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第二课时　微生物的培养技术及应用
主题研习(一)　培养基及微生物的纯培养技术
(一)培养基的配制
1.培养基:人们按照微生物对　　　　　的不同需求,配制出供其　　　　　的营养基质。
2.培养基的种类、特点及用途
3.培养基的成分:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求(如下表)。
微生物 对培养基的特殊需求
乳酸杆菌 培养基中添加维生素
霉菌 将培养基调至　　
细菌 将培养基调至　　　　　　
厌氧微生物 提供无氧的条件
(二)无菌技术
1.含义:在培养微生物的操作中,所有防止杂菌污染的方法。
2.常用的灭菌和消毒方法(连线)
(三)微生物的纯培养
1.相关概念
2.过程(以酵母菌的纯培养为例)
3.常用接种方法:　　　　法和　　　　　　法。
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)虽然各种培养基的具体配方不同,但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。 (　　)
(2)配制培养基时,一般先调pH再灭菌。 (　　)
(3)琼脂含有糖类,既可以为微生物提供碳源也是凝固剂。 (　　)
(4)平板接种常用在微生物培养中,不含氮源的平板不能用于微生物培养。 (　　)
(5)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等),都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。 (　　)
(6)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。 (　　)
2.事理分析
(1)培养基灭菌后,需要冷却至50 ℃左右才能倒平板的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)(人教版选择性必修3 P13“平板划线流程图”拓展思考)平板划线时最后一次划线不能与第一次划线相连的原因是　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)(人教版选择性必修3 P13正文发掘)
倒平板操作中,平板冷凝后,要将平板倒置,其主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
重难点(一)　培养基的配制与无菌技术
|情|境|探|究|
　　尿素是一种重要的农业肥料,若不经细菌的分解,就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多,某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验。实验中用到的尿素培养基成分如表所示,溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL。
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g
(1)按物理性质划分该培养基属于　　　　培养基,因为其中含有　　　。
(2)表中葡萄糖和尿素分别作为培养微生物的　　　和　　　。
(3)在实验中,下列材料或用具需要灭菌的是　　　　,需要消毒的是　　　。(填序号)
①培养细菌用的培养基与培养皿　②玻璃棒、试管、锥形瓶　③实验操作者的双手　④操作空间
⑤接种用具
(4)为防止杂菌污染,常用　　　　　　　　　　　的方法对培养基灭菌。
(5)在培养细菌时,一般需要将培养基的pH调至　　　　　　　性。
|认|知|生|成|
1.培养基营养成分的作用
营养物质 含义或说明 作用
碳源 提供碳元素的物质 参与构成生物体和一些代谢产物,有些是异养生物的能源物质
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
水 在生物体内含量很高,在低等生物体内含量更高 不仅是优良的溶剂,而且是细胞结构的重要组成成分
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括某些大量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质,某些化能自养菌的能源,酶的激活剂等
2.几种常用灭菌和消毒方法的比较
类型 操作方法 适用范围
灼烧灭菌 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 微生物接种工具,如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具等,接种过程中的试管口、瓶口等易被污染的部位
干热灭菌 干热灭菌箱,160~170 ℃的热空气中维持1~2 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等耐高温和需要保持干燥的物品
湿热灭菌 高压蒸汽灭菌锅,100 kPa、121 ℃维持15~30 min 培养基及多种无须保持干燥的器材、物品
煮沸消毒 100 ℃煮沸5~6 min 家庭餐具等生活用品、日常食品等
巴氏消毒 63~65 ℃消毒30 min或72~76 ℃处理15 s或80~85 ℃处理10~15 s 牛奶、啤酒、果酒等不耐高温的液体
紫外线消毒 紫外线照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台等
化学药 物消毒 酒精、碘酒涂抹,苯酚或煤酚皂溶液喷洒等 皮肤、伤口、动植物组织表面、手术器械、塑料等
重难点(二)　微生物的纯培养与平板划线操作
　　[典例]　(2024·湖南高考)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是 (　　)
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
听课随笔:
|认|知|生|成|
1.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 一系列的梯度稀释、涂布平板操作
菌体获得 在具有显著的菌落特征的区域中挑取单个的菌落 从适宜稀释度平板上的菌落中挑取单个的菌落
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落,又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂,需要涂布多个平板
2.平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环,待其冷却后才能蘸取菌液,以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
(4)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步(即取菌种之前)及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌,划线操作结束后,仍需灼烧接种环,每次灼烧的目的如表。
第一步操作 每次划线之前 划线结束后
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种,避免微生物污染环境和感染操作者
题点(一)　培养基的配制与无菌技术
1.(2025·广州模拟)固氮微生物可将空气中的氮气(N2)还原为氨,并转化为细胞中的含氮物质,是土壤中氮素的主要来源。表格是一个用于分离培养固氮微生物的培养基配方,其中甘露醇的分子式为C6H14O6,下列叙述错误的是 (　　)
物质名称 C6H14O6 K2HPO4 MgSO4·7H2O NaCl CaSO4·2H2O CaCO3 H2O
含量 20 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.1 g 5 g 定容至1 000 mL
A.甘露醇在培养基中的作用是调节渗透压
B.固氮菌合成的氨属于初生代谢产物
C.对该培养基先调节pH再进行湿热灭菌
D.该培养基为选择培养基,不含凝固剂
2.人教版选择性必修3 P10正文挖掘)微生物培养过程中所用的无菌技术,主要包括消毒和灭菌。下列有关叙述错误的是 (　　)
A.无菌技术可防止杂菌污染,还可有效避免操作者被感染
B.灭菌较消毒更为彻底,可杀死包括芽孢和孢子在内的所有微生物
C.强烈的理化方法处理某些物品会影响其活性或成分时,通常对这些物品进行消毒
D.灭菌的常用方法包括湿热灭菌、干热灭菌以及化学药物灭菌
题点(二)　微生物的纯培养与平板划线操作
3.(2025·枣庄模拟)如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤,下列相关叙述正确的是 (　　)
A.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B.步骤①待培养基温度降至40 ℃左右进行倒平板操作
C.步骤③每次划线前和划线后都需要对接种环灼烧灭菌
D.步骤③划线结束后在皿盖上标注菌种及接种日期等信息
4.(2025·大连模拟)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。具体做法是在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后,将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至 45~48 ℃,然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液,充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板(如图)。培养一段时间后,在双层培养基的上层会出现透亮的无菌圆形空斑——噬菌斑,下列有关说法正确的是 (　　)
A.实验用到的培养基和培养皿常用干热灭菌法进行灭菌
B.若利用双层平板法对 T2噬菌体进行计数,可选用农杆菌作敏感指示菌
C.上层平板上出现的透亮无菌圆形空斑是噬菌体单独在培养基上繁殖形成的噬菌斑
D.倒上层平板时需将培养基冷却至45~48 ℃时进行接种,目的是防止培养基温度过高引起敏感指示菌和待测噬菌体死亡
主题研习(二)　微生物的选择培养和计数
(一)微生物的选择培养
1.等比稀释操作(如图)
2.涂布平板操作
3.培养
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板　　　,放入30~37 ℃的　　　　　　中培养1~2 d。
(二)微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法(间接计数法)
计数 原理 当样品的　　　　　　　时,培养基表面生长的一个　　　　,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的　　　　　,就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数 方法 通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数为　　　　、适于计数的平板。在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出　　　　
