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(共66张PPT)
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主题研习（三）
主题研习（四）
DNA片段的扩增与电泳鉴定及蛋白质工程
课时跟踪检测
生物技术的安全性与伦理问题
主题研习（三）DNA片段的扩增与电泳鉴 定及蛋白质工程
(一)DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验基础
基础全面落实
PCR原理 利用了__________________原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合
电泳 DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷_________的电极移动,这个过程就是电泳
产物鉴定 PCR的产物一般通过_________________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的______________等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为______ nm的紫外灯下被检测出来
DNA的热变性
相反
琼脂糖凝胶电泳
大小和构象
300
2.PCR实验操作步骤和电泳鉴定
微量移液器
离心管
底部
凝胶边缘
3.DNA片段的扩增及电泳鉴定注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行灭菌处理。
(2)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。
(3)观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
4.DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱分析
(1)线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子大小成__________,分子越大则所受阻力越大,也越难在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢,随着时间的推移,不同大小的DNA分子就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。
反比
(2)将待测样品电泳条带与Marker(已知长度的DNA片段)进行对比,即可知道待测样品中DNA片段的长度,其中条带的宽度反映了_____
____________。如下图所示:几个待测样品中DNA片段长度基本一致,约为750 bp,其中F2样品中DNA含量最少。
DNA
含量的多少
(二)蛋白质工程的原理和应用
1.蛋白质工程的概念
2.蛋白质工程的基本思路
蛋白质结构
氨基酸序列
苷酸序列
脱氧核
3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
实质不同 蛋白质工程是定向改造或生产人类所需的蛋白质;基因工程是定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的类型或生物产品
过程不同 参见相应的知识梳理内容(略)
结果不同 蛋白质工程可生产自然界没有的蛋白质;基因工程只能生产自然界已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程;基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢。 ( )
(2)将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸,B链末端增加2个精氨酸,可制备出一种人工长效胰岛素。该胰岛素可通过蛋白质工程方法生产。 ( )
(3)利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。加入连接肽需要通过改造基因实现。 ( )
(4)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份,并在20 ℃条件下储存。 ( )
√
×
√
×
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P84“探究·实践”拓展分析)①DNA片段电泳鉴定的原理是______________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
DNA分子在一定的pH下带负电,在电场力的驱动下,从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中移动;核酸染料带正电,在电场力的驱动下,从正极向负极运动,遇到DNA就嵌入其中完成染色,这个颜色在可见光下看不到,但经紫外光激发可被检测出来
②电泳鉴定时出现非特异性条带的原因可能有________________
____________________________________________________________
_______________________________________________。
(2)(人教版选择性必修3 P96“到社会中去”思考)酶制剂的生产已经形成新兴产业,蛋白质工程在酶制剂产业中的作用是________________
_____________________________________________________________________。
模板DNA出现污染;Taq DNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;PCR循环次数过多等
对酶进行改良和优化,以提高酶的稳定性、活性和特异性,从而提高酶制剂的效果和经济性
题点(一)　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.(2024·黑吉辽高考)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
考向精细研究
√
解析:琼脂糖凝胶的浓度、待测样品中DNA分子的大小和构象等都会影响DNA分子在电泳中的迁移速率,故琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小,A正确;在电泳过程中,凝胶载样缓冲液中的指示剂不会与DNA结合,而是随着电流的通过而移动,可用于确定样品的迁移方向和距离,不能用于指示DNA分子的具体位置,B错误;在同一电场作用下,DNA片段越长,即DNA相对分子质量越大,迁移速率越慢,C错误;琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。
2. (2024·湖南高考，改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.上述PCR反应体系中需加入两种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢
C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
√
解析:利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A错误。电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。
题点(二)　蛋白质工程的原理和应用
3.(2024·韶关二模)科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素(一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质)第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸,显著提高了它的抗凝血活性,流程图如下。已知天冬酰胺对应的密码子为AAU、AAC,赖氨酸对应的密码子为AAA、AAG。下列叙述错误的是(　　)
A.上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B.在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C.上图中大分子物质a和b的单体序列均是唯一的
D.用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
√
解析:通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构,进而明确氨基酸序列,最终确定基因中碱基对的排列顺序,A正确;蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因,B正确;由于天冬酰胺和赖氨酸对应的密码子均不是唯一的,则大分子物质a和b的单体序列均不是唯一的,C错误;基因工程是利用已有的基因生产蛋白质,而蛋白质工程师通过改造或合成基因从而获得原本没有的蛋白质,因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质,D正确。
主题研习（四）生物技术的安全性与伦理问题
基础全面落实
(一)转基因产品的安全性
(二)关注生殖性克隆人
1.治疗性克隆和生殖性克隆的比较
项目 治疗性克隆 生殖性克隆
概念 利用克隆技术产_______________________,用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官,从而达到____________的目的 通过克隆技术产生独立生存的新个体
目的 用于医学研究或治疗疾病 用于生育,产生新个体
水平 ________水平、组织水平或器官水平 个体水平
联系 都属于无性生殖,产生的新个体或新组织的核遗传物质均不发生变化
特定的细胞、组织和器官
治疗疾病
细胞
2.生殖性克隆人面临的伦理问题
(1)生殖性克隆人“有违人类尊严”。
(2)生殖性克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人。
(3)克隆技术还不成熟,生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题。
3.生殖性克隆与治疗性克隆的主要过程
(三)试管婴儿与设计试管婴儿的异同点
不同点 技术手段 设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断HLA的类型等),试管婴儿不需进行遗传学诊断。如下图,设计试管婴儿比试管婴儿多了d过程:
应用 试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题,设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗
相同点 都是体外受精,并进行体外早期胚胎培养,都要经过胚胎移植,都是有性生殖
(四)生物武器
种类 ①致病菌类:炭疽杆菌、霍乱弧菌等
②病毒类:天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等
③__________类:肉毒杆菌毒素等
特点 致病能力_____,攻击范围_____
散布途径 可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布,经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内,造成大规模伤亡,也能大量损害植物
生化毒剂
强
广
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)转基因品种经检测含有目的基因后即可上市。 ( )
(2)“设计试管婴儿”与“试管婴儿”相比,前者在胚胎移植前需要对胚胎进行遗传学诊断。 ( )
(3)我国反对生物武器,但在特殊情况下可以生产生物武器。 ( )
(4)若转基因植物的外源基因来源于自然界,则不会存在安全性问题。 ( )
×
√
×
×
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P106“正文”发掘)生殖性克隆与治疗性克隆最主要的区别是____________________________________________
___________________________________________________________。
(2)(人教版选择性必修3 P113“正文”发掘)对待生物武器的态度与对待转基因产品安全性的态度的不同是__________________________
____________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
克隆的目的不同,生殖性克隆的目的是用于生育,产生新个体;治疗性克隆的目的是用于医学研究或治疗人类疾病
对待生物武器的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器,并反对生物武器及其技术和设备的扩散;对待转基因产品安全性的态度是趋利避害,而不能因噎废食
考向精细研究
题点(一)　生物技术的安全性
1.(2025·张掖模拟)“某生物实验室感染病毒的小白鼠逃了”曾登上热搜,使得生物技术的安全性问题再次引发关注。下列叙述错误的是(　　)
A.对实验生物应该进行严格闭环管理
B.通过治疗性克隆,可以解决人体移植器官短缺问题
C.生物武器种类多样,包括病毒类、毒品类、致病菌类等
D.生物安全防控应消除生物武器威胁、防止生物武器及其技术和设备扩散
√
解析:实验生物可能导致直接接触者被病毒感染,故对实验生物应该进行严格闭环管理,A正确;治疗性克隆是指将患者的细胞诱导成特定的细胞、组织和器官,用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官,通过治疗性克隆,可以解决人体移植器官短缺问题,B正确;生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等,不包括毒品类,C错误;消除生物武器威胁、防止生物武器及其技术和设备扩散,是生物安全防控的重要方面,D正确。
2.(2025·安庆一模)下列关于转基因生物安全性的叙述,正确的是 (　　)
A.转基因作物种植区应与传统农业种植区混合
B.转基因作物被动物食用后,目的基因会转入动物体细胞中
C.种植转基因作物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性
D.以转基因大豆为原料制成的大豆油在销售时无须标注“转基因大豆”
√
解析:若转基因作物种植区与传统农业种植区混合,容易导致基因扩散,可能会影响野生植物的基因库,从而改变野生植物的遗传多样性,A错误,C正确;转基因作物被动物食用后,相关基因会被分解成核苷酸,因此不会转入动物体细胞中,B错误;以转基因大豆为原料制成的大豆油在销售时需要标注为“转基因大豆加工品(制成品)”或“加工原料为转基因大豆”,D错误。
题点(二)　治疗性克隆与生殖性克隆
3.(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述正确的是(　　)
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.治疗性克隆不需要监控和审查
C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
√
解析:试管婴儿属于有性生殖,合理范围内,试管婴儿技术是可以使用的,A错误;治疗性克隆要在严格监管下进行,B错误;生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题,C错误。
4.(2025·哈尔滨模拟)治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥反应具有重要意义。流程如图所示。下列相关叙述正确的是 (　　)
A.核移植过程中需对卵母细胞去核,这里的“核”是指纺锤体—染色体复合物
B.将图中获得的组织器官移植给个体A,则基本不会发生免疫排斥反应
C.体细胞在体外培养时需要提供适量CO2,作为体液因子调节呼吸运动
D.治疗性克隆过程不产生独立生存的新个体,不存在任何伦理道德问题
√
解析:核移植过程中需对处于减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞去核,这里的“核”其实是纺锤体—染色体复合物,A正确;将图中获得的组织器官移植给个体B,则基本不会发生免疫排斥反应,B错误;体细胞在体外培养时需要提供适量CO2,CO2的主要作用是维持培养液的pH,C错误;治疗性克隆也会面临伦理问题,D错误。
课时跟踪检测
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对应主题研习(三)(四)
一、选择题
1.下列关于凝胶电泳实验操作,叙述错误的是(　　)
A.加样孔应靠近负极端,以便带负电的DNA分子向正极移动
B.接通电源后电泳一段时间,离加样孔越近的DNA分子越小
C.紫外灯照射下,凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关
D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
√
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解析:若DNA分子带负电,则靠近加样孔的一端为负极,接通电源,带负电的DNA分子向正极移动而使不同DNA逐渐分离,A正确;相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率,DNA片段相对分子质量越大,迁移就越慢,分子量越小,迁移速度越快,电泳一段时间,离加样孔越近的DNA分子迁移越慢,分子量越大,B错误;为了便于对分离后的DNA片段进行检测,在凝胶制备中加入核酸染料,能够与DNA分子结合发荧光,DNA含量越多,荧光强度越强,即凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关,C正确;点样时应在样品中加入指示剂,根据指示剂泳动的位置判断是否停止电泳,D正确。
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2.(2025·哈尔滨模拟)PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,下列相关叙述错误的是(　　)
A.带负电的DNA分子在电泳时由负极向正极移动
B.在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关
C.PCR反应体系中只需添加Mg2+、引物、模板、Taq DNA聚合酶
D.采用PCR技术对一个DNA进行扩增,若每个DNA分子的每条链都做模板,则第n次循环共需要引物2n个
√
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解析: 在电场的作用下,带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,故带负电的DNA分子在电泳时由负极向正极移动,A正确;在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,B正确;PCR反应的缓冲液中需添加Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶、模板、4种脱氧核苷酸、缓冲液、无菌水等,C错误;一个DNA分子有两条链,第n次复制形成2n个DNA,相当于新合成2n-1个DNA分子,合成一个DNA分子需要两个引物,因此需要的引物数目为2n-1×2=2n(个),D正确。
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3.为了制定出控制转基因大豆向野生大豆基因漂移的安全管理措施,以下不能作为评估风险程度依据的是 (　　)
A.转基因大豆与野生大豆的地理分布
B.转基因大豆与野生物种间的亲缘关系
C.野生大豆所含主要蛋白质种类及含量
D.传粉昆虫的种类、数量及生活习性
√
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解析:转基因大豆与野生大豆的地理分布的远近与转基因大豆和野生大豆的基因交流有关,A不符合题意;转基因作物与近缘野生种间发生基因交流,进而发生基因漂移,使一些近缘物种表现出转基因的性状,B不符合题意;野生大豆的蛋白质含量只与野生大豆的营养物质有关,C符合题意;传粉昆虫的种类、数量及生活习性与野生大豆和转基因大豆之间的传粉和基因交流有关,D不符合题意。
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4.(2025·白山模拟)生物技术是以现代生命科学理论为基础,在个体、细胞及分子水平上研究及制造产品或改造动物、植物、微生物等,并使其具有所期望的品质和特性。下列叙述错误的是 (　　)
A.干细胞培养在临床医学等领域前景广泛,但也可能面临安全性问题
B.蛋白质工程是在基因操作水平上改造或创造新的蛋白质
C.治疗性克隆的研究与应用必须受到相应法律法规的规范限制
D.生物武器主要影响人畜健康,对植物的影响不大
