构建重组质粒时，使用两种限制酶可避免质粒和目的基因的环化，还能避免目的基因与质粒反向连接。(　　)
18．将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法。(　　)
19．只要目的基因进入受体细胞就能实现表达。(　　)
20．限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(　　)
21．DNA连接酶是将单个脱氧核苷酸连接在已有DNA片段上的酶。(　　)
×
√
√
×
×
22．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(　　)
23．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动DNA的复制过程。(　　)
24．构建基因表达载体是基因工程的核心工作。(　　)
25．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(　　)
×
√
√
√
26．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(　　)
27．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。(　　)
28．用二苯胺试剂鉴定DNA时，溶液蓝色深浅反映DNA含量的多少。(　　)
29．粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(　　)
×
√
√
×
30．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。(　　)
31．电泳时，应有一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。(　　)
32．以新鲜洋葱为材料进行DNA粗提取实验，若研磨、过滤不充分，则会直接影响提取的DNA量。(　　)
33．DNA粗提取所依据的原理是加入体积分数为70%的冷酒精，DNA会从溶液中析出。(　　)
×
√
√
√
经典考题训练
02
考向一　结合基因工程所需工具酶和载体，考查科学思维能力
[例1]　(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
解析：用酶3切割质粒和目的基因产生的
是平末端，而E.coli DNA连接酶连接平末端的
效率低，A错误；用酶1切割目的基因，产生的
是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末
端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用
酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。
[例2]　第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别如图所示。下列分析错误的是(　　)
A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团
C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
解析：用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和
质粒，产生的片段可连接成重组DNA分子，A正
确；质粒为环状DNA，其上含有一个EcoRⅠ的
切点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子
变为链状DNA分子，因每条核苷酸链上含有1个游离的磷酸基团，故切割后的质粒DNA含有2个游离的磷酸基团，B正确；用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接后能有多种连接产物，如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向或反向连接等，C错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D正确。
1．与DNA有关的几种酶的比较
2．限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
考向二　结合PCR技术的操作和应用，考查科学思维能力
[例3]　(2022·辽宁，12)抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
解析：预变性的温度为94 ℃，在这个温度下，双链DNA解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制，A错误；延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过程需要引物与模板链结合，使耐高温的DNA聚合酶在引物的3′端加上相应的脱氧核苷酸，C错误；转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市，D错误。
[例4]　PCR反应中使用的引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，而5′端则无严格限制，常用于给目的基因两侧添加限制酶切点等序列。下列相关叙述正确的是(　　)
A．PCR第3个循环，消耗了7对引物
B．反应体系中游离的脱氧核苷酸作为PCR扩增的原料会依次连接到引物的5′端
C．耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上
D．用图中引物扩增仅需2个循环后就能获得两端均添加限制酶切点的目的基因
解析：该DNA是双链，第一次循环需要
1对引物，第二次需要2对，第三次需要4对，
第四次需要8对，即PCR第3个循环，消耗了4
对引物，A错误；进行PCR时，扩增是从引物的3′端延伸，因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3′端，B错误；耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，C正确；由图示可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即用图中引物扩增至少3个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的基因，D错误。
考向三　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究能力
[例5]　(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的，对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移，而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段(带负电)越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
[例6]　(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
解析：根据题意可知，2对等位基因的遗传遵循自由组合定律。设电泳图中从上部到下部分别是基因a1、a2、b1、b2的PCR产物的电泳结果，则P1、P2的基因型分别为a1a1b2b2、a2a2b1b1，F1的基因型为a1a2b1b2，①～⑧的基因型分别为a1a2b1b1、a1a2b2b2、a1a1b1b2、a2a2b1b1、a1a1b1b1、a1a1b2b2、a2a2b2b2、a1a2b1b2。由试题分析可知，①②个体的基因型分别为a1a2b1b1、a1a2b2b2，均为杂合体，F1的基因型为a1a2b1b2，F1自交所得F2中③(a1a1b1b2)所占的比例为1/4×1/2＝1/8，⑤(a1a1b1b1)