2.显微镜计数法(直接计数法)
计数 原理 利用特定的细菌计数板或　　　　　　　,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
优点 是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法
缺点 统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。 (　　)
(2)某同学分离高产脲酶菌时选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株。 (　　)
(3)稀释涂布平板法计数时,平板上的一个菌落就是一个细菌。 (　　)
(4)血细胞计数板比细菌计数板厚,常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 (　　)
(5)为分离红曲霉,使用稀释涂布平板法进行接种培养并统计菌落数,若3个平行组中的菌落数为210、27、116,此时可取平均值直接计算。 (　　)
(6)刚果红可以与纤维素形成透明复合物,所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 (　　)
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P18正文探究思考)
请说明测定活菌的数量不能用平板划线法的原因: 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)(人教版选择性必修3 P18“探究·实践”拓展分析)
利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因是　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为扩大培养可耐受高浓度β 苯乙醇的酵母菌菌株(YDF 1),若选用葡萄糖作为碳源,为确定YDF 1增殖的最佳葡萄糖浓度,请设计一个较为简便的实验进行探究,实验设计思路是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
重难点(一)　微生物选择培养的原理和方法
1.选择培养的原理
根据不同微生物的特殊营养需求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
2.三种选择培养方法的比较
方法 特点 举例
利用营养缺陷型选择培养基 通过控制培养基的营养成分,使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源时可以分离固氮微生物
利用加入某种化学物质 在完全培养基中加入某些化学物质,抑制某些微生物生长,同时选择所需的微生物 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
利用培养条件 改变微生物的培养条件 在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
3.选择培养基和鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长,促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—亚甲蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
　　[例1]　(2024·浙江6月选考)脲酶催化尿素水解,产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是 (　　)
A.镍是组成脲酶的重要元素
B.镍能提高尿素水解反应的活化能
C.产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D.以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
听课随笔:
重难点(二)　微生物计数的原理和方法
　　[例2]　(2025·盐城模拟)测定样品中所含单细胞微生物的数量可用显微镜计数法。将某大肠杆菌培养液稀释1 000倍后,经等体积台盼蓝染液染色后,用细菌计数板(规格为1 mm×1 mm×0.02 mm)进行计数,观察到一个中格的菌体数如图所示。下列相关叙述正确的是 (　　)
A.若图示中格内大肠杆菌数量代表所有中格大肠杆菌数量的平均数,则培养液中大肠杆菌的活菌密度为1.125×1010个·mL-1
B.细菌计数板可用于细菌的数量测定,也可用于酵母菌的数量测定
C.台盼蓝染色鉴别细胞死活的原理是细胞膜具有选择透过性
D.细菌计数板使用时,应先在计数室上方加盖玻片,再沿凹槽边缘滴加样液
听课随笔:
　　[例3]　(2025·南阳模拟)如图为以苹果皮为材料分离纯化用于果醋制作的菌种,已知所用培养基为“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”——米曲汁1 000 mL、CaCO3 10 g、95%乙醇30 mL(灭菌后加入),在该培养基上,醋酸菌菌落周围会形成透明圈。下列有关说法正确的是 (　　)
A.①过程通常需在18~30 ℃下进行静置培养
B.“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”中能为醋酸菌提供氮源的物质是米曲汁
C.②过程采用平板划线法接种,然后选择透明圈大的菌落作为菌种进一步培养
D.①扩大培养后的菌种浓度约为8.1×108个/mL
听课随笔:
|认|知|生|成|　两种微生物计数方法的比较
项目 间接计数法 (稀释涂布平板法) 直接计数法 (显微镜计数法)
原理 通过统计平板上的菌落数,推测出样品中大约含有多少活菌 在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌株数=C/V×M C:某稀释倍数下至少3个平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的菌液稀释液体积(mL);M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数 (注:规格为1 mm×1 mm×0.1 mm)
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死细胞和活细胞
结果 比实际活菌数少 比实际活菌数多
题点(一)　微生物选择培养的原理和方法
1.(2025·贵州一模)寄生于人体胃中的幽门螺杆菌(Hp)可引起胃黏膜慢性发炎,导致胃溃疡及十二指肠溃疡甚至胃癌。临床上常用14C呼气试验检测人体是否感染Hp,原理是Hp产生的脲酶能将尿素分解成CO2和NH3,受检者口服14C标记的尿素[14CO(NH2)2]胶囊一段时间后,若从受检者呼出的气体中检测出14CO2,则可确定受检者被Hp感染。下列叙述正确的是 (　　)
A.在分离培养Hp的培养基中,尿素只能提供碳源
B.脲酶的作用原理是为Hp分解尿素提供活化能
C.感染者呼出的CO2和14CO2,产生的场所相同
D.Hp分解尿素产生NH3可能有利于其适应胃部的强酸环境
2.(2025·南昌模拟)多环芳烃(PAHs,由C、H两种元素组成)常存在于石油污染物中,具有致癌、致畸、致突变作用,对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。科研人员为筛选出能高效降解PAHs的微生物进行了相关实验,相关流程如图1所示;图2是3组微生物对PAHs降解的实验结果,3组微生物的初始接种量相同。下列相关叙述错误的是 (　　)
A.从被石油污染的土壤中采样易于筛选出能高效降解PAHs的微生物
B.选择培养的目的是增加能降解PAHs微生物的浓度
C.图1中接种微生物所采用的方法是平板划线法
D.与微生物P相比,微生物L降解PAHs的能力更强
题点(二)　微生物计数的原理和方法
3.(2024·南宁二模)丙草胺(C17H26ClNO2)是一种广泛应用的除草剂,能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株,并对其计数(过程如图),以期为修复污染土壤提供微生物资源。下列有关叙述正确的是 (　　)
A.计数时可用平板划线法代替图中的稀释过程
B.利用该方法计数,结果往往比活菌的实际数目偏大
C.配制以丙草胺为唯一氮源的选择培养基进行培养,可以分离出降解菌
D.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
　　[易错提醒]
稀释涂布平板法与显微镜直接计数法的注意点
①稀释涂布平板法计数误差分析:由于当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,因此计算结果比实际值偏小。
②显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活,但是通过一定的辅助处理,可以实现活菌计数,如在计数前用台盼蓝染液进行染色,可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
4.(2025·成都预测)某研究团队从食塑料蜡虫肠道中分离能降解聚乙烯(PE)的细菌,以解决塑料污染问题。将分离得到的两种细菌(YT1和YP1)在PE薄膜培养液中培养,培养液中细菌数量变化以及PE失重率(降解PE能力的高低)变化如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.用经湿热灭菌后的含PE、葡萄糖和无机盐等成分的液体培养基分离目的细菌
B.分离得到目的细菌的纯培养可用平板划线法在酸性的选择培养基上进行
C.在对细菌进行计数时,常用显微镜计数法和稀释涂布平板法
D.在第20天后两种细菌群体降解PE的能力差异增大,且细菌YT1强于细菌YP1
第二课时　微生物的培养技术及应用
主题研习(一)
基础全面落实
(一)1.营养物质　生长繁殖　2.液体　选择　抑制或阻止
3．酸性　中性或弱碱性
(二)2.①－c－Ⅳ　①－d－Ⅱ　①－e－Ⅴ　②－a－Ⅰ、Ⅶ
②－b－Ⅲ　②－f－Ⅵ
(三)1.固体培养基　有一定形态结构　2.高压蒸汽灭菌　干热灭菌　平板划线　倒置　未接种　3.平板划线　稀释涂布平板
[自我诊断]
1．(1)√　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×　(6)×
2．(1)培养基的温度高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固
(2)最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连，则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果
(3)防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)和防止培养基水分过快蒸发
重难深化拓展
[情境探究]
(1)固体　琼脂　(2)碳源　氮源　(3)①②⑤　③④　(4)高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)　(5)中性或弱碱
[典例]　选D　由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。
考向精细研究