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解析:干细胞培养在临床医学等领域前景广泛,但也可能存在安全性问题,A正确;蛋白质工程通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质或创造新的蛋白质,B正确;治疗性克隆的研究与应用必须受到相应法律法规的规范限制,C正确;生物武器对人畜、植物等均可能造成重大伤害,D错误。
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5.地球上纤维素含量丰富,其酶解产物利用广泛,但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等,导致生产成本过高以至于影响了其实际应用,采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述错误的是 (　　)
A.通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作
B.与基因工程相比,通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶
C.设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤
D.改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列,实现纤维素酶功能的改变
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解析:蛋白质工程就是通过改造或合成基因,对现有蛋白质进行改造或合成新蛋白,需要对基因进行操作,A错误。
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6.(2025·南昌模拟)萤火虫的荧光素酶能催化ATP激活的荧光素氧化发光,这一现象在生物检测和成像方面有重要的应用价值。为了解决天然荧光素酶不能高效催化人工合成的荧光素DTZ发光的问题,研究人员采用蛋白质工程(又称为第二代基因工程)对它进行了改造。下列关于改造天然荧光素酶的叙述,正确的是 (　　)
A.通过化学诱变剂可定向改造天然荧光素酶的基因序列
B.改造天然荧光素酶所用的基因表达载体不需要启动子和终止子
C.可用PCR方法检测突变的荧光素酶基因是否翻译成蛋白质
D.改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能
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解析:通过化学诱变剂可以让天然荧光素酶的基因发生突变,基因突变是不定向的,A错误;改造天然荧光素酶所用的基因表达载体必须包含启动子和终止子,启动子启动基因转录,而终止子使转录终止,B错误;检测目的基因是否翻译为蛋白质的方法为抗原—抗体杂交法,C错误;改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能,D正确。
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7.(2025·哈尔滨模拟)人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟,产生巨大生产力的同时,也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述正确的是 (　　)
A.如果确实有证据表明某种转基因食品有害,就应该禁止转基因技术的应用
B.利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性,其原因之一是人体不会对它们产生免疫反应
C.试管婴儿技术已经成熟,移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造
D.科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中,可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性,从而防止转基因花粉传播造成基因污染
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解析:转基因技术本身是中性的,如果确实有证据表明某种转基因食品有害,就应该禁止产品的使用,不应该禁止转基因技术的应用,A错误;转基因技术制造的新型致病菌,致病能力和传染能力以及抗药能力等大幅度增加,因而导致具有极大的危害性,B错误;试管婴儿技术已经成熟,移植前可对胚胎进行遗传学诊断,不涉及基因改造,C错误;科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中,可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性,不参与受精作用,从而防止转基因花粉传播造成基因污染,D正确。
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8.(2025·三明模拟)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。下列叙述错误的是 (　　)
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A.水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关
B.酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露
C.要获得水蛭素的基因,可以从水蛭细胞中提取mRNA,经逆转录获得目的基因
D.上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构
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解析:两种酶水解水蛭蛋白后,肽含量比较接近,而抗凝血活性差距较大,说明抗凝血活性与肽含量关联不大,A错误;酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性先上升后相对稳定,由此推测酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露,B正确;为了获得水蛭素基因,可以从细胞中提取水蛭素基因转录的mRNA,经逆转录获取目的基因,C正确;题述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构,D正确。
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9.(2025·昆明模拟)每出生5 000名婴儿就约有1人患有线粒体有害突变引起的疾病,可通过如下技术培育“三亲婴儿”,实现线粒体替代疗法阻断线粒体病的遗传,但这是一个充满了争议的技术。据此推测正确的是 (　　)
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A.该技术涉及动物细胞核移植、动物细胞培养、体外受精等技术
B.利用该技术培育“三亲婴儿”属于无性生殖
C.卵母细胞捐赠者携带的红绿色盲基因能遗传给“三亲婴儿”
D.此技术之所以存在较大争议仅仅是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲和卵母细胞捐赠者的部分基因的伦理问题
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解析:据图可知,该技术涉及动物细胞核移植、动物细胞培养、体外受精、胚胎移植等技术,A正确;该技术存在精子和换核后的卵细胞的融合过程,属于有性生殖,B错误;卵母细胞捐献者提供的是细胞质,而红绿色盲基因位于细胞核内的染色体上,因此卵母细胞捐赠者携带的红绿色盲基因不能遗传给“三亲婴儿”,C错误;此技术之所以存在较大争议不仅是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲和卵母细胞捐赠者的部分基因的伦理问题,还存在技术尚不完备、仍需要更充足的检验等原因,D错误。
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二、非选择题(除特别注明外,每空2分)
10.(11分)(2025·天津一模)人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的基因工程t-PA会诱发颅内出血。研究证实,将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。
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右图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图
(图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用
来扩增突变位点及其上游DNA序列,
引物c、d用来扩增突变位点及其下游
DNA序列)。请回答下列问题:
7
(1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优异的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于________________(1分)范畴。
解析:由题干信息可知,题述生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造,然后在大肠杆菌中表达改造后的基因,可得到性能优异的t-PA蛋白,因此属于蛋白质工程。
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蛋白质工程
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(2)获得性能优异的t-PA突变蛋白的正确顺序是___________。
①t-PA蛋白功能分析和结构设计
②借助定点突变改造t-PA基因序列
③检验t-PA蛋白的结构和功能
④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列
⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白
①④②⑤③　
7
解析:蛋白质工程的一般过程是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质,故获得性能优异的t-PA突变蛋白的正确顺序是①t-PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t-PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白→③检验t-PA蛋白的结构和功能。
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(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基,引物b中该突变位点的碱基是____。
G
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解析:已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,则半胱氨酸的密码子为UGU,而丝氨酸的密码子是UCU,由此可知,若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA,图中显示引物b与t-PA基因的下链互补,故其中相应部位的碱基与上链相同,即该部位的碱基是G。
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(4)据图可知,重叠延伸后,进行PCR需要的引物是________________,引物的作用是_______________________________________________。
解析:由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3'端延伸DNA链,因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸,引物需要与模板的3'端结合,故据图可知,重叠延伸后,为扩增完整的序列,需要引物a和d;DNA聚合酶不能从头合成DNA,只能从引物的3'端开始延伸DNA链,因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。

引物a和引物d　
使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
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(5)若获得的t-PA突变基因如图所示,那么质粒pCLY11需用限制酶
_____________________切开,才能与t-PA突变基因高效连接。
解析:如图所示,目的基因的两端的黏性末端碱基序列分别是CCGG、CTAG,所以应用XmaⅠ和BglⅡ两种限制酶切割,以便于把目的基因连接到质粒pCLY11上。
XmaⅠ、BglⅡ
7(共156张PPT)
基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
第3讲
明确目标
1.理解基因工程的概念;　
2.阐明重组DNA技术三种基本工具的作用;　
3.阐明基因工程的基本操作程序及各步骤的作用;　
4.掌握DNA粗提取和鉴定的方法,尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR产物;　
5.举例说明基因工程在农牧业、食品工业及医药卫生等行业的广泛应用;　
6.概述人们根据基因工程原理,进行蛋白质设计和改造,可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质;　
7.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程;　
8.认同生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全性与伦理问题。
建构知识体系
目录
主题研习（一）
主题研习（二）
重组DNA技术的基本工具　
课时跟踪检测
基因工程的基本操作程序与应用
主题研习（一）重组DNA技术的基本工具　
(一)基因工程的概念分析
基础全面落实
目的基因
基因重组
受体
分子
(二)基因工程的基本工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
来源 主要是从原核生物中分离纯化出来
作用 识别双链DNA分子的特定________________,并使每一条链中特定部位的______________断开
特征 一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列,并且能在特定的位点上切割DNA分子
结果 产生___________和平末端
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 __________ T4噬菌体
特点 T4 DNA连接酶连接平末端的效率远高于E.coli DNA连接酶
作用 恢复被限制酶切开的______________,连接两个DNA片段
大肠杆菌
磷酸二酯键
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
类型 常用:_________;其他:噬菌体、动植物病毒等
条件 ①能自我复制或整合到受体DNA上,使目的基因稳定存在且数量可扩增;②具有一个至多个__________________,供外源DNA片段(基因)插入;③具有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选
作用 携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞
质粒
限制酶切割位点
(三)DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
(1)DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的_________中溶解度不同,它能溶于________的NaCl溶液。
(3)在一定温度下,DNA遇________试剂会呈现蓝色。
NaCl溶液
2 mol/L
二苯胺
2.实验步骤
3.DNA的粗提取与鉴定实验的四点注意事项
(1)该实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA的断裂,导致DNA不能形成丝状物。
(3)二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。
(4)在DNA进一步提纯时,选用预冷的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)重组DNA技术所需要的三种基本工具为限制酶、DNA连接酶和载体。 ( )
(2)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。 ( )
(3)DNA连接酶和DNA聚合酶作用方式相同。 ( )
(4)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色。 ( )
(5)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 ( )
(6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中,过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。 ( )
√
×
√
×
×
√
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P71“旁栏思考”拓展)限制酶来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子
________________________________________________________________
(2)(人教版选择性必修3 P72“旁栏思考”拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗 试简要说明:_______________________________________
________________________________________________________________。
原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链的末端
(3)(2024·安徽高考真题改编)“DNA粗提取与鉴定”实验中利用______________________________差异,可初步分离DNA,纯化DNA的原理是__________________________________________。
DNA和蛋白质在酒精中的溶解度
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同
题点(一)　基因工程的操作工具
1.(苏教版选择性必修3 P88“知识链接”素材挖掘)下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是(　　)
考向精细研究
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 注:Y=C或T,R=A或G
BglⅡ A↓GATCT KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅠ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
A.限制酶的作用底物都是双链DNA,都能切开磷酸二酯键
B.BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
C.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列
D.一种限制酶可能识别多种核苷酸序列
√
解析:限制酶能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,A正确;BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端,均为GATC—,B正确;据题表可知,Sau3AⅠ特异性识别4个核苷酸序列,C错误;HindⅠ的识别序列为GTY↓RAC,其中Y=C或T,R=A或G,说明其识别序列并非一种,则一种限制酶可能识别多种核苷酸序列,D正确。
2.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
√