所占的比例为1/4×1/4＝1/16，A正确；F2个体的基因型有9种，电泳图中未显示的F2个体的基因型为a2a2b1b2，其相关基因的PCR产物电泳结果有3条带，B正确；③(a1a1b1b2)和⑦(a2a2b2b2)杂交，子代的基因型有2种，分别为a1a2b2b2、a1a2b1b2，③和⑦杂交子代相关基因的PCR产物电泳结果与②(a1a2b2b2)和⑧(a1a2b1b2)电泳结果相同，C正确；①(a1a2b1b1)自交，子代的基因型为1/4a1a1b1b1、1/2a1a2b1b1、1/4a2a2b1b1，①自交子代相关基因的PCR产物电泳结果与④(a2a2b1b1)电泳结果相同的占1/4，D错误。
考向四　围绕基因工程的基本操作程序，考查科学思维能力
[例7]　(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是___________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________________________(答出2个结构即可)。
RNA聚合酶
标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
F2和R1(或F1和R2)
a链
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
J－V5融合蛋白
不是
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体，需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。
(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物
延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2、R1或F1、R2，若选用引物F1、R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′端，引物要与DNA的3′端
互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。
(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J－V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
[例8]　(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA
片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组
质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，
用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向
连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可
能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。
[例9]　锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2＋的功能。为研究该植物某种锌转运蛋白与吸收Zn2＋相关的生物学功能，通过基因工程对锌吸收缺陷型酵母进行转化。回答下列问题：
(1)扩增锌转运蛋白基因时，以该植物___________为材料提取并纯化mRNA，通过________合成cDNA。设计引物进行PCR扩增，PCR完成以后产物通常采用_________________来鉴定。
根部细胞
逆转录
琼脂糖凝胶电泳
(2)为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在PCR引物的_____端加上限制酶识别序列，且两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现_____________________________________________________(答出一点即可)。为保证锌转运蛋白基因的表达，常利用酵母质粒作为载体，并借助质粒上原有基因的________________，需将目的基因插入在它们之间。
目的基因自身环化；质粒的自身环化；目的基因的反向连接
5′
启动子与终止子
(3)酵母菌转化，取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，活化、培养后用重组表达载体转化酵母菌。转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感受态，目的是_________________________，通过___________________检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白水平的高低。
使细胞易于吸收外源DNA
抗原—抗体杂交法
(4)已知锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，通过设置一个固体培养基来鉴定转化酵母是否赋予了锌吸收特性。配置含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，在适宜的条件下培养一段时间后，如何判断有转化成功的酵母？____________________ ____________。
b区有些菌落明显大于
a区的菌落
解析：(1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，逆转录合成cDNA。PCR完成以后产物通常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(2)PCR过程中，由于DNA子链是从引物的3′端延伸，因此在设计引物时，只能在两条引物的5′端加上限制酶识别序列。两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现目的基因自身环化、质粒的自身环化或目的基因的反向连接。要将锌转运蛋白基因插入到质粒的启动子和终止子之间，才能保证锌转运蛋白基因的表达。
(3)转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感受态，目的是改变细胞膜的通透性，使细胞易于吸收外源DNA。可采用抗原—抗体杂交法检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白的水平。
(4)配置含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，由于锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，转化成功的酵母赋予了锌吸收特性后增殖较快，在适宜的条件下培养一段时间后，b区有些菌落明显大于a区的菌落，说明有转化成功的酵母。
如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考向五　围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力
[例10]　(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