1．选A　甘露醇主要为该培养基提供碳源，A错误；固氮菌合成的氨是固氮菌生长所必需的，属于初生代谢产物，B正确；为了防止调节pH过程中的杂菌污染，一般先调pH再进行湿热灭菌，C正确；分析培养基成分可知，培养基中没有氮源，不能够固氮的微生物在该培养基上不能生长，因此该培养基为选择培养基，不含凝固剂，D正确。
2．选D　无菌技术的核心就是防止杂菌污染，无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染，A正确；消毒是指用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，故灭菌较消毒更为彻底，B正确；强烈的理化方法处理某些物品会影响其活性或成分时，通常对这些物品进行消毒，C正确；灭菌的常用方法包括湿热灭菌、干热灭菌以及灼烧灭菌，化学药物为消毒方法，D错误。
3．选C　对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒处理，A错误；待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，B错误；平板划线法每次划线前后都需要对接种环灼烧灭菌，C正确；划线结束后在培养皿底标注菌种及接种日期等信息，D错误。
4．选D　实验用到的培养皿常用干热灭菌法进行灭菌，培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A错误；T2噬菌体专门寄生在大肠杆菌体内，所以不可选用农杆菌作敏感指示菌，B错误；噬菌体无法单独在培养基上繁殖，上层平板上出现的透亮无菌圆形空斑是敏感菌裂解后形成的，C错误；倒上层平板时需将培养基冷却至45～48 ℃时进行接种，目的是防止培养基温度过高引起敏感指示菌和待测噬菌体死亡，D正确。
主题研习(二)
基础全面落实
(一)2.培养基　酒精　冷却　培养皿　3.倒置　恒温培养箱
(二)1.稀释度足够高　单菌落　菌落数　30～300　平均值　2.血细胞计数板　3.脲酶　尿素　中性　菌落数目稳定　菌落特征　酚红
[自我诊断]
1．(1)√　(2)√　(3)×　(4)√　(5)×　(6)×
2．(1)由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的单菌落，而其他一些菌落往往由两个或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量
(2)存在多种尿素分解菌；存在自生固氮菌；培养基中掺入除尿素外的其他氮源；以及无菌操作不符合要求等
(3)设置一系列浓度梯度的葡萄糖溶液，再向其中分别接种等量的YDF 1，每天定时用血细胞计数板统计溶液中的菌体数量，菌体数量最多的葡萄糖溶液浓度即为YDF 1增殖的最佳浓度(最接近YDF 1增殖的最佳浓度)
重难深化拓展
[例1]　选B　根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素水解产生的氨作为氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。
[例2]　选C　血细胞计数板的体积为1 mm×1 mm×0.02 mm＝0.02 mm3＝2×10－5 mL。图中一个中格(16小格)中的大肠杆菌数总共有12个，其中3个被台盼蓝染色，说明为死细胞，不计数，则可计数大肠杆菌为9个，原1 mL培养液中的大肠杆菌数＝每个小格中的平均大肠杆菌数×400个小格×2(等体积台盼蓝染液染色相当于稀释两倍)×大肠杆菌培养稀释倍数÷(2×10－5)，则该1 mL样品中大肠杆菌数＝9÷16×400×2×1 000÷(2×10－5)＝2.25×1010(个·mL－1)，A错误；酵母菌菌体较大，应选用血细胞计数板测定酵母菌的数量，B错误；活细胞的细胞膜具有选择透过性，活细胞不能被台盼蓝染色，死细胞被台盼蓝染成蓝色，C正确；使用细菌计数板时，先放置盖玻片，再在盖玻片边缘滴加样液，D错误。
[例3]　选B　图示过程为以苹果皮为材料分离纯化用于果醋制作的菌种，说明纯培养物为来自苹果皮上的野生型醋酸菌，醋酸菌适宜的生长温度是30～35 ℃，且需振荡培养，A错误；培养基的成分有水、无机盐、碳源和氮源等，“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”中能为醋酸菌提供氮源的物质是米曲汁，B正确；平板划线法只能纯化不能计数，本题用的是稀释涂布平板法，C错误；图示过程共稀释107倍，根据最后三个培养皿的菌落数为75、80、88，平均数为81，可求出菌种浓度为81÷0.1×107＝8.1×109个/mL，故①扩大培养后的菌种浓度约为8.1×109个/mL，D错误。
考向精细研究
1．选D　在分离培养Hp的培养基中，尿素[14CO(NH2)2]可提供氮源和碳源，A错误；酶的作用原理是降低活化能而不是提供活化能，B错误；感染者呼出的CO2和14CO2，分别来自感染者的细胞呼吸、Hp分解尿素，故产生的场所不同，C错误；Hp分解尿素产生的NH3能中和胃酸，因而可能有利于其适应胃部的强酸环境，D正确。
2．选C　多环芳烃(PAHs)常存在于石油污染物中，从被石油污染的土壤中采样易于筛选出能高效降解多环芳烃(PAHs)的微生物，A正确；选择培养可以增大所需微生物的浓度，图1中的选择培养是为了增加能降解PAHs微生物的浓度，B正确；将0.1 mL样液接种在平板上的方法为稀释涂布平板法，C错误；从图2可以看出，微生物L比微生物P对PAHs的降解率大，D正确。
3．选C　平板划线法不能代替题图中的稀释过程，A错误；当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落，所以利用该方法计数，结果往往比活菌的实际数目偏小，B错误；丙草胺可提供碳源、氮源，配制以丙草胺为唯一氮源(还有其他成分)的选择培养基进行培养，可以分离出降解菌，C正确；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109个，D错误。
4．选C　分离目的细菌要用以PE为唯一碳源的固体培养基，不加葡萄糖，A错误；培养细菌应在中性或弱碱性环境中培养，B错误；对微生物进行计数时，常用显微镜计数法和稀释涂布平板法，C正确；由图2可知，与空白组相比，细菌YT1和YP1的失重率均增大，说明失重率越高，降低PE的能力越强，因此细菌YP1降解PE的能力强于细菌YT1，D错误。(共97张PPT)
微生物的培养技术及应用
第二课时
目录
主题研习（一）
主题研习（二）
培养基及微生物的纯培养技术　　
课时跟踪检测
微生物的选择培养和计数
主题研习（一）培养基及微生物的纯培养技术　　
(一)培养基的配制
1.培养基:人们按照微生物对____________的不同需求,配制出供其_________的营养基质。
2.培养基的种类、特点及用途
基础全面落实
液体
营养物质
生长繁殖
选择
抑制或阻止
3.培养基的成分:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求(如下表)。
微生物 对培养基的特殊需求
乳酸杆菌 培养基中添加维生素
霉菌 将培养基调至________
细菌 将培养基调至______________
厌氧微生物 提供无氧的条件
酸性
中性或弱碱性
(二)无菌技术
1.含义:在培养微生物的操作中,所有防止杂菌污染的方法。
2.常用的灭菌和消毒方法(连线)
(三)微生物的纯培养
1.相关概念
固体培养基
有一定形态结构
2.过程(以酵母菌的纯培养为例)
高压蒸汽灭菌
干热灭菌
平板划线
倒置
未接种
3.常用接种方法:__________法和_______________法。
平板划线
稀释涂布平板
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)虽然各种培养基的具体配方不同,但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。 ( )
(2)配制培养基时,一般先调pH再灭菌。 ( )
(3)琼脂含有糖类,既可以为微生物提供碳源也是凝固剂。( )
√
√
×
(4)平板接种常用在微生物培养中,不含氮源的平板不能用于微生物培养。 ( )
(5)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等),都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。 ( )
(6)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。 ( )
×
×
×
2.事理分析
(1)培养基灭菌后,需要冷却至50 ℃左右才能倒平板的原因是_____
__________________________________________________________。
(2)(人教版选择性必修3 P13“平板划线流程图”拓展思考)平板划线时最后一次划线不能与第一次划线相连的原因是__________________
_______________________________________________________________________________。
培养基的温度高于50 ℃会烫手,低于50 ℃时若不及时操作,琼脂会凝固
最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞,如果与第一次划线相连,则增加了细菌的数目,得不到纯化的效果
(3)(人教版选择性必修3 P13正文发掘)倒平板操作中,平板冷凝后,要将平板倒置,其主要原因是____________________________________
_______________________________________________。
防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)和防止培养基水分过快蒸发
重难点(一)　培养基的配制与无菌技术
|情|境|探|究|
　　尿素是一种重要的农业肥料,若不经细菌的分解,就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多,某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验。实验中用到的尿素培养基成分如表所示,溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL。
重难深化拓展
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g
(1)按物理性质划分该培养基属于______培养基,因为其中含有_____。
(2)表中葡萄糖和尿素分别作为培养微生物的______和______。
(3)在实验中,下列材料或用具需要灭菌的是_______,需要消毒的是____。(填序号)
①培养细菌用的培养基与培养皿　②玻璃棒、试管、锥形瓶　③实验操作者的双手　④操作空间 ⑤接种用具
固体
琼脂
碳源
氮源
①②⑤
③④
(4)为防止杂菌污染,常用_______________________的方法对培养基灭菌。
(5)在培养细菌时,一般需要将培养基的pH调至____________性。
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
中性或弱碱
|认|知|生|成|
1.培养基营养成分的作用
营养物质 含义或说明 作用
碳源 提供碳元素的物质 参与构成生物体和一些代谢产物,有些是异养生物的能源物质
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