解析:用酶3切割质粒和目的基因,会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接,且E.coli DNA连接酶连接酶3切出的平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶,A不符合题意;用酶1切割目的基因,产生的是黏性末端,用酶3切割质粒,产生的是平末端,两者切割后无法相互连接,B不符合题意;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后,可使用T4 DNA连接酶连接,使目的基因定向插到质粒中,C符合题意;酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同,易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接,并且用酶4切割会破坏标记基因,D不符合题意。
　[归纳拓展]　与DNA有关的几种酶作用特点分析
①从作用底物上分析
限制酶、DNA水解酶、解旋酶、DNA连接酶的作用底物都是DNA分子;DNA聚合酶的作用底物是脱氧核苷酸。
②从作用部位上分析
限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶的作用部位都是磷酸二酯键,而解旋酶的作用部位是碱基对间的氢键。
③从作用结果上分析
限制酶是将DNA分子切成一个或多个片段,而DNA连接酶是将两个DNA片段连接为一个DNA分子;DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接成一条单链,而DNA水解酶是将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸;解旋酶是将双链DNA分子解旋为单链。
题点(二)　DNA的粗提取与鉴定
3.(2024·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
√
解析:研磨后,可以将研磨液过滤到烧杯中,在4 ℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液,可以不使用离心机,A正确,B错误。鉴定过程中的沸水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变,C错误。该实验中,为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰,可设置加二苯胺不加DNA的对照组,D错误。
4.(2024·安徽高考)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
√
解析:研磨液有利于DNA的溶解并保护DNA不被破坏,若换为蒸馏水,则DNA提取的效率会降低,A正确;DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可初步分离DNA,B正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,二苯胺试剂用于鉴定DNA,不能检测溶液中是否有蛋白质杂质,D错误。
主题研习（二）基因工程的基本操作程序
与应用
基础全面落实
(一)基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
目的基因 在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指________________的基因
筛选方法 从相关的已知_______________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一
编码蛋白质
结构和功能
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
引物
脱氧核苷酸
耐高温
温度
两种引物
耐高温的
DNA聚合酶
琼脂糖凝胶电泳
2.基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在______________中稳定存在,并且遗传给下一代。
②使目的基因能够________和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
受体细胞
表达
RNA聚合酶
转录
[微点拨]　启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点,启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
3.将目的基因导入受体细胞
类型 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 ___________法、花粉管通道法 _________技术 Ca2+处理法
受体细胞 受精卵、体细胞 __________ 原核细胞
农杆菌转化
显微注射
受精卵
4.目的基因的检测与鉴定
抗原—
抗体杂交
抗性接
种实验
(二)基因工程的应用
1.基因工程在农牧业方面的应用
(1)转基因_________植物;
(2)转基因抗病植物;
(3)转基因_________植物;
(4)改良植物的品质;
(5)提高动物的_____________;
(6)改善畜产品的品质。
抗虫
抗除草剂
生长速率
2.基因工程在医药卫生领域的应用
(1)对________________________进行基因改造,使它们能够生产药物。
(2)让哺乳动物批量生产__________。
(3)可能使建立_____________工厂的设想成为现实。
3.基因工程在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
微生物或动植物的细胞
药物
移植器官
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 ( )
(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 ( )
(3)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 ( )
(4)构建基因表达载体时要注意保证目的基因上有启动子、终止子及标记基因等。 ( )
×
√
×
×
(5)酶切片段和载体连接时,可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶。 ( )
(6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。 ( )
(7)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )
(8)从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径。 ( )
√
√
√
√
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P77“相关信息”探究思考)说明Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白一般不会对人畜产生危害的原因:___________
____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性,而人和牲畜的胃液呈酸性,肠道细胞也没有特异性受体,因此,Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害
(2)(人教版选择性必修3 P81“资料卡”原理分析)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,需要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上,原因是___________________________________________
___________________________________________。
(3)(人教版选择性必修3 P90“正文”分析)生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时必须把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。原因是______________________________
_____________________________________________________________________。
Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上
只有连接了乳腺中特异表达的基因的启动子,才能保证相应的目的基因在雌性动物泌乳期乳腺细胞内得以表达
(4)(2024·浙江选考改编)构建重组表达载体时,将目的基因和载体同时进行双酶切处理,然后利用______________连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用______快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是_____________________________。
DNA连接酶
PCR
热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
重难深化拓展
重难点(一)　基因工程的操作步骤
1.目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
①逆转录法
主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:
②化学合成法
依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:
(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来从基因文库中获取目的基因。
2.基因表达载体的构建过程
3.目的基因的检测与鉴定方法
(1)载体上标记基因的标记原理:载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞,原理如图所示:
(2)目的基因的检测
①使用PCR等技术,检测目的基因是否插入转基因生物染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。
②采用抗原—抗体杂交技术,从转基因生物中提取蛋白质(作抗原),与相应抗体杂交,依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
③采用抗虫、抗病毒等接种实验,进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
　[例1]　(2024·山东高考)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越_____ (填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有____种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-______________-3'和5'-__________-3'。
低
44
GTTT
CAAT
[解析]　引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增,即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上,进而导致非特异性产物的形成,影响PCR的特异性和准确性。结合BsaⅠ识别序列可知,BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基,故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4=44(种)。根据图甲所示的载体信息,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素_____________筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_______,其中纯合的突变植株是_____ (填序号)。
卡那霉素
SacⅠ
④
[解析] 根据图甲可知,重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因,因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图乙、丙可知,目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异,BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同,结合电泳结果可知,只能选用限制酶SacⅠ酶切PCR产物;限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点,但是目标序列没有,因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条,目标序列是一条带,根据图丙的电泳结果可知,只有④为纯合突变的植株。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
[解析] 设基因L突变为基因L',则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L'L',由题中信息知,一条染色体插入了T-DNA,若其插入了L'所在染色体,其所在染色体记为L'1,则其自交子代的基因型及比例为L'1L'1∶L'1L'∶L'L'=1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代,筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L'L')所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体,所得结果相同。
重难点(二)　限制酶的选择方法分析
1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类
(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶,如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点或确保质粒切割后产生的末端能与这两种酶切割后产生的末端连接。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
3.根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
　　[例2]　若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙),限制酶的酶切位点分别是Bgl Ⅱ(—A↓GATCT—)、EcoR Ⅰ(—G↓AATTC—)和Sau3A Ⅰ(—↓GATC—)。下列方法最合适的是 (　　)
A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
√
[解析]　用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体,产生相同的黏性末端,用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接,A不符合题意;用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因,相当于只用EcoRⅠ切割目的基因,但EcoRⅠ和BglⅡ对P1噬菌体载体正常切割,而EcoRⅠ和BglⅡ切割后产生的黏性末端不同,故BglⅡ和EcoRⅠ切割的目的基因无法与BglⅡ和EcoRⅠ切割的P1噬菌体载体连接,B不符合题意;用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体,会导致目的基因的插入方向与图丙中所示的RNA聚合酶的移动方向相反,C不符合题意;用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体,既能产生不同的黏性末端,又能防止发生反向连接,且这样目的基因插入载体后,RNA聚合酶的移动方向与图丙实线方向相同,D符合题意。
重难点(三)　PCR技术的操作原理和过程分析
1.PCR技术和DNA复制的比较
项目 PCR技术 DNA复制
场所 体外(PCR扩增仪中) 细胞内(主要是细胞核内)
解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶
温度条件 在较高温度下进行,需控制温度 细胞内温和条件
合成对象 DNA片段 DNA分子
相同点 均需要模板(DNA双链)、原料(四种脱氧核苷酸)、能量
2.PCR技术中的三个注意点
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,通常也需要引物,一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。
3.PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n-1
同时含引物A、B的DNA分子数 0 2 6 2n-2
共消耗的引物数量 2 6 14 2n+1-2
重难点(四)　PCR中引物的设计及应用
1.PCR中设计引物的意义及一般原则
意 义 ①DNA分子体外扩增时必须设计两种引物。
②设计引物的首要目标是其特异性,只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定结构时才能达到这个目标(如图)
一般原则 ①引物长度一般以20~30个核苷酸为宜,过短会降低特异性,过长会引起复性时结合的模板数减少,降低反应效率。
②要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。
③引物5‘端可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等),便于克隆和表达。
④引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性,以免造成不必要的非特异性扩增
续表
2.引物的特殊应用
添加酶位点 在PCR引物的5'端加上根据需要而设计的限制酶酶切位点,PCR产物内部无该切点
反向PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增(见下图)
[例3]　(2025·成都模拟)某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因,其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是 (　　)
A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链
B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D.杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
√
[解析]　利用PCR技术扩增基因时,高温变性使DNA双链解旋,不需要解旋酶来打开DNA双链,A正确;引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR过程,因此不能在同一个反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增,B正确;dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链,C错误;由题图可知,杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程中,不需要加入引物,D正确。
[例4]　(2024·大连二模)通过引物设计,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是 (　　)
A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3'端
B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等
C.第2轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
√
[解析]　DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的,据此可知,图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5'端,A错误;PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2+)等物质,B错误;由图可知,第2轮PCR中引物1与图中②结合并未形成两条链等长的突变基因,C错误;在第3轮PCR结束后,会产生23=8(个)DNA分子,其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有2个,其他的DNA分子的两条链均是不等长的,故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4,D正确。