解析：DNA的提取过程中可以不使用离心机，可将研磨液过滤后在4 ℃冰箱中放置几分钟后，直接取上清液放入烧杯中，A正确，B错误；鉴定过程需要沸水浴加热，DNA分子在高温下会解螺旋，双螺旋结构会发生改变，C错误；设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
[例11]　多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是(　　)
A．研磨液可通过离心去除固体杂物
B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA
C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA
D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色
课时作业
03
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
难度 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★★ ★★ ★★ ★★ ★★★
对点 质粒 基因表达载体的构建 PCR PCR 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 DNA粗提取与鉴定实验 DNA片段酶切电泳结果分析 农杆菌转化法 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序
1．大肠杆菌的质粒——环状DNA是基因工程的常用载体，结构如图。下列叙述正确的是(　　)
A．①②③共同组成核糖核苷酸
B．质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则
C．DNA连接酶会使化学键④重新连接
D．若某种限制酶在质粒上只有一个限制酶切割位点，则质粒被切为两个片段
解析：①②③共同组成DNA的基本单位——脱氧核苷酸，A错误；质粒中的碱基遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对，B正确；限制酶识别特定序列并在特定位点切割，环状质粒上若只有一个限制酶切割位点，则质粒被切割为1个完整的DNA链状片段，D错误。
2．(2023·重庆，12)某小组通过PCR[假
设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了
含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行
酶切(如图)，再用所得片段成功构建了基因表
达载体。下列叙述错误的是(　　)
A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶
解析：由于引物只能引导子链从5′到3′合成，分析图中扩增获得的DNA片段可知，其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′，A正确；根据三种限制酶的识别序列和酶切后的DNA片段左右侧的黏性末端可知，步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；用步骤①的两种酶对载体进行酶切，至少切断2处，切割之后至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶对黏性末端均可连接，D正确。
3．农杆菌Ti质粒上的T DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　)
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理
B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置
解析：PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T DNA的插入位置，D正确。
4．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的
部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列
叙述错误的是(　　)
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷
酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核
苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占15/16
解析：由于复制过程中子链的合成方向是从
5′端向3′端，所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的
脱氧核苷酸连接到3′端，A正确；图中的引物A和
引物B均不在该片段的端点，复制出的子链的长短
从引物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复
制中才会出现两个引物之间的单链，以此单链为模
板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的
DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，B正确；如果引物之间或引物自身发生碱基
互补配对则会降低与模板链结合的效率，因此不能有效扩增目的基因，C正确；第三轮扩增共形成8个DNA分子，共16条链，除去原来的模板链，应该有新形成的14条链，且这14条链中均含有引物，两种引物使用的频率是相同的，即有7条单链含有引物A，每一条单链参与组成1个DNA分子，因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占7/8，D错误。
5．科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入
千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育
过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能
促进T DNA的加工和转移，下列叙述正确的是(　　)
A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B．利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C．Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D．利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
解析：使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，Vir区
的基因活化能促进T DNA的加工和转移，是T DNA转
移整合到受体细胞DNA上必不可少的，不能选限制酶
Ⅱ，A错误；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知
道抗冻基因两端碱基序列即可，B错误；农杆菌侵染植
物细胞后，Ti质粒上的T DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C正确；在培养基中添加四环素，可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，卡那霉素抗性基因位于T DNA之外，不会插入千禧果细胞染色体上，D错误。