水 在生物体内含量很高,在低等生物体内含量更高 不仅是优良的溶剂,而且是细胞结构的重要组成成分
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括某些大量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质,某些化能自养菌的能源,酶的激活剂等
2.几种常用灭菌和消毒方法的比较
类型 操作方法 适用范围
灼烧灭菌 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 微生物接种工具,如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具等,接种过程中的试管口、瓶口等易被污染的部位
干热灭菌 干热灭菌箱,160~170 ℃的热空气中维持1~2 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等耐高温和需要保持干燥的物品
湿热灭菌 高压蒸汽灭菌锅,100 kPa、121 ℃维持15~30 min 培养基及多种无须保持干燥的器材、物品
煮沸 消毒 100 ℃煮沸5~6 min 家庭餐具等生活用品、日常食品等
巴氏消毒 63~65 ℃消毒30 min或72~76 ℃处理15 s或80~85 ℃处理10~15 s 牛奶、啤酒、果酒等不耐高温的液体
紫外线 消毒 紫外线照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台等
化学药物 消毒 酒精、碘酒涂抹,苯酚或煤酚皂溶液喷洒等 皮肤、伤口、动植物组织表面、手术器械、塑料等
续表
重难点(二)　微生物的纯培养与平板划线操作
　　[典例]　(2024·湖南高考)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦ C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
√
　　[解析]　由图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确,故选D。
|认|知|生|成|
1.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 一系列的梯度稀释、涂布平板操作
菌体获得 在具有显著的菌落特征的区域中挑取单个的菌落 从适宜稀释度平板上的菌落中挑取单个的菌落
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落,又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂,需要涂布多个平板
2.平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环,待其冷却后才能蘸取菌液,以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
(4)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步(即取菌种之前)及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌,划线操作结束后,仍需灼烧接种环,每次灼烧的目的如表。
第一步操作 每次划线之前 划线结束后
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种,避免微生物污染环境和感染操作者
题点(一)　培养基的配制与无菌技术
1.(2025·广州模拟)固氮微生物可将空气中的氮气(N2)还原为氨,并转化为细胞中的含氮物质,是土壤中氮素的主要来源。表格是一个用于分离培养固氮微生物的培养基配方,其中甘露醇的分子式为C6H14O6,下列叙述错误的是(　　)
考向精细研究
物质名称 C6H14O6 K2HPO4 MgSO4·7H2O NaCl CaSO4·2H2O CaCO3 H2O
含量 20 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.1 g 5 g 定容至1 000 mL
A.甘露醇在培养基中的作用是调节渗透压
B.固氮菌合成的氨属于初生代谢产物
C.对该培养基先调节pH再进行湿热灭菌
D.该培养基为选择培养基,不含凝固剂
解析:甘露醇主要为该培养基提供碳源,A错误;固氮菌合成的氨是固氮菌生长所必需的,属于初生代谢产物,B正确;为了防止调节pH过程中的杂菌污染,一般先调pH再进行湿热灭菌,C正确;分析培养基成分可知,培养基中没有氮源,不能够固氮的微生物在该培养基上不能生长,因此该培养基为选择培养基,不含凝固剂,D正确。
√
2. (人教版选择性必修3 P10正文挖掘)微生物培养过程中所用的无菌技术,主要包括消毒和灭菌。下列有关叙述错误的是 (　　)
A.无菌技术可防止杂菌污染,还可有效避免操作者被感染
B.灭菌较消毒更为彻底,可杀死包括芽孢和孢子在内的所有微生物
C.强烈的理化方法处理某些物品会影响其活性或成分时,通常对这些物品进行消毒
D.灭菌的常用方法包括湿热灭菌、干热灭菌以及化学药物灭菌
√
解析:无菌技术的核心就是防止杂菌污染,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染,A正确;消毒是指用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物,灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子,故灭菌较消毒更为彻底,B正确;强烈的理化方法处理某些物品会影响其活性或成分时,通常对这些物品进行消毒,C正确;灭菌的常用方法包括湿热灭菌、干热灭菌以及灼烧灭菌,化学药物为消毒方法,D错误。
题点(二)　微生物的纯培养与平板划线操作
3.(2025·枣庄模拟)如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤,下列相关叙述正确的是(　　)
A.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理
B.步骤①待培养基温度降至40 ℃左右进行倒平板操作
C.步骤③每次划线前和划线后都需要对接种环灼烧灭菌
D.步骤③划线结束后在皿盖上标注菌种及接种日期等信息
√
解析:对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒处理,A错误;待培养基冷却至50 ℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板,B错误;平板划线法每次划线前后都需要对接种环灼烧灭菌,C正确;划线结束后在培养皿底标注菌种及接种日期等信息,D错误。
4.(2025·大连模拟)双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。具体做法是在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后,将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至 45~48 ℃,然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液,充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板(如图)。培养一段时间后,在双层培养基的上层会出现透亮的无菌圆形空斑——噬菌斑,下列有关说法正确的是 (　　)
A.实验用到的培养基和培养皿常用干热灭菌法进行灭菌
B.若利用双层平板法对 T2噬菌体进行计数,可选用农杆菌作敏感指示菌
C.上层平板上出现的透亮无菌圆形空斑是噬菌体单独在培养基上繁殖形成的噬菌斑
D.倒上层平板时需将培养基冷却至45~48 ℃时进行接种,目的是防止培养基温度过高引起敏感指示菌和待测噬菌体死亡
√
解析:实验用到的培养皿常用干热灭菌法进行灭菌,培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌,A错误;T2噬菌体专门寄生在大肠杆菌体内,所以不可选用农杆菌作敏感指示菌,B错误;噬菌体无法单独在培养基上繁殖,上层平板上出现的透亮无菌圆形空斑是敏感菌裂解后形成的,C错误;倒上层平板时需将培养基冷却至45~48 ℃时进行接种,目的是防止培养基温度过高引起敏感指示菌和待测噬菌体死亡,D正确。
主题研习（二）微生物的选择培养和计数
基础全面落实
(一)微生物的选择培养
1.等比稀释操作(如图)
2.涂布平板操作
3.培养
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板_________,放入30~37 ℃的______________中培养1~2 d。
培养基
酒精
冷却
培养皿
倒置
恒温培养箱
(二)微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法(间接计数法)
计数原理 当样品的_______________时,培养基表面生长的一个________,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的__________,就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数方法 通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数为______________、适于计数的平板。在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出___________
稀释度足够高
单菌落
菌落数
30~300
平均值
2.显微镜计数法(直接计数法)
计数原理 利用特定的细菌计数板或_______________,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
优点 是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法
缺点 统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和
血细胞计数板
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
脲酶
尿素
中性
菌落数目稳定
菌落特征
酚红
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。( )
(2)某同学分离高产脲酶菌时选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株。 ( )
(3)稀释涂布平板法计数时,平板上的一个菌落就是一个细菌。( )
(4)血细胞计数板比细菌计数板厚,常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 ( )
√
×
√
√
(5)为分离红曲霉,使用稀释涂布平板法进行接种培养并统计菌落数,若3个平行组中的菌落数为210、27、116,此时可取平均值直接计算。 ( )
(6)刚果红可以与纤维素形成透明复合物,所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 ( )
×
×