重难点(五)　利用不同方式生产药物的区别
生产方式 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达,利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
受体与人类基因结构的差异 动物与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌与人类的基因结构有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 Ca2+处理法
生产条件 不需严格灭菌;温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
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　[例5]　运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产,目前常用的生物反应器有“乳腺生物反应器”和“膀胱生物反应器”,其构建过程如下:构建药用蛋白基因的表达载体,并将表达载体导入动物的受精卵中,然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是 (　　)
A.构建乳腺生物反应器时,需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起
B.在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因
√
C.与乳腺生物反应器相比,膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制
D.将表达载体导入哺乳动物的受精卵时,常采用显微注射技术
[解析]　启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,可用于驱动基因的转录,构建乳腺生物反应器时,需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起,以保证目的基因在乳腺细胞中表达,A正确;受体细胞是动物的受精卵,所以在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的其他细胞中也含有药用蛋白基因,只是没有表达,B错误;“乳腺生物反应器”只能从哺乳期雌性个体的乳汁中获取产物,与“乳腺生物反应器”相比,“膀胱生物反应器”的优点是雌雄个体的尿液中都可提取到产物,且不受年龄的限制,C正确;将表达载体导入哺乳动物的受精卵时,常采用显微注射技术,D正确。
考向精细研究
题点(一)　基因工程的操作步骤与PCR技术
1.(2024·甘肃适应考)胰岛素可用于治疗糖尿病,我国科学家打破国外技术垄断,研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物,下列叙述错误的是(　　)
A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时,每次循环包括变性、复性、延伸三步
B.构建人胰岛素基因表达载体时,需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
C.大肠杆菌细胞经Ca2+处理后,更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体
D.抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
√
解析:用PCR技术扩增人胰岛素基因时,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步,A正确;在构建人胰岛素基因表达载体时,需使用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,形成重组DNA分子,B正确;大肠杆菌细胞经Ca2+处理后,细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体,C正确;抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成人胰岛素,若抗原—抗体杂交结果为阳性,说明人胰岛素基因在大肠杆菌中成功表达,则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中,D错误。
2.(2025年1月·八省联考晋陕宁青卷)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径,其基因表达载体如图(a),基因1、2和3为该途径的必需基因,基因大小分别为2 650 bp、1 240 bp和3 476 bp。回答下列问题。
(1)图(a)中,构建基因表达载体时用到的酶是___________________,片段X是_____________。
解析:构建基因表达载体时用到的酶是限制酶、DNA连接酶。质粒上一般包含启动子、终止子、复制原点、标记基因(抗性基因),结合图(a)分析,片段X是复制原点。
限制酶、DNA连接酶
复制原点
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前,需要用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种___________________________的生理状态,导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落,分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图(b)。据图可知,PCR时选用的引物对是图(a)中的____________________,选择该引物对进行鉴定的原因是____________
____________________________________________________; 菌落B中未检测到目标条带,其原因是_______________________________________。
能吸收周围环境中DNA分子
引物2和引物5
两种引物
扩增的区段包含了完整的基因2和基因1、基因3的部分片段
菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒
解析:基因表达载体导入大肠杆菌前,需要用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这样有利于重组DNA分子的导入。电泳结果显示,菌落A和C相应基因大小介于2 000 bp~3 000 bp之间,结合目的基因上的引物分析,应该选择引物2和引物5,该引物对扩增的区段包含了完整的基因2和基因1、基因3的部分片段,这样可以很好的判断大肠杆菌中是否成功导入了目的基因。菌落B中未检测到目标条带,即不含目的基因但含抗性基因,其原因是菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒。

(3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响,请针对其中任一因素,探究其对产物Z产量的影响,写出简要的实验思路:___________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
解析:本实验的实验目的是探究温度、pH和溶解氧等发酵条件对产物Z产量的影响,实验自变量是温度或pH或溶解氧,检测指标是产物Z的产量。实验思路见答案。
　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　
将工程菌株随机分成若干份,分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中,其他环境条件相同且适宜,一段时间后测定产物Z的产量
3.脱水素是青稞植株中的一种抗冻物质,脱水素基因Dhn4的结构如图1所示,其中B链为模板链。研究人员利用图2所示的质粒,通过农杆菌转化法将该基因导入草莓中,成功培育出了抗冻草莓植株。回答下列问题:
注:XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ为三种不同黏性末端的限制酶识别位点;AmpR为氨苄青霉素抗性基因。
(1)获取目的基因:提取青稞细胞的__________,经__________过程获得cDNA。在PCR扩增Dhn4时应选择的引物组合是____________,为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接,需在引物的______ (填“5'”或“3'”)末端分别添加限制酶_______________________(顺序需与选择的引物组合对应)的识别序列。
mRNA
逆转录
引物Ⅱ、Ⅲ　
Kpn Ⅰ、XhoⅠ
5'
解析:青稞细胞中的mRNA经过逆转录可获得cDNA。引物能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,故应选择引物方向是从5'→3'延伸,即引物Ⅱ和引物Ⅲ。限制酶序列应添加在目的基因的外侧,不影响目的基因的序列,故添加在5'端。因为B链为模板链,转录的方向是沿着模板链的3'→5',应将Dhn4基因的左端与启动子一侧连接,又因为目的基因中含有PstⅠ的识别序列,不能选用,故在引物Ⅱ、Ⅲ的5'端添加的限制酶序列分别是KpnⅠ和XhoⅠ。
(2)构建基因表达载体:启动子的作用是_______________________
________________;多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率,如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度及_________________________
_______________________________________________________(举两例即可)等。
解析:启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,启动基因转录。多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率,如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度及Dhn4基因浓度(目的基因浓度)、质粒与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度等。
RNA聚合酶识别与结合
的部位,启动转录　
Dhn4基因浓度(目的基因
浓度)、质粒与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度
(3)导入、筛选受体细胞:将重组质粒导入农杆菌内,然后在含　　　　_____________的培养基上培养、筛选农杆菌,再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养,完成转化实验。
解析:基因表达载体上的AmpR属于标记基因,故可将重组质粒导入农杆菌内,然后在含氨苄青霉素的培养基上培养、筛选农杆菌,再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养,完成转化实验。
氨苄青霉素
(4)转基因植株的培育与检测:转基因草莓叶片经脱分化形成__________,然后通过调整培养基中的_________________________ (填植物激素类型)配比,最终获得幼苗。可通过__________________处理,从个体生物学水平对转基因是否成功进行检测。
解析:转基因草莓叶片经脱分化形成愈伤组织,然后通过调整培养基中的生长素和细胞分裂素配比,最终获得幼苗。从个体生物学水平可通过低温(或抗冻性检测)处理对转基因是否成功进行检测。
愈伤组织
生长素与细胞分裂素
低温(抗冻性检测)
[归纳拓展]　农杆菌转化法的几个关键点
①农杆菌特点:能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力;其细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
②农杆菌转化法中的两次拼接与两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
③导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
题点(二)　基因工程的应用
4.当苹果削好皮或切开后放置一会儿,切口面的颜色就会由浅变深,最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物,酚类化合物易被氧化成醌类化合物,变成黄色,随着反应的量的增加颜色就逐渐加深,最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程,下列叙述不正确的是(　　)
A.要想获得抗褐变的转基因苹果,目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B.步骤①需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C.步骤④使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D.为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果,可与导入不含目的基因质粒的植株作对照
√
解析:由题意可知,要想获得抗褐变的转基因苹果,可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因,A正确;步骤①是基因表达载体的构建,该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与,B错误;步骤④是脱分化阶段,该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来),C正确;为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果,可与导入不含目的基因质粒的植株作对照,D正确。
5. (2025·南昌模拟)红细胞生成素(EPO)是人体促进红细胞生成的一种糖蛋白,可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然 EPO来源极为有限,某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器,使其能合成EPO。下列有关叙述正确的是 (　　)
A.构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的上游
B.一般情况下,该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中存在和表达
C.可用显微注射技术将含有EPO基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中
D.用PCR扩增人EPO基因,只需要知道EPO基因两端的核苷酸序列
√
解析:构建表达载体时需将EPO基因(目的基因)插入乳腺蛋白基因的启动子的下游,A错误;由题意可知,该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达,但培育该转基因羊时,EPO基因是被导入至受精卵中, 羊的其他细胞中也存在EPO基因,B、C错误; 用PCR扩增目的基因时,只需知道目的基因两端的核苷酸序列,D正确。
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对应主题研习(一)(二)
一、选择题
1.(2025·长春模拟)“DNA的粗提取与鉴定”实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”,下列说法正确的是(　　)
A.实验材料可以选择猪的成熟红细胞或肝细胞
B.将研磨液从冰箱中取出后取沉淀物继续进行实验
C.进行DNA鉴定时,对照组不需要加入DNA
D.可以利用DNA溶于酒精的特性将DNA提取出来
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解析:猪为哺乳动物,成熟红细胞不含细胞核,不能用于DNA的粗提取,A错误;DNA粗提取时,要将研磨液过滤到烧杯中,在冰箱放置一段时间后,由于上清液中含有DNA和蛋白质,故取上清液继续进行实验,B错误;进行DNA鉴定时,对照组不需要加入DNA,只加二苯胺试剂作为空白对照组,目的是与实验组进行颜色对照,以鉴定提取出的物质是DNA,C正确;利用DNA不溶于酒精的特性,而蛋白质等溶于酒精的特性,可将DNA与蛋白质等分离,D错误。
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2.菊花是一种双子叶植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长,还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列叙述错误的是 (　　)
A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B.将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上构建表达载体
C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D.应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
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解析:分析题意可知,需将目的基因导入菊花细胞,故受体细胞可以选择菊花叶片细胞,但不能选择桃蚜细胞,A错误；基因工程中构建表达载体时,由于T DNA可以转移到受体细胞内,所以可以将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上,B正确；菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞,有利于目的基因成功导入,C正确；应用抗虫接种实验,检测转GNA基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度,D正确。
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3.(2025·大理模拟)当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后,目的基因可能正向插入载体,也可能反向插入载体(如图),为判断目的基因的插入方向,可使用限制酶处理,并进行电泳检测。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是 (　　)
注:EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列、切割位点均不同,数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数(bp),质粒全长20 000 bp。
A.Hind Ⅲ B.EcoR Ⅰ
C.BamH Ⅰ D.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ
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解析:图中质粒用限制酶Hind Ⅲ处理,并进行电泳后,无论正向插入还是反向插入均会出现DNA片段为5 000+4 000=9 000(bp)和1 000+
2 000+5 000+3 000=11 000(bp),因此用该限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向,A不符合题意;
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图中质粒用限制酶EcoR Ⅰ处理,并进行电泳后,正向插入的质粒会出现的DNA片段为1 000+2 000+5 000=8 000(bp)和5 000+4 000+3 000=
12 000(bp),而反向插入的质粒切割后会出现的DNA片段为1 000+2 000+
4 000=7 000(bp)和5 000+3 000+5 000=13 000(bp),因此正向插入和反向插入用限制酶EcoR Ⅰ处理,并进行电泳后,得到的DNA片段大小不同,可以判断目的基因的插入方向,B符合题意;图中质粒用限制酶BamH Ⅰ处理,并进行电泳后,无论正向插入还是反向插入均会出现DNA片段为
5 000+1 000=6 000(bp)和4 000+2 000+5 000+3 000=14 000(bp),因此用该限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向,C不符合题意;