6．科学家将常年生活在寒带的比目鱼中的抗冻基因转移到西红柿里，培育出了抗冻番茄，这种西红柿可以在冬季或较寒冷的地区种植，使得人们一年四季都能吃到西红柿。如图为含抗冻基因的外源DNA和质粒DNA的有关信息，其中EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，下列叙述中错误的是(　　)
A．构建基因表达载体时，应用BamHⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒
B．通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在
C．导入抗冻基因的番茄细胞能在含四环素和卡那霉素的培养基上形成愈伤组织
D．可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株
解析：据图可知，选择限制酶SalⅠ
会破坏目的基因，故右端只能选择限制酶
XhoⅠ，但该酶会破坏卡那霉素抗性基因，
则应保证四环素抗性基因的完整性，则不
能选择EcoRⅠ，故构建基因表达载体时，应选择用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒，A正确；通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在，B正确；由于基因表达载体上的卡那霉素基因已被破坏，故含有抗冻基因的番茄细胞并不具有卡那霉素的抗性，因此导入抗冻基因的番茄细胞不能在含卡那霉素的培养基上形成愈伤组织，C错误；可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株，该鉴定方法是个体生物学水平的鉴定，D正确。
7．(2023·广东，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析：进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
8．XhoⅠ和SalⅠ是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述，错误的是(　　)
A．图1中两种限制酶识别的脱氧核苷酸序列不同
B．泳道①是使用SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果
C．图2中电泳移动速度最慢的是泳道②最上方的那条带
D．同时使用SalⅠ和XhoⅠ处理，酶切产物的电泳结果为7条条带
解析：不同的限制酶识别并切割的脱氧
核苷酸序列不同，图1中两种酶识别的脱氧核
苷酸序列不同，A正确；根据图2分析泳道①
中是用SalⅠ处理(其有3处切割位点，切割后产生4个DNA片段)得到的酶切产物，B正确；电泳移动速度快慢主要与DNA片段大小有关，泳道②最上方的那条带离点样孔最近，所以移动速度最慢，C正确；由题图可知，若用SalⅠ和XhoⅠ同时切割该DNA，该DNA的每个酶切位点都会被切开，则将被切成6个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带，如果其中有片段分子大小相同，则条带数目小于6条，D错误。
9．为使玉米获得抗除草剂性状，需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是(　　)
A．筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选成功导入表达载体的农杆菌
B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织
C．报告基因在玉米的愈伤组织和农杆菌细胞中均能正确表达
D．诱导幼胚脱分化形成愈伤组织的培养基需添加植物激素
解析：据图分析可知，质粒上含有
氨苄青霉素抗性基因，可以作为标记基
因，因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基
筛选成功导入表达载体的农杆菌，A正确；
根据提供信息可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织，B正确；Ti质粒上的报告基因含有内含子，作为原核生物的农杆菌不具备切割内含子的能力，因此具有内含子的报告基因无法在农杆菌细胞中正确表达，C错误；植物组织培养过程包括脱分化和再分化过程，两个过程都需要加入植物激素，D正确。
10．如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　)
A．PCR扩增A时可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费
解析：由图可知，A基因插入到了质粒的
PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点之间，因此PCR扩增
A时，需在其两侧加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位
点，A正确；重组质粒中含有卡那霉素抗性基
因，因此可以用含卡那霉素的培养基初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题可知，GUS基因表达产物可催化底物呈蓝色，但是重组质粒中不含GUS基因，导入重组质粒的愈伤组织中也不含该基因，故不会出现蓝色组织，C错误；A为抗除草剂基因，若启动子为除草剂诱导启动子，即只有在除草剂存在的情况下才诱导其表达，没有除草剂时不表达，这就减少了细胞物质和能量的浪费，D正确。
11．(2025·八省联考山西、陕西、宁夏、青海)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径，其基因表达载体如图a，基因1、2和3为该途径的必需基因，基因大小分别为2650 bp、1240 bp和3476 bp。回答下列问题。
(1)图a中，构建基因表达载体时用到的酶是___________________，片段X是__________。
限制酶、DNA连接酶
复制原点
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种_________________________的生理状态，导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落，分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图b。据图可知，PCR时选用的引物对是图a中的______________，选择该引物对进行鉴定的原因是________________________________________________________________；菌落B中未检测到目标条带，其原因是_____________________________________。
能吸收周围环境中DNA分子
引物2和引物5
两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段
菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒
(3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响，请针对其中任一因素，探究其对产物Z产量的影响，写出简要的实验思路________ ____________________________________________________________________________________________________________________________。
将工程菌株随机分成若干份，分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中，其他环境条件相同且适宜，一段时间后测定产物Z的产量
解析：(2)电泳检测的目的是判断3个抗