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P18正文探究思考)请说明测定活菌的数量不能用平板划线法的原因:_____________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________________。
由于在所划的线中,一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的单菌落,而其他一些菌落往往由两个或多个细菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个细菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目远低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量
(2)(人教版选择性必修3 P18“探究·实践”拓展分析)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因是_______________________________________________
__________________________________________。
存在多种尿素分解菌;存在自生固氮菌;培养基中掺入除尿素外的其他氮源;以及无菌操作不符合要求等
(3)为扩大培养可耐受高浓度β-苯乙醇的酵母菌菌株(YDF-1),若选用葡萄糖作为碳源,为确定YDF-1增殖的最佳葡萄糖浓度,请设计一个 较为简便的实验进行探究,实验设计思路是_______________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
________________________________________________ 。
设置一系列浓度梯度的葡萄糖溶液,再向其中分别接种等量的YDF-1,每天定时用血细胞计数板统计溶液中的菌体数量,菌体数量最多的葡萄糖溶液浓度即为YDF-1增殖的最佳浓度(最接近YDF-1增殖的最佳浓度)
重难深化拓展
重难点(一)　微生物选择培养的原理和方法
1.选择培养的原理
根据不同微生物的特殊营养需求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
2.三种选择培养方法的比较
方法 特点 举例
利用营养缺陷型选择培养基 通过控制培养基的营养成分,使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源时可以分离固氮微生物
利用加入某种化学物质 在完全培养基中加入某些化学物质,抑制某些微生物生长,同时选择所需的微生物 加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
利用培养条件 改变微生物的培养条件 在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
3.选择培养基和鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长,促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—亚甲蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
[例1]　(2024·浙江6月选考)脲酶催化尿素水解,产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是 (　　)
A.镍是组成脲酶的重要元素
B.镍能提高尿素水解反应的活化能
C.产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D.以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
√
[解析]　根据题意,脲酶被去除镍后失去活性,说明镍是组成脲酶的重要元素,A正确;脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能,镍作为脲酶的重要组成元素,应该与降低尿素水解反应的活化能有关,B错误;产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖,C正确;产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素水解产生的氨作为氮源,不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源,因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌,D正确。
重难点(二)　微生物计数的原理和方法
[例2]　(2025·盐城模拟)测定样品中所含单细胞微生物的数量可用显微镜计数法。将某大肠杆菌培养液稀释1 000倍后,经等体积台盼蓝染液染色后,用细菌计数板(规格为1 mm×1 mm×0.02 mm)进行计数,观察到一个中格的菌体数如图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
A.若图示中格内大肠杆菌数量代表所有中格大肠杆菌数量的平均数,则培养液中大肠杆菌的活菌密度为1.125×1010个·mL-1
B.细菌计数板可用于细菌的数量测定,也可用于酵母菌的数量测定
C.台盼蓝染色鉴别细胞死活的原理是细胞膜具有选择透过性
D.细菌计数板使用时,应先在计数室上方加盖玻片,再沿凹槽边缘滴加样液
√
[解析]　血细胞计数板的体积为1 mm×1 mm×0.02 mm=0.02 mm3=
2×10-5 mL。图中一个中格(16小格)中的大肠杆菌数总共有12个,其中3个被台盼蓝染色,说明为死细胞,不计数,则可计数大肠杆菌为9个,原1 mL培养液中的大肠杆菌数=每个小格中的平均大肠杆菌数×400个小格×2(等体积台盼蓝染液染色相当于稀释两倍)×大肠杆菌培养稀释倍数÷(2×10-5),则该1 mL样品中大肠杆菌数=9÷16×400×2×1 000÷(2×10-5)=2.25×1010(个·mL-1),A错误;酵母菌菌体较大,应选用血细胞计数板测定酵母菌的数量,B错误;活细胞的细胞膜具有选择透过性,活细胞不能被台盼蓝染色,死细胞被台盼蓝染成蓝色,C正确;使用细菌计数板时,先放置盖玻片,再在盖玻片边缘滴加样液,D错误。
　　[例3]　(2025·南阳模拟)如图为以苹果皮为材料分离纯化用于果醋制作的菌种,已知所用培养基为“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”——米曲汁1 000 mL、CaCO3 10 g、95%乙醇30 mL(灭菌后加入),在该培养基上,醋酸菌菌落周围会形成透明圈。下列有关说法正确的是 (　　)
A.①过程通常需在18~30 ℃下进行静置培养
B.“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”中能为醋酸菌提供氮源的物质是米曲汁
C.②过程采用平板划线法接种,然后选择透明圈大的菌落作为菌种进一步培养
D.①扩大培养后的菌种浓度约为8.1×108个/mL
√
[解析]　图示过程为以苹果皮为材料分离纯化用于果醋制作的菌种,说明纯培养物为来自苹果皮上的野生型醋酸菌,醋酸菌适宜的生长温度是30~35 ℃,且需振荡培养,A错误;培养基的成分有水、无机盐、碳源和氮源等,“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”中能为醋酸菌提供氮源的物质是米曲汁,B正确;平板划线法只能纯化不能计数,本题用的是稀释涂布平板法,C错误;图示过程共稀释107倍,根据最后三个培养皿的菌落数为75、80、88,平均数为81,可求出菌种浓度为81÷0.1×107=8.1×109个/mL,故①扩大培养后的菌种浓度约为8.1×109个/mL,D错误。
|认|知|生|成|　两种微生物计数方法的比较
项目 间接计数法 (稀释涂布平板法) 直接计数法
(显微镜计数法)
原理 通过统计平板上的菌落数,推测出样品中大约含有多少活菌 在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌株数=C/V×M C:某稀释倍数下至少3个平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的菌液稀释液体积(mL);M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
(注:规格为1 mm×1 mm×0.1 mm)
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死细胞和活细胞
结果 比实际活菌数少 比实际活菌数多
考向精细研究
题点(一)　微生物选择培养的原理和方法
1.(2025·贵州一模)寄生于人体胃中的幽门螺杆菌(Hp)可引起胃黏膜慢性发炎,导致胃溃疡及十二指肠溃疡甚至胃癌。临床上常用14C呼气试验检测人体是否感染Hp,原理是Hp产生的脲酶能将尿素分解成CO2和NH3,受检者口服14C标记的尿素[14CO(NH2)2]胶囊一段时间后,若从受检者呼出的气体中检测出14CO2,则可确定受检者被Hp感染。下列叙述正确的是(　　)
A.在分离培养Hp的培养基中,尿素只能提供碳源
B.脲酶的作用原理是为Hp分解尿素提供活化能
C.感染者呼出的CO2和14CO2,产生的场所相同
D.Hp分解尿素产生NH3可能有利于其适应胃部的强酸环境
解析:在分离培养Hp的培养基中,尿素[14CO(NH2)2]可提供氮源和碳源,A错误;酶的作用原理是降低活化能而不是提供活化能,B错误;感染者呼出的CO2和14CO2,分别来自感染者的细胞呼吸、Hp分解尿素,故产生的场所不同,C错误;Hp分解尿素产生的NH3能中和胃酸,因而可能有利于其适应胃部的强酸环境,D正确。
√
2.(2025·南昌模拟)多环芳烃(PAHs,由C、H两种元素组成)常存在于石油污染物中,具有致癌、致畸、致突变作用,对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害。科研人员为筛选出能高效降解PAHs的微生物进行了相关实验,相关流程如图1所示;图2是3组微生物对PAHs降解的实验结果,3组微生物的初始接种量相同。下列相关叙述错误的是 (　　)
A.从被石油污染的土壤中采样易于筛选出能高效降解PAHs的微生物
B.选择培养的目的是增加能降解PAHs微生物的浓度
C.图1中接种微生物所采用的方法是平板划线法
D.与微生物P相比,微生物L降解PAHs的能力更强
解析:多环芳烃(PAHs)常存在于石油污染物中,从被石油污染的土壤中采样易于筛选出能高效降解多环芳烃(PAHs)的微生物,A正确;选择培养可以增大所需微生物的浓度,图1中的选择培养是为了增加能降解PAHs微生物的浓度,B正确;将0.1 mL样液接种在平板上的方法为稀释涂布平板法,C错误;从图2可以看出,微生物L比微生物P对PAHs的降解率大,D正确。
√
题点(二)　微生物计数的原理和方法
3.(2024·南宁二模)丙草胺(C17H26ClNO2)是一种广泛应用的除草剂,能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株,并对其计数(过程如图),以期为修复污染土壤提供微生物资源。下列有关叙述正确的是(　　)
A.计数时可用平板划线法代替图中的稀释过程
B.利用该方法计数,结果往往比活菌的实际数目偏大