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图中质粒用限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ共同处理,并进行电泳后,无论正向插入还是反向插入均会出现DNA片段为2 000+1 000=3 000(bp)、
5 000 bp、4 000 bp、5 000+3 000=8 000(bp),因此用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向,D不符合题意。
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4.现如今随着技术的不断发展,人们发明了多种PCR技术的衍生版本,如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述,正确的是 (　　)
A.已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来,因此可用于较长DNA分子的人工合成
B.已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异,因此可用于病毒的检测与分析
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C.已知热不对称性PCR可通过调节复性温度产生多种产物,因此操作时对温度的要求低于常规PCR
D.已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号,因此可用于亲子鉴定
解析:重叠延伸PCR可将多个DNA片段连接起来,因此可用于较长DNA分子的人工合成,A正确;等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异,可用于亲子鉴定以及遗传病的筛查,无法检测是否存在某种病毒,B错误;
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热不对称性PCR需对温度进行精细控制,对温度的要求高于常规PCR,C错误;荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号,可用于某些病毒的检测,无法判断两份DNA间的细微差别,因此无法用于亲子鉴定,D错误。
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5.(2025·宜昌模拟)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中的实践中,某同学选用EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述,正确的是 (　　)
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A.可以避免质粒或者目的基因自身环化
B.可以避免目的基因与质粒反向连接
C.可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
D.可以避免受体菌的EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ将重组质粒中的目的基因切割下来
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解析:两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免质粒或者目的基因自身环化,也不能避免目的基因与质粒反向连接,A、B错误;两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因,C错误;若质粒被EcoR Ⅰ酶切后的黏性末端与目的基因被Mfe Ⅰ酶切后的黏性末端连接,质粒被Mfe Ⅰ酶切后的黏性末端与目的基因被EcoR Ⅰ酶切后的黏性末端连接,则正好将目的基因正向连接,这样的重组质粒,既无EcoR Ⅰ识别位点,又无Mfe Ⅰ识别位点,故可以避免受体菌的EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ将重组质粒中的目的基因切割下来,D正确。
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6.紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素(紫色)。紫色花青素能降低人类患心脏病、糖尿病的风险。如图是花青素基因(S)的cDNA和Ti质粒。下列叙述错误的是 (　　)
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A.可以选用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒
B.在用农杆菌侵染时,常要使用一些抗生素来抑制农杆菌生长和筛选转化细胞
C.用于扩增 S基因的引物需满足的条件之一是两种引物分别与两条模板链 3'端的碱基序列互补配对
D.若检测出标记基因所表达的性状,则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞
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解析:由图可知,选用Xba Ⅰ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒,既能保证目的基因与载体产生相同的黏性末端,又不破坏目的基因,A正确;在用农杆菌侵染时,既要筛选转化细胞,又要避免农杆菌的大量繁殖,因此培养基中通常加入抗生素,B正确;用于扩增S基因的引物需满足的条件之一是两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对,以保证子链从5'端向3'端延伸,C正确;若检测出目的基因所表达的性状,则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞,D错误。
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7.ω-3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)有预防心血管疾病的作用,但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术(将外源DNA转入受体细胞的技术)将LCPUFA合成酶基因(fat-1基因,含1 229 bp)导入小鼠受精卵,培育出转基因小鼠,基本流程如下图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后,利用fat-1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是 (　　)
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A.采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B.PCR扩增3轮后,只含一种引物的DNA分子的比例为1/4
C.由图乙可知,只有2组转染成功
D.若fat-1基因单点插入,则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA
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解析:农杆菌转化法适用于植物细胞,对于动物细胞受精卵而言应采用显微注射法,A错误;PCR扩增3轮后,共得到8个DNA分子,只有最原始的1个DNA分子的两条链不含引物,导致含有这两条链的2个DNA分子只含有其中一种引物,其余6个DNA分子均含有2种引物,故PCR扩增3轮后,只含一种引物的DNA分子的比例为1/4,B正确;据图乙可知,仅2组出现条带,且条带介于1 000~2 000 bp,说明只有2组转染成功,C正确;若fat-1基因单点插入,相应的基因型表示为FO(F表示插入fat-1基因),则转基因小鼠相互交配后代基因型为1FF、2FO、1OO,即产生的大多数后代体内能合成LCPUFA,D正确。
1
5
6
7
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10
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12
13
2
3
4
9
8.(2025·长沙模拟)青蒿素是有效的抗疟疾药物,但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况,科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织,获得了黄花蒿的冠瘿组织,改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是 (　　)
1
5
6
7
8
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12
13
2
3
4
9
A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法
B.图中P位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录
C.图中还缺少的结构是标记基因,标记基因的作用是表达出目的基因产物
D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上,可采用PCR技术
√
1
5
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8
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3
4
9
解析:将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法,A正确;图中P为启动子,位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录,B正确;图中还缺少的标记基因等结构,标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来,C错误;要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上,可采用PCR技术,D正确。
1
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9
9.(2025·景德镇模拟)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述错误的是 (　　)
1
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3
4
9
A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B.设计的引物中GC碱基含量越高,复性的温度越高
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶
√
1
5
6
7
8
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3
4
9
解析:DNA子链合成的方向为5‘端到3’端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增,A正确;引物中GC碱基含量越高,碱基对间氢键的含量越多,复性时的温度越高,B正确;PCR产物是包含所有未知序列和部分已知序列的链状DNA分子,C错误;整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温DNA聚合酶, D正确。
二、非选择题(除特别注明外,每空1分)
10.(11分)(2025·泉州模拟)近年来随着甲醇工业产能过剩的情况日益严重,研究人员通过构建甲醇工程菌来有效利用甲醇。RuMP途径是目前研究较多的甲醇同化途径之一,其中MDH酶是同化甲醇的关键酶之一,现科学家利用下图质粒构建表达载体,制备可利用甲醇的大肠杆菌。
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9
(1)为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体,需在目的基因的两端分别加上__________的碱基序列。(填编号,2分)
①EcoRⅠ　②KpnⅠ　③Acc65Ⅰ　④BglⅡ
解析:由题图可知,Kpn Ⅰ的酶切位点在AmpR之中,Acc65 Ⅰ识别的序列与KpnⅠ识别的序列相同,不能选择KpnⅠ和Acc65Ⅰ,否则会破坏AmpR,因此为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体,需在目的基因的两端分别加上EcoRⅠ和BglⅡ的碱基序列。
①④
1
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9
(2)应选取氨苄青霉素____________ (填“敏感型”或“耐药型”)的大肠杆菌作为受体细胞,理由是______________________________ (2分)。
解析:氨苄青霉素敏感型的大肠杆菌对氨苄青霉素没有抗性,由于质粒上有氨苄青霉素的抗性基因,若导入质粒,则氨苄青霉素敏感型大肠杆菌能抗氨苄青霉素,应选取氨苄青霉素敏感型的大肠杆菌作为受体细胞,理由是有利于受体细胞的筛选。

敏感型　
有利于受体细胞的筛选　
1
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9
(3)甲醇工程菌培养12 h后,挑取单菌落分离DNA进行PCR扩增,若扩增后的DNA样品电泳结果显示有1 566 bp的片段,则下图(深色部分为目的基因区段)中对应DNA片段的引物为________ (填图中序号,2分)。
解析:由图可知,若扩增后的DNA样品电泳结果显示有2 402-908+72=1 566(bp)片段,则对应DNA片段的引物为⑤⑦。
⑤⑦　
1
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9
(4)DNA探针是一种人工合成的具有特定核苷酸序列的单链DNA片段,利用DNA探针与待测样本中DNA互补结合,可确定受体细胞中是否含有目的基因。检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因,原因可能是表达过程中的____________________过程受阻;现拟利用DNA探针对该原因做出进一步的精准判断,请简要写出实验思路:______________
____________________________________________________________________________________________________________________________
(3分)。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　
转录或翻译
用目的基因的一条链设计成探针(探针核苷酸序列与目的基因转录时的模板链相同),对目的基因的转录产物mRNA进行分子杂交,检测是否出现杂交带
1
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9
解析:检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因,原因可能是表达过程中的转录或翻译过程受阻;要对原因做出进一步的精准判断,可以用目的基因的一条链设计成探针(探针核苷酸序列与目的基因转录时的模板链相同),对目的基因的转录产物mRNA进行分子杂交,检测是否出现杂交带,如果出现杂交带,说明出现这种现象的原因是翻译过程受阻;如果没有出现杂交带,说明出现这种现象的原因是转录过程受阻。
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9
11.(9分)(2025·北京通州模拟)学习下面材料,回答(1)~(5)题。
CRISPR-Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统。细菌中转入有益基因时,CRISPR基因功能会缺失,当外源基因对细菌生存造成威胁时,CRISPR的表达会发生上调,启动细菌的适应性免疫。其防御机制分为适应阶段、基因表达阶段和干扰阶段。
有害的外源核酸中部分短序列会被细菌整合并插入到其CRISPR序列中(图1)、随后相关基因表达出Cas蛋白、TracrRNA,以及CRISPR序列会表达出一条前体crRNA(Pre-crRNA),Pre-crRNA的某些序列被剪切,形成多个crRNA。
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9
每条crRNA、TracrRNA与Cas蛋白形成稳定的效应复合物。在干扰阶段中,复合物中Cas蛋白使外源DNA解旋,RNA①与之互补配对形成特殊结构,随后Cas蛋白构象发生变化并切割该段DNA的特定序列。在此过程中,Cas蛋白主要切割与RNA①互补配对的DNA单链的H位点和非互补配对链的R位点(如图2所示)。
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经改造的细菌CRISPR-Cas系统已被广泛应用到基因定点编辑、基因组筛选、基因转录调控等领域、但仍存在许多问题有待深入解决与探索。
(1)细菌将外源DNA整合到CRISPR序列中,是对可遗传变异类型中的____________的扩展。
解析:将外源DNA整合到CRISPR序列中,属于广义上的基因重组。
基因重组
1
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9
(2)结合图1分析,有害的外源DNA被细菌整合并插入到CRISPR序列中,成为________序列,CRISPR序列中_______序列的转录产物存在核酸酶的识别位点,因此Pre-crRNA被剪切形成多个crRNA。结合图2分析,TracrRNA和crRNA有________ (选填“相同”或“互补”)序列,可相互结合,进而与Cas蛋白形成效应复合物。
间隔
重复
互补
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解析:由图1可知,有害的外源DNA被细菌整合并插入到CRISPR序列中成为间隔序列。CRISPR序列会表达出一条Pre-crRNA,而Pre-crRNA会被剪切,形成多个crRNA,因此Pre-crRNA是CRISPR序列中重复序列的转录产物且Pre-crRNA上存在核酸酶的识别位点。结合图2可知,TracrRNA和crRNA有互补序列,可以相互结合,进而与Cas蛋白形成效应复合物。
1
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(3)结合材料分析,图2中RNA①是_____________ (填“crRNA”或“TracrRNA”),起到对外源DNA的识别作用,进而将复合物精准定位。
解析:结合材料和图2可知,RNA①是crRNA,起到对外源DNA的识别作用,进而将复合物精准定位。
crRNA
1
5
6
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9
(4)下列说法正确的有___________ (2分)。
A.细菌体内的Cas是具有类似解旋酶和限制酶作用的双功能蛋白
B.Cas剪切外源DNA片段的精准性与RNA①的长度呈正相关
C.可通过CRISPR-Cas技术靶向治疗21-三体综合征患者
D.细菌CRISPR序列中重复序列的种间差异小于间隔序列
ABD
1
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9
解析:由材料可知,Cas是具有类似解旋酶(解开DNA的双螺旋)和限制酶(对DNA进行切割)作用的双功能蛋白,A正确;由材料可知,Cas剪切外源DNA片段的精准性与RNA①的长度呈正相关,即越长越精准,B正确;21-三体综合征是多了一条染色体,CRISPR-Cas技术针对基因,不能靶向治疗该病,C错误;细菌CRISPR序列中重复序列的种间差异小于间隔序列,D正确。
1
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9
(5)从进化观分析,转入有益基因时,细菌CRISPR基因功能缺失的积极意义是___________________________________________________ (2分)。
解析: CRISPR基因会对外源基因进行切割,因此转入有益基因时,细菌CRISPR基因功能缺失有利于细菌获取有益基因,获得新性状,更好的适应环境。
有利于细菌获取有益基因,获得新性状,更好地适应环境
1
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9
12.(14分)(2024·邢台二模)研究发现,GsERF6基因可以提高水稻的耐盐性。图1是某研究小组利用PCR技术扩增GsERF6基因的过程,图2是该研究小组通过基因工程的方法获得GsERF6基因超表达水稻新品种的过程。请据图分析回答下列有关问题:
1
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3