性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3)，电泳结果显示，
菌落A和C电泳条带显示基因大小介于2000
～3000之间，结合目的基因上的引物分析，
应该选择引物2和引物5，两种引物扩增了基
因2(1240 bp)以及基因1和基因3的部分片段，片段大小应该在2000～3000之间，且两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段，这样可以
很好的判断大肠杆菌中是否成功导入了目的
基因。菌落B中未检测到目标条带，即不含
目的基因但含抗性基因，其原因是菌落B中
导入的是普通质粒而非重组质粒。
(3)本实验的实验目的是探究温度、pH
和溶解氧等发酵条件对产物Z产量的影响，实验自变量是温度或pH或溶解氧，检测指标是产物Z产量。
12．(2025·八省联考四川)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。
(1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的
肽链含有_____个氨基酸。通过PCR分别扩增Y
基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同
的有_____(填标号)。
a．模板　　　　　　　　b．引物
c．DNA聚合酶　　　　　d．反应缓冲液
(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，
应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由
是____________________________________________________________。
245
ab
核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能翻译出来
(3)据图步骤一分析，为确保Y－GFP基因插入载体后完整表达，在构建重组基因表达载体时不能选择EcoRⅠ限制酶，理由是____________________________________________________________________________。
Y基因结构内部含有EcoRⅠ限制酶的酶切位点，Y基因结构会被EcoRⅠ限制酶破坏
(4)为检测Y－GFP蛋白的激酶活性，用Y－GFP
蛋白、A蛋白和ATP组合实验，四组实验的条件及电
泳结果如图步骤二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化
抗体特异性识别。若Y－GFP蛋白有激酶活性，则后
续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号
的是____泳道(从泳道①～④中选填序号)，从Y－GFP
蛋白功能角度分析，理由是_______________________
________________________________________________________，利用表达的具有绿色荧光的Y－GFP蛋白还可开展的实验有______________________(答出1个即可)。
④
磷酸化的A蛋白可被磷酸化
抗体特异性识别，A蛋白的磷酸化需要蛋白激酶Y和ATP同时存在
分析A蛋白被磷酸化的水平
解析：(1)基因片段上的碱基数目与转录出的
mRNA上的碱基数目与翻译出的氨基酸数目比例为
6∶3∶1，不考虑终止密码子，则该蛋白质最多由
735÷3＝245个氨基酸组成。PCR反应进行的条件：
引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。进行PCR扩增
目的基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板
(待扩增的DNA片段)、引物。
(4)Y－GFP蛋白具有使A蛋白被磷酸化的功能，利用这一特性，还可用表达具有绿色荧光的Y－GFP蛋白来分析A蛋白被磷酸化的水平。
13．诱导干细胞定向分化具有重要的医学价值。基因Pdx1在胰腺发育阶段的胰腺组织中大量表达，对胰腺定向发育和成熟有重要作用。研究者将Pdx1基因构建到含Tet诱导型启动子的基因表达载体(GV347)中，转入小鼠胚胎干细胞(ES)，以期实现Pdx1基因在胚胎干细胞中的定时和定量表达。回答下列问题：
(1)培养ES时，应将ES置于含有95%________和5% CO2的混合气体的CO2培养箱中培养。CO2的主要作用是_________________。
空气
维持培养液的pH
(2)提取胰腺细胞的总mRNA，经过_______过程可获得cDNA。为特异性的扩增Pdx1基因的cDNA，引物设计的依据是____________________________________。为使基因表达载体能成功表达Pdx1蛋白和绿色荧光
蛋白的融合蛋白，应将_______(填“含”或“不含”)终
止子的cDNA插入到GV347的限制酶切割位点(如图)。
注：Tet诱导的启动子是在四环素存在条件下，
可以激活基因表达。嘌呤霉素可抑制翻译过程。
逆转录
与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对
不含
(3)将重组载体导入ES，然后将细胞置于含有__________的培养基内培养，以筛选出成功导入载体的细胞。当四环素存在时，有利于____________与Tet诱导的启动子结合，驱动下游序列转录出mRNA。可通过显微镜检测__________________来确定目的基因是否翻译。
嘌呤霉素
RNA聚合酶
是否发出绿色荧光
(4)研究者检测了不同条件处理下的Pdx1表达量(如下表所示)，证明转基因细胞能定时表达Pdx1。下表中①②③应分别为__________、______、______。
注：ES为非转基因的胚胎干细胞；PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞；“＋”越多表示表达量越高，“－”表示未表达。
组别 1 2 3 4
细胞类型 ES ① ES PDX1＋
四环素 有 ② 无 ③
融合蛋白
表达量 － ＋＋＋＋ － －
PDX1＋
有
无
(5)为验证可通过改变四环素浓度实现对Pdx1表达量的控制，研究者用一系列浓度梯度的四环素溶液处理PDX1＋。预期结果是_____________________________ __________________________。
一定浓度范围内，Pdx1表达量
随着Tet浓度增加而升高
解析：(2)mRNA经过逆转录可以得到cDNA；引物需要
与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对；Pdx1蛋白和绿
色荧光蛋白共用一个启动子和终止子，因此Pdx1基因的
cDNA应不含终止子，否则绿色荧光蛋白基因无法表达。
(3)载体上含有嘌呤霉素抗性基因，应将细胞置于含有嘌呤霉素的培养基上进行培养和筛选；RNA聚合酶与启动子结合，启动基因的转录；由于目的基因与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，因此可通过显微镜检测是否发出绿色荧光来反映目的基因是否翻译。
(4)PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞，①表达融合蛋白，①为PDX1＋，因此②为有四环素，诱导基因的表达；组别4的结果无相应蛋白的表达，因此③为无四环素。
(5)由于四环素可以促进基因的表达，因此一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高。
组别 1 2 3 4
细胞类型 ES ① ES PDX1＋
四环素 有 ② 无 ③
融合蛋白
表达量 － ＋＋＋＋ － －

展开更多......

收起↑