C.配制以丙草胺为唯一氮源的选择培养基进行培养,可以分离出降解菌
D.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
√
解析:平板划线法不能代替题图中的稀释过程,A错误;当两个或多个细胞连在一起,平板上观察到的只是一个菌落,所以利用该方法计数,结果往往比活菌的实际数目偏小,B错误;丙草胺可提供碳源、氮源,配制以丙草胺为唯一氮源(还有其他成分)的选择培养基进行培养,可以分离出降解菌,C正确;5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3÷0.1×106=1.7×109个,D错误。
[易错提醒]
稀释涂布平板法与显微镜直接计数法的注意点
①稀释涂布平板法计数误差分析:由于当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,因此计算结果比实际值偏小。
②显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活,但是通过一定的辅助处理,可以实现活菌计数,如在计数前用台盼蓝染液进行染色,可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
4.(2025·成都预测)某研究团队从食塑料蜡虫肠道中分离能降解聚乙烯(PE)的细菌,以解决塑料污染问题。将分离得到的两种细菌(YT1和YP1)在PE薄膜培养液中培养,培养液中细菌数量变化以及PE失重率(降解PE能力的高低)变化如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.用经湿热灭菌后的含PE、葡萄糖和无机盐等成分的液体培养基分离目的细菌
B.分离得到目的细菌的纯培养可用平板划线法在酸性的选择培养基上进行
C.在对细菌进行计数时,常用显微镜计数法和稀释涂布平板法
D.在第20天后两种细菌群体降解PE的能力差异增大,且细菌YT1强于细菌YP1
√
解析:分离目的细菌要用以PE为唯一碳源的固体培养基,不加葡萄糖,A错误;培养细菌应在中性或弱碱性环境中培养,B错误;对微生物进行计数时,常用显微镜计数法和稀释涂布平板法,C正确;由图2可知,与空白组相比,细菌YT1和YP1的失重率均增大,说明失重率越高,降低PE的能力越强,因此细菌YP1降解PE的能力强于细菌YT1,D错误。
课时跟踪检测
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一、选择题
1.某同学为了在实验室富集某种圆褐固氮菌(一种异养型微生物),通过查阅资料配制了成分及浓度如下的培养基。下列叙述正确的是(　　)
A.该培养基中需添加碳源不需要添加氮源
B.该培养基还需要添加琼脂,便于菌种富集
C.培养基灭菌时,采用的是湿热灭菌法中的沸水灭菌法
D.灭菌后待培养基冷却至50 ℃左右时,可以通过滴加酸或碱来调节培养基的pH
成分 甘露醇 KH2PO4 MgSO4·7H2O NaCl CaSO4·2H2O
浓度(质量分数) 1% 0.02% 0.02% 0.02% 0.01%
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解析:圆褐固氮菌是一种异养型微生物,因此培养基中需添加碳源(甘露醇),圆褐固氮菌能固氮,可以将空气中的氮作为氮源,因此不需要添加氮源,A正确;菌种富集必须用液体培养基,不能添加琼脂,B错误;培养基灭菌时,采用的是湿热灭菌法中的高压蒸汽灭菌法,C错误;调节pH需在培养基灭菌前进行,D错误。
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2.(2025·营口模拟)乳糖不耐受患者肠道内的乳糖无法被身体吸收利用,进而被大肠内的部分菌群利用,其代谢产物包含较多气体和酸类物质,导致身体不适,如腹胀和腹泻。下列相关叙述不合理的是 (　　)
A.患者消化道内缺乏乳糖酶
B.乳糖为肠道菌群提供氮源
C.患者肠道内分泌液增多导致出现腹泻
D.乳糖耐受和不耐受属于相对性状
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解析:患者消化道内缺乏乳糖酶,因而无法将肠道内的乳糖水解,A正确;乳糖的元素组成为C、H、O,不含N,无法为肠道菌群提供氮源,B错误;腹泻的原因是乳糖不耐受患者饮用牛奶等含乳糖饮料后乳糖在体内无法被乳糖酶分解后吸收,一方面增加了小肠内的渗透压,水分向肠道内渗透,产生腹泻症状,另一方面乳糖在细菌作用下分解产生其他代谢物,进而引起腹泻的症状,C正确;乳糖耐受和不耐受是同一性状的不同表现形式,属于相对性状,D正确。
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3.(2025·长春模拟)高压蒸汽条件下持续20分钟会杀死芽孢,因此无菌操作中可利用非致病性的嗜热脂肪杆菌的芽孢作为指示菌来测定灭菌的效果。灭菌结束后在塑料瓶外挤破含有培养液的安瓿瓶,使嗜热脂肪杆菌菌片浸没在紫色培养液内并进行培养,如图所示。若芽孢可以生长会使培养液变为黄色。下列叙述正确的是 (　　)
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A.嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性强,高压蒸汽灭菌不能杀死它
B.灭菌后挤破安瓿瓶,一段时间后培养液呈紫色说明灭菌彻底
C.含有嗜热脂肪杆菌菌片的培养液从功能上属于选择培养基
D.设置不灭菌的对照组,挤破安瓿瓶颜色不变说明结果可信
解析:嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性较普通杂菌强,但高压蒸汽灭菌仍能杀死它,A错误;由题意可知,灭菌后挤破安瓿瓶,一段时间后培养液呈紫色说明灭菌彻底,B正确;含有嗜热脂肪杆菌菌片的培养液从功能上属于鉴别培养基,C错误;设置不灭菌的对照组,挤破安瓿瓶颜色变说明结果可信,D错误。
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4.(2025·珠海一模)肺炎支原体的药敏实验中,将蘸有相同浓度的阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素的圆形滤纸片放置于平板不同位置。培养一段时间后,平板上出现的抑菌圈情况如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.支原体与病毒的根本区别是细胞内无核糖体
B.可依据菌落特征判断病人是否有支原体感染
C.“ ”处作为对照组,圆形滤纸片上滴加蒸馏水
D.阿奇霉素抑制支原体增殖效果比克拉霉素好
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解析:支原体是原核细胞,有细胞结构,病毒无细胞结构,因此支原体与病毒的根本区别是有无细胞结构,A错误;支原体可在培养基上生存,可依据菌落特征判断病人是否有支原体感染,B正确;除实验中的三种抗生素组别外还需要设置空白对照组,故“ ”处放置的是蘸有无菌水的圆形滤纸片,C错误;图示三个滤纸片中,克拉霉素对应的抑菌圈比阿奇霉素大,说明克拉霉素抑制效果比阿奇霉素好,D错误。
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5.(2025·南通模拟)亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用,土壤中的富硒细菌可将其还原为红色单质硒,如图为土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程,①~⑤为相应步骤。下列相关叙述错误的是 (　　)
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A.培养富硒细菌时,培养基应调至酸性并添加维生素
B.步骤①中的培养基可进行高压蒸汽灭菌,对吸管、培养皿等可采用干热灭菌
C.步骤②→③采用的是稀释涂布平板法,该方法可用于微生物分离和活菌计数
D.步骤④中可以根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选
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解析:培养细菌时,培养基应该调至中性或弱碱性,且培养某些细菌(如乳酸杆菌)时才需要在培养基中添加维生素,A错误;获得纯净培养物的关键是没有杂菌污染,培养基需要灭菌但又需保持其中水分,因此可用高压蒸汽灭菌,吸管、培养皿等需要保持干燥,可用干热灭菌,B正确;步骤②→③采用的是稀释涂布平板法,该方法可用于微生物分离和活菌计数,C正确;步骤④中,如果菌落周围出现红色区域,则说明含有富硒细菌,D正确。
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6.(苏教版选择性必修3 P15“正文内容”拓展挖掘)某实验小组利用滤膜法检测饮料中微生物的数量,原理是将待测样品通过微孔滤膜过滤富集后,再将滤膜置于培养基上培养,根据滤膜上的菌落数推算出样品中微生物的数量。过程如图所示。下列说法错误的是 (　　)
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A.实验用到滤膜和水样都需要提前灭菌处理
B.应选取菌落数为30~300的平板进行计数
C.统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少
D.滤膜孔径过大可能导致平板上长不出菌落
解析:实验用到滤膜需要提前灭菌处理,水样不能灭菌,A错误;对微生物进行计数时,为了保证结果准确,通常选择菌落数在30~300的平板进行计数,B正确;当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,导致统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少,C正确;滤膜孔径过大,微生物可能没有被过滤出来,因而可能导致平板上长不出菌落,D正确。
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7.(2025·合肥模拟)大肠杆菌能在基本培养基上生长,X射线照射后产生的大肠杆菌不能在基本培养基上生长,但可以在完全培养基上生长。夹层培养法多用于营养缺陷型菌株的筛选,其具体操作是先在培养皿底倒一薄层已灭菌的基本培养基;待冷凝后,再添加一层内含菌液(经过X射线处理)的基本培养基;冷凝后再加一薄层的基本培养基。培养一段时间后,对首次出现的菌落做好标记;然后再加一层完全培养基,经培养后会长出形态不一的菌落(如图所示)。下列说法错误的是 (　　)
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A.X射线可能诱发基因突变导致大肠杆菌营养缺陷
B.夹层培养法不适用于对需氧型微生物进行筛选
C.首次出现的菌落做标记时,应在皿盖上做标记
D.最后培养基上形态较小的菌落可能是营养缺陷型菌株
解析:X射线可能诱发基因突变导致大肠杆菌营养缺陷,A正确;夹层培养法菌株生长在两层培养基之间,氧气较少,不适用于对需氧型微生物进行筛选,B正确;首次出现的菌落做标记时应标记在皿底,防止皿盖位置变化或拿错等,C错误;营养缺陷型菌株在基本培养基不能生长,只有后期加入完全培养基后才能生长,形态较小,D正确。