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9
(1)图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的_______________,这两个步骤的温度都相对较高,可能与_____________________ (2分)中碱基C和G的含量较高有关;循环n次能获得等长目的基因________个。

变性、复性
模板DNA和两种引物
2n-2n
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9
解析:图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的变性、复性,这两个步骤的温度都相对较高,可能与模板DNA和两种引物中碱基C和G的含量较高有关,因为碱基C和G之间可以形成三个氢键。由图1可知,第三次循环可以得到两个等长目的基因,因此循环n次能获得等长目的基因2n-2n个。
1
5
6
7
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9
(2)图2中A为构建的GsERF6基因超表达载体的部分序列(图中 和
分别为T-DNA的左、右边界,NeoR为新霉素抗性基因, 为终止子),35S的作用是________________________________________ (2分)。
解析:图2中A为构建的GsERF6基因超表达载体的部分序列,由于A中应存在终止子、目的基因、标记基因、启动子,结合题意可知,35S是启动子,作用是RNA聚合酶结合位点,驱动基因转录出mRNA。

RNA聚合酶结合位点,驱动基因转录出mRNA
1
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9
(3)超表达载体中T-DNA的作用是_____________________________
____________________________________ (2分),将重组GsERF6基因超表达载体导入农杆菌,①过程利用含____________的培养基筛选出重组的农杆菌。
解析: T-DNA又叫可转移的DNA,因此T-DNA的作用是将目的基因转移到受体细胞,并将其整合到受体细胞的染色体DNA上。将重组GsERF6基因超表达载体导入农杆菌,①过程利用含新霉素的培养基筛选出重组的农杆菌。
将目的基因转移到受体细胞,并将
其整合到受体细胞的染色体DNA上
新霉素
1
5
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7
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2
3
4
9
(4)愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有___________________,另外该过程还需要光照,光照的作用是_____________________________
___________________________ (写出两个,2分)。
解析:愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有生长素和细胞分裂素,另外该过程还需要光照,光照的作用是诱导叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
生长素和细胞分裂素
诱导叶绿素的形成、满足叶绿体
利用光能制造有机物的需要
1
5
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9
(5)请你设计实验检验此转基因水稻新品种是否培育成功:________
______________________________________________________________　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(写出实验设计思路,2分)。
解析:检验此转基因水稻新品种是否培育成功可以将此转基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中,观察和对比这两种水稻的长势。
将此转基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中,观察和对比这两种水稻的长势
1
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9
13.(11分)(2025年1月·八省联考河南卷)核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是植物固定CO2的关键酶。某研究小组通过导入相关基因在大肠杆菌中搭建图1所示的代谢通路,以筛选结合CO2能力更强的Rubisco。回答下列问题。
1
5
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7
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3
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9
(1)为将Rubisco基因导入大肠杆菌,研究小组使用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切以构建重组质粒。图2表达载体中,片段2为___________ (填“启动子”或“终止子”),其作用是_______________________________________ (2分)。
启动子
RNA聚合酶识别和结合位点,驱动基因转录
1
5
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2
3
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9
解析:转录过程中,mRNA延伸的方向是5'→3',因此根据模板链的位置可知Rubisco基因转录的方向是从右向左,即EcoRⅠ靠近启动子,BamHⅠ靠近终止子,即片段2为启动子,片段1是终止子;启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合位点,驱动基因转录。
1
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9
(2)为检测转化的菌落是否携带含有Rubisco基因的重组质粒,将P1、P2和P3引物(引物位置如图2所示,→表示引物5'→3'方向)共同加入反应体系后,分别以3个菌落的DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示,菌落_____ (填“1”或“2”或“3”,2分)携带正确的重组质粒。
3
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9
解析:将P1、P2和P3引物共同加入反应体系,根据引物的位置可知,引物P1、P2可扩增普通质粒和重组质粒,扩增普通质粒时扩增出的DNA片段较小,扩增重组质粒时扩增出的DNA片段较大;引物P1、P3只能扩增重组质粒,不能扩增普通质粒,因此若未导入质粒则无扩增DNA片段,若导入普通质粒,则有一种DNA片段,若导入重组质粒,则有两种DNA片段,故菌落3携带正确的重组质粒。
1
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9
(3)通过单独或共同转化prkA基因、Rubisco基因获得三种大肠杆菌,涂布在同一平板的不同区域(区域①涂布未携带目的基因的大肠杆菌),一段时间后,菌落分布及生长状况如图4所示,推测区域②④内菌落携带的目的基因分别是_____________、_______________________。现有多种Rubisco突变基因,应用该共同转化体系可筛选出高活性Rubisco的依据是___________________________________________(2分)。
prkA基因
prkA基因、Rubisco基因
携带高活性Rubisco基因的菌落生长状况更好
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解析:未导入prkA基因、Rubisco基因时,大肠杆菌可正常代谢,若只导入prkA基因,则大肠杆菌产生的核酮糖-1,5-二磷酸会抑制大肠杆菌的生长,即②区域;若同时导入prkA基因、Rubisco基因,则在Rubisco的作用下,核酮糖-1,5-二磷酸和CO2结合形成3-磷酸甘油酸,参与大肠杆菌正常代谢,可缓解核酮糖-1,5-二磷酸对大肠杆菌的抑制作用,对应区域④;若只导入Rubisco基因,由于不含核酮糖-1,5-二磷酸,Rubisco无法起作用,与对照组相同,即③区域。Rubisco可缓解核酮糖-1,5-二磷酸对大肠杆菌的抑制作用,因此Rubisco越高,大肠杆菌菌落生长状况越好,即携带高活性Rubisco基因的菌落生长状况更好。
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(4)Rubisco的活性与植物有机物的积累密切相关。现已筛选出携带高活性Rubisco编码基因的重组质粒(无法转化植物),研究小组拟使用农杆菌转化法培育高产量大豆品种,简要写出实验思路_________________
__________________________________________________________________________________(2分)。
将重组质粒导入农杆菌,用农杆菌感染大豆愈伤组织,通过植物组织培养培育出大豆植株,筛选高产量大豆品种
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解析:农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上,根据受体植物的不同,所用的具体转化方法有所区别。携带高活性Rubisco编码基因的重组质粒无法转化植物,可将重组质粒导入农杆菌,用农杆菌感染大豆愈伤组织,通过植物组织培养培育出大豆植株,筛选高产量大豆品种。第3讲　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
明确 目标 1.理解基因工程的概念;　2.阐明重组DNA技术三种基本工具的作用;　3.阐明基因工程的基本操作程序及各步骤的作用;　4.掌握DNA粗提取和鉴定的方法,尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR产物;　5.举例说明基因工程在农牧业、食品工业及医药卫生等行业的广泛应用;　6.概述人们根据基因工程原理,进行蛋白质设计和改造,可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质;　7.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程;　8.认同生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全性与伦理问题。
建构 知识 体系
主题研习(一)　重组DNA技术的基本工具
(一)基因工程的概念分析
(二)基因工程的基本工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
来源 主要是从原核生物中分离纯化出来
作用 识别双链DNA分子的特定　　　　　　　,并使每一条链中特定部位的　　　　　断开
特征 一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列,并且能在特定的位点上切割DNA分子
结果 产生　　　　　和平末端
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 　　　　 T4噬菌体
特点 T4 DNA连接酶连接平末端的效率远高于E.coli DNA连接酶
作用 恢复被限制酶切开的　　　　　　,连接两个DNA片段
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
类型 常用:　　　;其他:噬菌体、动植物病毒等
条件 ①能自我复制或整合到受体DNA上,使目的基因稳定存在且数量可扩增;②具有一个至多个　　　　　　　　,供外源DNA片段(基因)插入;③具有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选
作用 携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞
(三)DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异,可以利用这些差异,选用适当的　　　　　　方法对它们进行提取。
(1)DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的　　　　　中溶解度不同,它能溶于　　　　的NaCl溶液。
(3)在一定温度下,DNA遇　　　　试剂会呈现蓝色。
2.实验步骤
3.DNA的粗提取与鉴定实验的四点注意事项
(1)该实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA的断裂,导致DNA不能形成丝状物。
(3)二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。
(4)在DNA进一步提纯时,选用预冷的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)重组DNA技术所需要的三种基本工具为限制酶、DNA连接酶和载体。 (　　)
(2)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。 (　　)
(3)DNA连接酶和DNA聚合酶作用方式相同。 (　　)
(4)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色。 (　　)
(5)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 (　　)
(6)“DNA的粗提取与鉴定”实验中,过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。 (　　)
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P71“旁栏思考”拓展)限制酶来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
(2)(人教版选择性必修3 P72“旁栏思考”拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗 试简要说明:
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)(2024·安徽高考真题改编)“DNA粗提取与鉴定”实验中利用　　　　　　　　　　　　　　差异,可初步分离DNA,纯化DNA的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　。
题点(一)　基因工程的操作工具
1.(苏教版选择性必修3 P88“知识链接”素材挖掘)下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是 (　　)
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 注:Y=C或T,R=A或G
BglⅡ A↓GATCT KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅠ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
A.限制酶的作用底物都是双链DNA,都能切开磷酸二酯键
B.BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
C.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列
D.一种限制酶可能识别多种核苷酸序列
2.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
　　[归纳拓展]
与DNA有关的几种酶作用特点分析
①从作用底物上分析
限制酶、DNA水解酶、解旋酶、DNA连接酶的作用底物都是DNA分子;DNA聚合酶的作用底物是脱氧核苷酸。
②从作用部位上分析
限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶的作用部位都是磷酸二酯键,而解旋酶的作用部位是碱基对间的氢键。
③从作用结果上分析
限制酶是将DNA分子切成一个或多个片段,而DNA连接酶是将两个DNA片段连接为一个DNA分子;DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接成一条单链,而DNA水解酶是将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸;解旋酶是将双链DNA分子解旋为单链。
题点(二)　DNA的粗提取与鉴定
3.(2024·山东高考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是 (　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
4.(2024·安徽高考)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
主题研习(二)　基因工程的基本操作程序与应用
(一)基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
目的 基因 在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指　　　　　　的基因
筛选 方法 从相关的已知　　　　　　清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
2.基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在　　　　　中稳定存在,并且遗传给下一代。
②使目的基因能够　　　和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
[微点拨]　启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点,启动转录过程
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
3.将目的基因导入受体细胞
类型 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 　　　　　　法、花粉管通道法 　　　　技术 Ca2+处理法
受体细胞 受精卵、体细胞 　　　 原核细胞
4.目的基因的检测与鉴定
(二)基因工程的应用
1.基因工程在农牧业方面的应用
(1)转基因　　　植物;　　(2)转基因抗病植物;
(3)转基因　　　　　植物;(4)改良植物的品质;
(5)提高动物的　　　　　;(6)改善畜产品的品质。
2.基因工程在医药卫生领域的应用
(1)对　　　　　　　　　　　进行基因改造,使它们能够生产药物。
(2)让哺乳动物批量生产　　　。
(3)可能使建立　　　　　工厂的设想成为现实。
3.基因工程在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (　　)
(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 (　　)
(3)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 (　　)
(4)构建基因表达载体时要注意保证目的基因上有启动子、终止子及标记基因等。 (　　)
(5)酶切片段和载体连接时,可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶。 (　　)
(6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。 (　　)
(7)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 (　　)
(8)从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径。 (　　)
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P77“相关信息”探究思考)
说明Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白一般不会对人畜产生危害的原因: 　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)(人教版选择性必修3 P81“资料卡”原理分析)