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8.(2025·长沙模拟)纸片扩散法是药敏实验中常用的方法。取少量大肠杆菌培养液,均匀涂在培养基上,再放上4片含有不同浓度链霉素(抗生素)的圆形滤纸,然后在无菌、适宜条件培养12~16 h,滤纸片周围出现抑菌圈。下列叙述正确的是 (　　)
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A.接种后的平板在培养时的放置应如图1中的②所示
B.Ⅳ纸片上抗生素抑菌效果最好,其上多个菌落均具有链霉素抗性
C.若将链霉素换成青霉素进行以上实验,则Ⅳ号纸片上仍会出现相应菌落
D.在图示实验中的固体培养基上可用平板划线法或稀释涂布平板法接种微生物
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解析:利用固体培养基培养微生物时,应将平板进行倒置培养,如图1中的①,A错误；据图可知,图2中Ⅳ号纸片上抑菌圈最大,该浓度链霉素的抑菌效果较好,抑菌圈中出现菌落,说明这些菌种具有链霉素抗性,B正确；图2中Ⅳ号纸片上,抑菌圈中的菌种具有链霉素抗性,可能不具有青霉素的抗性,将链霉素换成青霉素进行上述实验,则Ⅳ号纸片上的区域可能不会出现相应的菌落,C错误；在图示实验中的固体培养基上可用稀释涂布平板法接种微生物,使微生物均匀分布在培养基上,D错误。
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9.(2025·盐城模拟)农杆菌是植物基因工程中常用到的一种细菌,下表为用来培养农杆菌的LB培养基配方,下图是对培养的农杆菌进行菌落计数。下列相关叙述错误的是 (　　)
胰蛋白胨 10.0 g
酵母浸粉 5.0 g
NaCl 10.0 g
蒸馏水 1 L
配制完成后,将pH调至7.0
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A.图中计数农杆菌所用的培养基是固体培养基
B.b、c、d中接种农杆菌的常用工具是涂布器
C.LB培养基中胰蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源
D.若b、c、d中菌落数分别为48、57、60,则在a中农杆菌的密度约为5.5×105个/mL
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解析:对菌落计数使用的是固体培养基,A正确;b、c、d中使用的接种方法为稀释涂布平板法,所用的接种工具为涂布器,B正确;微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐,该培养基中胰蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源,C正确;图中细菌稀释了106倍,若b、c、d中菌落数分别为48、57、60,则在a中农杆菌的密度约为(48+57+60)÷3÷1×106=5.5×107(个/mL),D错误。
二、非选择题(除特别注明外,每空1分)
10.(14分)(2025·沈阳模拟)链格孢菌可导致烟草赤星病的发生。研究人员在烟草根部土壤中分离纯化出芽孢杆菌L,发现其对链格孢菌有抑制作用。
(1)称取烟草根部土样加入________制成悬液,接种在______ (物理性质)培养基上培养,挑取不同形态的菌落,筛选出对链格孢菌有抑制作用的芽孢杆菌L,上述微生物培养基中的氮源可用于微生物细胞内____________________________(至少两种)等物质的合成。
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无菌水
固体
蛋白质、核酸、ATP、磷脂
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解析:称取烟草根部土样加入无菌水制成悬液,接种在固体培养基上培养,挑取不同形态的菌落,筛选出对链格孢菌有抑制作用的芽孢杆菌L,上述微生物培养基中的氮源可用于微生物细胞内蛋白质、核酸、ATP、磷脂等物质的合成。
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(2)为探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理,实验组将芽孢杆菌L接种在A1平板上,B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落,把两个培养皿对扣,菌株无接触,5 d后观察菌株生长情况,结果如图。
①将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是________________。
解析:将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是平板划线法。
平板划线法　
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②对照组处理为A2平板____________________________,B2平板____________________________________。
解析:实验目的是探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理,根据实验遵循单一变量原则的要求,A1平板接种芽孢杆菌L,则A2平板不接种微生物(接种无菌水);B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落,则B2平板中央也应接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落。
不接种微生物(接种无菌水)
中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落
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③根据实验结果推测,芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理是______
________________________________________________(2分)。
解析:实验组两培养皿中菌株无接触,对照组链格孢菌菌落直径明显大于实验组,据此可推测芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长。
芽孢
杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长
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(3)除上述原因外,研究人员认为芽孢杆菌L的发酵液中可能也存在抑制链格孢菌生长的物质。他们将芽孢杆菌L发酵液离心后,取上清液过滤,获得无菌滤液进行如下实验:
组别 实验处理 接种 检测
甲组 _____ 将直径为0.5 cm的链格孢菌菌落接种在平板中心,在恒温培养箱内培养 测量b,计算抑菌率
乙组 无菌水+固体培养基
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请补充完善该实验方案,a为__________________________,b为____
_____________________。(4分)
解析:实验的目的是探究芽孢杆菌L的发酵液中是否存在抑制链格孢菌生长的物质,根据实验遵循单一变量原则的要求,a为无菌滤液+固体培养基。因变量为抑菌率,则实验中要测量甲、乙组中链格孢菌的菌落直径,以计算抑菌率。
链格孢菌的菌落直径
无菌滤液+固体培养基
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(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治,还需研究哪些问题 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　______________________________________________________________________________________________(答出一点即可,2分)。
解析:若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治,还要考虑芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量;芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期;芽孢杆菌L对烟草生长的影响等。

芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量;芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期;芽孢杆菌L对烟草生长的影响等课时跟踪检测(五十四)　微生物的培养技术及应用
一、选择题
1.某同学为了在实验室富集某种圆褐固氮菌(一种异养型微生物),通过查阅资料配制了成分及浓度如下的培养基。下列叙述正确的是 (　　)
成分 甘露醇 KH2PO4 MgSO4· 7H2O NaCl CaSO4· 2H2O
浓度 (质量 分数) 1% 0.02% 0.02% 0.02% 0.01%
A.该培养基中需添加碳源不需要添加氮源
B.该培养基还需要添加琼脂,便于菌种富集
C.培养基灭菌时,采用的是湿热灭菌法中的沸水灭菌法
D.灭菌后待培养基冷却至50 ℃左右时,可以通过滴加酸或碱来调节培养基的pH
2.(2025·营口模拟)乳糖不耐受患者肠道内的乳糖无法被身体吸收利用,进而被大肠内的部分菌群利用,其代谢产物包含较多气体和酸类物质,导致身体不适,如腹胀和腹泻。下列相关叙述不合理的是 (　　)
A.患者消化道内缺乏乳糖酶
B.乳糖为肠道菌群提供氮源
C.患者肠道内分泌液增多导致出现腹泻
D.乳糖耐受和不耐受属于相对性状
3.(2025·长春模拟)高压蒸汽条件下持续20分钟会杀死芽孢,因此无菌操作中可利用非致病性的嗜热脂肪杆菌的芽孢作为指示菌来测定灭菌的效果。灭菌结束后在塑料瓶外挤破含有培养液的安瓿瓶,使嗜热脂肪杆菌菌片浸没在紫色培养液内并进行培养,如图所示。若芽孢可以生长会使培养液变为黄色。下列叙述正确的是 (　　)
A.嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性强,高压蒸汽灭菌不能杀死它
B.灭菌后挤破安瓿瓶,一段时间后培养液呈紫色说明灭菌彻底
C.含有嗜热脂肪杆菌菌片的培养液从功能上属于选择培养基
D.设置不灭菌的对照组,挤破安瓿瓶颜色不变说明结果可信
4.(2025·珠海一模)肺炎支原体的药敏实验中,将蘸有相同浓度的阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素的圆形滤纸片放置于平板不同位置。培养一段时间后,平板上出现的抑菌圈情况如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.支原体与病毒的根本区别是细胞内无核糖体
B.可依据菌落特征判断病人是否有支原体感染
C.“ ”处作为对照组,圆形滤纸片上滴加蒸馏水
D.阿奇霉素抑制支原体增殖效果比克拉霉素好