在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,需要将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)(人教版选择性必修3 P90“正文”分析)生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时必须把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)(2024·浙江选考改编)构建重组表达载体时,将目的基因和载体同时进行双酶切处理,然后利用　　　　　　连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用　　　　快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 　。
重难点(一)　基因工程的操作步骤
1.目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
①逆转录法
主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:
目的基因的mRNA双链DNA(目的基因)
②化学合成法
依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:
(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来从基因文库中获取目的基因。
2.基因表达载体的构建过程
3.目的基因的检测与鉴定方法
(1)载体上标记基因的标记原理:载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞,原理如图所示:
(2)目的基因的检测
①使用PCR等技术,检测目的基因是否插入转基因生物染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。
②采用抗原—抗体杂交技术,从转基因生物中提取蛋白质(作抗原),与相应抗体杂交,依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
③采用抗虫、抗病毒等接种实验,进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
　　[例1]　(2024·山东高考)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有　　　　种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5' 　　　　 3'和5' 　　　 3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素　　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　,其中纯合的突变植株是　　　(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
重难点(二)　限制酶的选择方法分析
1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类
(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶,如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点或确保质粒切割后产生的末端能与这两种酶切割后产生的末端连接。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
3.根据Ti质粒的T DNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
　　[例2]　若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙),限制酶的酶切位点分别是Bgl Ⅱ(—A↓GATCT—)、EcoR Ⅰ(—G↓AATTC—)和Sau3A Ⅰ(—↓GATC—)。下列方法最合适的是 (　　)
A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
听课随笔:
重难点(三)　PCR技术的操作原理和过程分析
1.PCR技术和DNA复制的比较
项目 PCR技术 DNA复制
场所 体外(PCR扩增仪中) 细胞内(主要是细胞核内)
解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶
温度条件 在较高温度下进行,需控制温度 细胞内温和条件
合成对象 DNA片段 DNA分子
相同点 均需要模板(DNA双链)、原料(四种脱氧核苷酸)、能量
2.PCR技术中的三个注意点
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,通常也需要引物,一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。
3.PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n-1
同时含引物A、B的DNA分子数 0 2 6 2n-2
共消耗的引物数量 2 6 14 2n+1-2
重难点(四)　PCR中引物的设计及应用
1.PCR中设计引物的意义及一般原则
意 义 ①DNA分子体外扩增时必须设计两种引物。 ②设计引物的首要目标是其特异性,只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定结构时才能达到这个目标(如图)
一 般 原 则 ①引物长度一般以20~30个核苷酸为宜,过短会降低特异性,过长会引起复性时结合的模板数减少,降低反应效率。 ②要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。 ③引物5'端可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等),便于克隆和表达。 ④引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性,以免造成不必要的非特异性扩增
2.引物的特殊应用
添加 酶位点 在PCR引物的5'端加上根据需要而设计的限制酶酶切位点,PCR产物内部无该切点
反向 PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增(见下图)
　　[例3]　(2025·成都模拟)某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α 淀粉酶基因(amy)的dsred2 amy融合基因,其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是 (　　)
A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链
B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D.杂交链延伸得到dsred2 amy融合基因的过程不需要加引物
听课随笔:
　　[例4]　(2024·大连二模)通过引物设计,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是 (　　)
A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3'端
B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等
C.第2轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
听课随笔:
重难点(五)　利用不同方式生产药物的区别
生产方式 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达,利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
受体与人类基因结构的差异 动物与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌与人类的基因结构有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 Ca2+处理法
生产条件 不需严格灭菌;温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
　　[例5]　运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产,目前常用的生物反应器有“乳腺生物反应器”和“膀胱生物反应器”,其构建过程如下:构建药用蛋白基因的表达载体,并将表达载体导入动物的受精卵中,然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是 (　　)
A.构建乳腺生物反应器时,需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起
B.在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因
C.与乳腺生物反应器相比,膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制
D.将表达载体导入哺乳动物的受精卵时,常采用显微注射技术
听课随笔:
题点(一)　基因工程的操作步骤与PCR技术
1.(2024·甘肃适应考)胰岛素可用于治疗糖尿病,我国科学家打破国外技术垄断,研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物,下列叙述错误的是 (　　)
A.用PCR技术扩增人胰岛素基因时,每次循环包括变性、复性、延伸三步
B.构建人胰岛素基因表达载体时,需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
C.大肠杆菌细胞经Ca2+处理后,更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体
D.抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
2.(2025年1月·八省联考晋陕宁青卷)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径,其基因表达载体如图(a),基因1、2和3为该途径的必需基因,基因大小分别为2 650 bp、1 240 bp和3 476 bp。回答下列问题。
(1)图(a)中,构建基因表达载体时用到的酶是　　　　　　　 　　　,片段X是　 　　　。
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前,需要用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　的生理状态,导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落,分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图(b)。据图可知,PCR时选用的引物对是图(a)中的　　　　　 　　　,选择该引物对进行鉴定的原因是　　　 　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　;
菌落B中未检测到目标条带,其原因是　　　 　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　。
(3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响,请针对其中任一因素,探究其对产物Z产量的影响,写出简要的实验思路: 　　　 　　　　　　　　　　 　　　 　　　　　　　　　　。
3.脱水素是青稞植株中的一种抗冻物质,脱水素基因Dhn4的结构如图1所示,其中B链为模板链。研究人员利用图2所示的质粒,通过农杆菌转化法将该基因导入草莓中,成功培育出了抗冻草莓植株。回答下列问题:
注:XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ为三种不同黏性末端的限制酶识别位点;AmpR为氨苄青霉素抗性基因。
(1)获取目的基因:提取青稞细胞的　　　　,经　　　　过程获得cDNA。在PCR扩增Dhn4时应选择的引物组合是　　　　　　,为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接,需在引物的　　　　(填“5'”或“3'”)末端分别添加限制酶　　　　　　　　　　(顺序需与选择的引物组合对应)的识别序列。
(2)构建基因表达载体:启动子的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　;多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率,如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度及　　　 　　　　　　　　　　　　　 　　　
　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　(举两例即可)等。
(3)导入、筛选受体细胞:将重组质粒导入农杆菌内,然后在含　　　　　的培养基上培养、筛选农杆菌,再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养,完成转化实验。
(4)转基因植株的培育与检测:转基因草莓叶片经脱分化形成　　　　　,然后通过调整培养基中的　　　　　　　　　　　(填植物激素类型)配比,最终获得幼苗。可通过　　　　处理,从个体生物学水平对转基因是否成功进行检测。
　　[归纳拓展]　农杆菌转化法的几个关键点
①农杆菌特点:能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力;其细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T DNA转移到被侵染的细胞中,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
②农杆菌转化法中的两次拼接与两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T DNA导入受体细胞。
③导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
题点(二)　基因工程的应用
4.当苹果削好皮或切开后放置一会儿,切口面的颜色就会由浅变深,最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物,酚类化合物易被氧化成醌类化合物,变成黄色,随着反应的量的增加颜色就逐渐加深,最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程,下列叙述不正确的是 (　　)
A.要想获得抗褐变的转基因苹果,目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B.步骤①需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C.步骤④使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D.为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果,可与导入不含目的基因质粒的植株作对照
5. (2025·南昌模拟)红细胞生成素(EPO)是人体促进红细胞生成的一种糖蛋白,可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然 EPO来源极为有限,某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器,使其能合成EPO。下列有关叙述正确的是 (　　)
A.构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的上游
B.一般情况下,该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中存在和表达
C.可用显微注射技术将含有EPO基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中
D.用PCR扩增人EPO基因,只需要知道EPO基因两端的核苷酸序列
课下请完成课时跟踪检测(五十八)
主题研习(三)　DNA片段的扩增与电泳鉴定及蛋白质工程
(一)DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验基础
PCR原理 利用了　　　　　　　原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合
电泳 DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷　　　的电极移动,这个过程就是电泳
产物鉴定 PCR的产物一般通过　　　　　　　来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　　　　　　等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为　　　 nm的紫外灯下被检测出来
2.PCR实验操作步骤和电泳鉴定
3.DNA片段的扩增及电泳鉴定注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行灭菌处理。
(2)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。
(3)观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
4.DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱分析
(1)线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子大小成　　　,分子越大则所受阻力越大,也越难在凝胶孔隙中移动,因而迁移得越慢,随着时间的推移,不同大小的DNA分子就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。
(2)将待测样品电泳条带与Marker(已知长度的DNA片段)进行对比,即可知道待测样品中DNA片段的长度,其中条带的宽度反映了　　　　　　　　。如下图所示:几个待测样品中DNA片段长度基本一致,约为750 bp,其中F2样品中DNA含量最少。
(二)蛋白质工程的原理和应用
1.蛋白质工程的概念
2.蛋白质工程的基本思路
3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
实质不同 蛋白质工程是定向改造或生产人类所需的蛋白质;基因工程是定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的类型或生物产品
过程不同 参见相应的知识梳理内容(略)
结果不同 蛋白质工程可生产自然界没有的蛋白质;基因工程只能生产自然界已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程;基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢。 (　　)
(2)将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸,B链末端增加2个精氨酸,可制备出一种人工长效胰岛素。该胰岛素可通过蛋白质工程方法生产。 (　　)
(3)利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。加入连接肽需要通过改造基因实现。 (　　)
(4)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份,并在20 ℃条件下储存。 (　　)
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P84“探究·实践”拓展分析)
①DNA片段电泳鉴定的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
②电泳鉴定时出现非特异性条带的原因可能有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)(人教版选择性必修3 P96“到社会中去”思考)
酶制剂的生产已经形成新兴产业,蛋白质工程在酶制剂产业中的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

题点(一)　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.(2024·黑吉辽高考)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 (　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