5.(2025·南通模拟)亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用,土壤中的富硒细菌可将其还原为红色单质硒,如图为土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程,①~⑤为相应步骤。下列相关叙述错误的是 (　　)
A.培养富硒细菌时,培养基应调至酸性并添加维生素
B.步骤①中的培养基可进行高压蒸汽灭菌,对吸管、培养皿等可采用干热灭菌
C.步骤②→③采用的是稀释涂布平板法,该方法可用于微生物分离和活菌计数
D.步骤④中可以根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选
6.(苏教版选择性必修3 P15“正文内容”拓展挖掘)某实验小组利用滤膜法检测饮料中微生物的数量,原理是将待测样品通过微孔滤膜过滤富集后,再将滤膜置于培养基上培养,根据滤膜上的菌落数推算出样品中微生物的数量。过程如图所示。下列说法错误的是 (　　)
A.实验用到滤膜和水样都需要提前灭菌处理
B.应选取菌落数为30~300的平板进行计数
C.统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少
D.滤膜孔径过大可能导致平板上长不出菌落
7.(2025·合肥模拟)大肠杆菌能在基本培养基上生长,X射线照射后产生的大肠杆菌不能在基本培养基上生长,但可以在完全培养基上生长。夹层培养法多用于营养缺陷型菌株的筛选,其具体操作是先在培养皿底倒一薄层已灭菌的基本培养基;待冷凝后,再添加一层内含菌液(经过X射线处理)的基本培养基;冷凝后再加一薄层的基本培养基。培养一段时间后,对首次出现的菌落做好标记;然后再加一层完全培养基,经培养后会长出形态不一的菌落(如图所示)。下列说法错误的是 (　　)
A.X射线可能诱发基因突变导致大肠杆菌营养缺陷
B.夹层培养法不适用于对需氧型微生物进行筛选
C.首次出现的菌落做标记时,应在皿盖上做标记
D.最后培养基上形态较小的菌落可能是营养缺陷型菌株
8.(2025·长沙模拟)纸片扩散法是药敏实验中常用的方法。取少量大肠杆菌培养液,均匀涂在培养基上,再放上4片含有不同浓度链霉素(抗生素)的圆形滤纸,然后在无菌、适宜条件培养12~16 h,滤纸片周围出现抑菌圈。下列叙述正确的是 (　　)
A.接种后的平板在培养时的放置应如图1中的②所示
B.Ⅳ纸片上抗生素抑菌效果最好,其上多个菌落均具有链霉素抗性
C.若将链霉素换成青霉素进行以上实验,则Ⅳ号纸片上仍会出现相应菌落
D.在图示实验中的固体培养基上可用平板划线法或稀释涂布平板法接种微生物
9.(2025·盐城模拟)农杆菌是植物基因工程中常用到的一种细菌,下表为用来培养农杆菌的LB培养基配方,下图是对培养的农杆菌进行菌落计数。下列相关叙述错误的是 (　　)
胰蛋白胨 10.0 g
酵母浸粉 5.0 g
NaCl 10.0 g
蒸馏水 1 L
配制完成后,将pH调至7.0
A.图中计数农杆菌所用的培养基是固体培养基
B.b、c、d中接种农杆菌的常用工具是涂布器
C.LB培养基中胰蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源
D.若b、c、d中菌落数分别为48、57、60,则在a中农杆菌的密度约为5.5×105个/mL
二、非选择题(除特别注明外,每空1分)
10.(14分)(2025·沈阳模拟)链格孢菌可导致烟草赤星病的发生。研究人员在烟草根部土壤中分离纯化出芽孢杆菌L,发现其对链格孢菌有抑制作用。
(1)称取烟草根部土样加入　　　　制成悬液,接种在　　　　(物理性质)培养基上培养,挑取不同形态的菌落,筛选出对链格孢菌有抑制作用的芽孢杆菌L,上述微生物培养基中的氮源可用于微生物细胞内　　　　　　　　(至少两种)等物质的合成。
(2)为探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理,实验组将芽孢杆菌L接种在A1平板上,B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落,把两个培养皿对扣,菌株无接触,5 d后观察菌株生长情况,结果如图。
①将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是　　　　。
②对照组处理为A2平板　　　　　　　　　　,B2平板　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　。
③根据实验结果推测,芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理是　　　　　　　　　　　　(2分)。
(3)除上述原因外,研究人员认为芽孢杆菌L的发酵液中可能也存在抑制链格孢菌生长的物质。他们将芽孢杆菌L发酵液离心后,取上清液过滤,获得无菌滤液进行如下实验:
组别 实验处理 接种 检测
甲组 a 将直径为0.5 cm的链格孢菌菌落接种在平板中心,在恒温培养箱内培养 测量b,计算抑菌率
乙组 无菌水+ 固体培养基
请补充完善该实验方案,a为　　　 　　　　　,b为　　　　　　　　　　　。(4分)
(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治,还需研究哪些问题 　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
(答出一点即可,2分)。
课时跟踪检测(五十四)
1．选A　圆褐固氮菌是一种异养型微生物，因此培养基中需添加碳源(甘露醇)，圆褐固氮菌能固氮，可以将空气中的氮作为氮源，因此不需要添加氮源，A正确；菌种富集必须用液体培养基，不能添加琼脂，B错误；培养基灭菌时，采用的是湿热灭菌法中的高压蒸汽灭菌法，C错误；调节pH需在培养基灭菌前进行，D错误。
2．选B　患者消化道内缺乏乳糖酶，因而无法将肠道内的乳糖水解，A正确；乳糖的元素组成为C、H、O，不含N，无法为肠道菌群提供氮源，B错误；腹泻的原因是乳糖不耐受患者饮用牛奶等含乳糖饮料后乳糖在体内无法被乳糖酶分解后吸收，一方面增加了小肠内的渗透压，水分向肠道内渗透，产生腹泻症状，另一方面乳糖在细菌作用下分解产生其他代谢物，进而引起腹泻的症状，C正确；乳糖耐受和不耐受是同一性状的不同表现形式，属于相对性状，D正确。
3．选B　嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性较普通杂菌强，但高压蒸汽灭菌仍能杀死它，A错误；由题意可知，灭菌后挤破安瓿瓶，一段时间后培养液呈紫色说明灭菌彻底，B正确；含有嗜热脂肪杆菌菌片的培养液从功能上属于鉴别培养基，C错误；设置不灭菌的对照组，挤破安瓿瓶颜色变说明结果可信，D错误。
4．选B　支原体是原核细胞，有细胞结构，病毒无细胞结构，因此支原体与病毒的根本区别是有无细胞结构，A错误；支原体可在培养基上生存，可依据菌落特征判断病人是否有支原体感染，B正确；除实验中的三种抗生素组别外还需要设置空白对照组，故“？”处放置的是蘸有无菌水的圆形滤纸片，C错误；图示三个滤纸片中，克拉霉素对应的抑菌圈比阿奇霉素大，说明克拉霉素抑制效果比阿奇霉素好，D错误。
5．选A　培养细菌时，培养基应该调至中性或弱碱性，且培养某些细菌(如乳酸杆菌)时才需要在培养基中添加维生素，A错误；获得纯净培养物的关键是没有杂菌污染，培养基需要灭菌但又需保持其中水分，因此可用高压蒸汽灭菌，吸管、培养皿等需要保持干燥，可用干热灭菌，B正确；步骤②→③采用的是稀释涂布平板法，该方法可用于微生物分离和活菌计数，C正确；步骤④中，如果菌落周围出现红色区域，则说明含有富硒细菌，D正确。
6．选A　实验用到滤膜需要提前灭菌处理，水样不能灭菌，A错误；对微生物进行计数时，为了保证结果准确，通常选择菌落数在30～300的平板进行计数，B正确；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，导致统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少，C正确；滤膜孔径过大，微生物可能没有被过滤出来，因而可能导致平板上长不出菌落，D正确。
7．选C　X射线可能诱发基因突变导致大肠杆菌营养缺陷，A正确；夹层培养法菌株生长在两层培养基之间，氧气较少，不适用于对需氧型微生物进行筛选，B正确；首次出现的菌落做标记时应标记在皿底，防止皿盖位置变化或拿错等，C错误；营养缺陷型菌株在基本培养基不能生长，只有后期加入完全培养基后才能生长，形态较小，D正确。
8．选B　利用固体培养基培养微生物时，应将平板进行倒置培养，如图1中的①，A错误；据图可知，图2中Ⅳ号纸片上抑菌圈最大，该浓度链霉素的抑菌效果较好，抑菌圈中出现菌落，说明这些菌种具有链霉素抗性，B正确；图2中Ⅳ号纸片上，抑菌圈中的菌种具有链霉素抗性，可能不具有青霉素的抗性，将链霉素换成青霉素进行上述实验，则Ⅳ号纸片上的区域可能不会出现相应的菌落，C错误；在图示实验中的固体培养基上可用稀释涂布平板法接种微生物，使微生物均匀分布在培养基上，D错误。
9．选D　对菌落计数使用的是固体培养基，A正确；b、c、d中使用的接种方法为稀释涂布平板法，所用的接种工具为涂布器，B正确；微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，该培养基中胰蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源，C正确；图中细菌稀释了106倍，若b、c、d中菌落数分别为48、57、60，则在a中农杆菌的密度约为(48＋57＋60)÷3÷1×106＝5.5×107(个/mL)，D错误。
10．解析：(1)称取烟草根部土样加入无菌水制成悬液，接种在固体培养基上培养，挑取不同形态的菌落，筛选出对链格孢菌有抑制作用的芽孢杆菌L，上述微生物培养基中的氮源可用于微生物细胞内蛋白质、核酸、ATP、磷脂等物质的合成。
(2)①将芽孢杆菌L接种在A1平板上的方法是平板划线法。②实验目的是探究芽孢杆菌L抑制链格孢菌生长的原理，根据实验遵循单一变量原则的要求，A1平板接种芽孢杆菌L，则A2平板不接种微生物(接种无菌水)；B1平板中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落，则B2平板中央也应接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落。③实验组两培养皿中菌株无接触，对照组链格孢菌菌落直径明显大于实验组，据此可推测芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长。
(3)实验的目的是探究芽孢杆菌L的发酵液中是否存在抑制链格孢菌生长的物质，根据实验遵循单一变量原则的要求，a为无菌滤液＋固体培养基。因变量为抑菌率，则实验中要测量甲、乙组中链格孢菌的菌落直径，以计算抑菌率。
(4)若将芽孢杆菌L用于烟草赤星病的生物防治，还要考虑芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量；芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期；芽孢杆菌L对烟草生长的影响等。
答案：(1)无菌水　固体　蛋白质、核酸、ATP、磷脂　(2)①平板划线法　②不接种微生物(接种无菌水)　中央接种直径为0.5 cm的链格孢菌菌落　③芽孢杆菌L可能产生某种挥发性物质抑制链格孢菌的生长　(3)无菌滤液＋固体培养基　链格孢菌的菌落直径　(4)芽孢杆菌L用于生物防治的最适剂量；芽孢杆菌L用于生物防治的合适时期；芽孢杆菌L对烟草生长的影响等

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