2. (2024·湖南高考，改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.上述PCR反应体系中需加入两种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢
C.5' CTACCCGTGAT 3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
题点(二)　蛋白质工程的原理和应用
3.(2024·韶关二模)科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素(一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质)第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸,显著提高了它的抗凝血活性,流程图如下。已知天冬酰胺对应的密码子为AAU、AAC,赖氨酸对应的密码子为AAA、AAG。下列叙述错误的是 (　　)
A.上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B.在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C.上图中大分子物质a和b的单体序列均是唯一的
D.用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
主题研习(四)　生物技术的安全性与伦理问题
(一)转基因产品的安全性
(二)关注生殖性克隆人
1.治疗性克隆和生殖性克隆的比较
项目 治疗性克隆 生殖性克隆
概念 利用克隆技术产生　　　　　　　　　,用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官,从而达到　　　　的目的 通过克隆技术产生独立生存的新个体
目的 用于医学研究或治疗疾病 用于生育,产生新个体
水平 　 　水平、组织水平或器官水平 个体水平
联系 都属于无性生殖,产生的新个体或新组织的核遗传物质均不发生变化
2.生殖性克隆人面临的伦理问题
(1)生殖性克隆人“有违人类尊严”。
(2)生殖性克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人。
(3)克隆技术还不成熟,生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题。
3.生殖性克隆与治疗性克隆的主要过程
(三)试管婴儿与设计试管婴儿的异同点
不同点 技术手段 设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断HLA的类型等),试管婴儿不需进行遗传学诊断。 如下图,设计试管婴儿比试管婴儿多了d过程:
应用 试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题,设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗
相同点 都是体外受精,并进行体外早期胚胎培养,都要经过胚胎移植,都是有性生殖
(四)生物武器
种类 ①致病菌类:炭疽杆菌、霍乱弧菌等 ②病毒类:天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等 ③　　　　　类:肉毒杆菌毒素等
特点 致病能力　　　,攻击范围　　　
散布 途径 可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布,经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内,造成大规模伤亡,也能大量损害植物
自我诊断
1.概念理解(判断正误)
(1)转基因品种经检测含有目的基因后即可上市。 (　　)
(2)“设计试管婴儿”与“试管婴儿”相比,前者在胚胎移植前需要对胚胎进行遗传学诊断。 (　　)
(3)我国反对生物武器,但在特殊情况下可以生产生物武器。 (　　)
(4)若转基因植物的外源基因来源于自然界,则不会存在安全性问题。 (　　)
2.事理分析
(1)(人教版选择性必修3 P106“正文”发掘)生殖性克隆与治疗性克隆最主要的区别是　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)(人教版选择性必修3 P113“正文”发掘)对待生物武器的态度与对待转基因产品安全性的态度的不同是　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
题点(一)　生物技术的安全性
1.(2025·张掖模拟)“某生物实验室感染病毒的小白鼠逃了”曾登上热搜,使得生物技术的安全性问题再次引发关注。下列叙述错误的是 (　　)
A.对实验生物应该进行严格闭环管理
B.通过治疗性克隆,可以解决人体移植器官短缺问题
C.生物武器种类多样,包括病毒类、毒品类、致病菌类等
D.生物安全防控应消除生物武器威胁、防止生物武器及其技术和设备扩散
2.(2025·安庆一模)下列关于转基因生物安全性的叙述,正确的是 (　　)
A.转基因作物种植区应与传统农业种植区混合
B.转基因作物被动物食用后,目的基因会转入动物体细胞中
C.种植转基因作物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性
D.以转基因大豆为原料制成的大豆油在销售时无须标注“转基因大豆”
题点(二)　治疗性克隆与生殖性克隆
3.(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述正确的是 (　　)
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.治疗性克隆不需要监控和审查
C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
4.(2025·哈尔滨模拟)治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥反应具有重要意义。流程如图所示。下列相关叙述正确的是 (　　)
A.核移植过程中需对卵母细胞去核,这里的“核”是指纺锤体—染色体复合物
B.将图中获得的组织器官移植给个体A,则基本不会发生免疫排斥反应
C.体细胞在体外培养时需要提供适量CO2,作为体液因子调节呼吸运动
D.治疗性克隆过程不产生独立生存的新个体,不存在任何伦理道德问题
第3讲　基因工程及生物技术的安全性 与伦理问题
主题研习(一)
基础全面落实
(一)目的基因　基因重组　受体　分子
(二)1.核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端　
2．大肠杆菌　磷酸二酯键　3.质粒　限制酶切割位点
(三)1.物理或化学　(2)NaCl溶液　2 mol/L　(3)二苯胺
[自我诊断]
1．(1)√　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×　(6)√
2．(1)原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链的末端
(3)DNA和蛋白质在酒精中的溶解度　DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同
考向精细研究
1．选C　限制酶能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，A正确；BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端，均为GATC—，B正确；据题表可知，Sau3AⅠ特异性识别4个核苷酸序列，C错误；HindⅠ的识别序列为GTY↓RAC，其中Y＝C或T，R＝A或G，说明其识别序列并非一种，则一种限制酶可能识别多种核苷酸序列，D正确。
2．选C　用酶3切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coli DNA连接酶连接酶3切出的平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。
3．选A　研磨后，可以将研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，可以不使用离心机，A正确，B错误。鉴定过程中的沸水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误。该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加DNA的对照组，D错误。
4．选D　研磨液有利于DNA的溶解并保护DNA不被破坏，若换为蒸馏水，则DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，不能检测溶液中是否有蛋白质杂质，D错误。
主题研习(二)
基础全面落实
(一)1.(1)编码蛋白质　结构和功能　(2)引物　脱氧核苷酸　耐高温　温度　两种引物　耐高温的DNA聚合酶　琼脂糖凝胶电泳　2.(1)①受体细胞　②表达　(2)RNA聚合酶　转录　3.农杆菌转化　显微注射　受精卵　4.抗原—抗体杂交　抗性接种实验
(二)1.(1)抗虫　(3)抗除草剂　(5)生长速率　2.(1)微生物或动植物的细胞　(2)药物　(3)移植器官
[自我诊断]
1．(1)√　(2)×　(3)×　(4)×　(5)√　(6)√　(7)√　(8)√
2．(1)Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害
(2)Ti质粒上的T DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上
(3)只有连接了乳腺中特异表达的基因的启动子，才能保证相应的目的基因在雌性动物泌乳期乳腺细胞内得以表达
(4)DNA连接酶　PCR　热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
重难深化拓展
[例1]　解析：(1)引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增，即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上，进而导致非特异性产物的形成，影响PCR的特异性和准确性。结合BsaⅠ识别序列可知，BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基，故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4＝44(种)。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′ GTTT 3′和5′ CAAT 3′。
(2)根据图甲可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图乙、丙可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，结合电泳结果可知，只能选用限制酶SacⅠ酶切PCR产物；限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙的电泳结果可知，只有④为纯合突变的植株。
(3)设基因L突变为基因L′，则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L′L′，由题中信息知，一条染色体插入了T DNA，若其插入了L′所在染色体，其所在染色体记为L′1，则其自交子代的基因型及比例为L′1L′1∶L′1L′∶L′L′＝1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代，筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L′L′)所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体，所得结果相同。
答案：(1)低　44　GTTT　CAAT　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4
[例2]　选D　用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，A不符合题意；用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因，相当于只用EcoRⅠ切割目的基因，但EcoRⅠ和BglⅡ对P1噬菌体载体正常切割，而EcoRⅠ和BglⅡ切割后产生的黏性末端不同，故BglⅡ和EcoRⅠ切割的目的基因无法与BglⅡ和EcoRⅠ切割的P1噬菌体载体连接，B不符合题意；用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，会导致目的基因的插入方向与图丙中所示的RNA聚合酶的移动方向相反，C不符合题意；用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，既能产生不同的黏性末端，又能防止发生反向连接，且这样目的基因插入载体后，RNA聚合酶的移动方向与图丙实线方向相同，D符合题意。
[例3]　选C　利用PCR技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酶来打开DNA双链，A正确；引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增，B正确；dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；由题图可知，杂交链延伸得到dsred2 amy融合基因的过程中，不需要加入引物，D正确。
[例4]　选D　DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，据此可知，图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5′端，A错误；PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2＋)等物质，B错误；由图可知，第2轮PCR中引物1与图中②结合并未形成两条链等长的突变基因，C错误；在第3轮PCR结束后，会产生23＝8(个)DNA分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有2个，其他的DNA分子的两条链均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4，D正确。
[例5]　选B　启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，以保证目的基因在乳腺细胞中表达，A正确；受体细胞是动物的受精卵，所以在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的其他细胞中也含有药用蛋白基因，只是没有表达，B错误；“乳腺生物反应器”只能从哺乳期雌性个体的乳汁中获取产物，与“乳腺生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”的优点是雌雄个体的尿液中都可提取到产物，且不受年龄的限制，C正确；将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术，D正确。
考向精细研究
1．选D　用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，A正确；在构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子，B正确；大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确；抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成人胰岛素，若抗原—抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中成功表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。
2．解析：(1)构建基因表达载体时用到的酶是限制酶、DNA连接酶。质粒上一般包含启动子、终止子、复制原点、标记基因(抗性基因)，结合图(a)分析，片段X是复制原点。
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这样有利于重组DNA分子的导入。电泳结果显示，菌落A和C相应基因大小介于2 000 bp～3 000 bp之间，结合目的基因上的引物分析，应该选择引物2和引物5，该引物对扩增的区段包含了完整的基因2和基因1、基因3的部分片段，这样可以很好的判断大肠杆菌中是否成功导入了目的基因。菌落B中未检测到目标条带，即不含目的基因但含抗性基因，其原因是菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒。
(3)本实验的实验目的是探究温度、pH和溶解氧等发酵条件对产物Z产量的影响，实验自变量是温度或pH或溶解氧，检测指标是产物Z的产量。实验思路见答案。
答案：(1)限制酶、DNA连接酶　复制原点　(2)能吸收周围环境中DNA分子　引物2和引物5　两种引物扩增的区段包含了完整的基因2和基因1、基因3的部分片段　菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒　(3)将工程菌株随机分成若干份，分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中，其他环境条件相同且适宜，一段时间后测定产物Z的产量
3．解析：(1)青稞细胞中的mRNA经过逆转录可获得cDNA。引物能使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，故应选择引物方向是从5′→3′延伸，即引物Ⅱ和引物Ⅲ。限制酶序列应添加在目的基因的外侧，不影响目的基因的序列，故添加在5′端。因为B链为模板链，转录的方向是沿着模板链的3′→5′，应将Dhn4基因的左端与启动子一侧连接，又因为目的基因中含有PstⅠ的识别序列，不能选用，故在引物Ⅱ、Ⅲ的5′端添加的限制酶序列分别是KpnⅠ和XhoⅠ。
(2)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因转录。多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率，如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度及Dhn4基因浓度(目的基因浓度)、质粒与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度等。
(3)基因表达载体上的AmpR属于标记基因，故可将重组质粒导入农杆菌内，然后在含氨苄青霉素的培养基上培养、筛选农杆菌，再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养，完成转化实验。
(4)转基因草莓叶片经脱分化形成愈伤组织，然后通过调整培养基中的生长素和细胞分裂素配比，最终获得幼苗。从个体生物学水平可通过低温(或抗冻性检测)处理对转基因是否成功进行检测。
答案：(1)mRNA　逆转录　引物Ⅱ、Ⅲ　5′　Kpn Ⅰ、XhoⅠ　(2)RNA聚合酶识别与结合的部位，启动转录　Dhn4基因浓度(目的基因浓度)、质粒与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度　(3)氨苄青霉素　(4)愈伤组织　生长素与细胞分裂素　低温(抗冻性检测)
4．选B　由题意可知，要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确；步骤①是基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确；为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照，D正确。
5．选D　构建表达载体时需将EPO基因(目的基因)插入乳腺蛋白基因的启动子的下游，A错误；由题意可知，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达，但培育该转基因羊时，EPO基因是被导入至受精卵中，羊的其他细胞中也存在EPO基因，B、C错误；用PCR扩增目的基因时，只需知道目的基因两端的核苷酸序列，D正确。
主题研习(三)
基础全面落实
(一)1.DNA的热变性　相反　琼脂糖凝胶电泳　大小和构象　300
2．微量移液器　离心管　底部　凝胶边缘　
4．(1)反比　(2)DNA含量的多少
(二)2.蛋白质结构　氨基酸序列　脱氧核苷酸序列
[自我诊断]
1．(1)×　(2)√　(3)√　(4)×
2．(1)①DNA分子在一定的pH下带负电，在电场力的驱动下，从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中移动；核酸染料带正电，在电场力的驱动下，从正极向负极运动，遇到DNA就嵌入其中完成染色，这个颜色在可见光下看不到，但经紫外光激发可被检测出来
②模板DNA出现污染；Taq DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体；PCR循环次数过多等
(2)对酶进行改良和优化，以提高酶的稳定性、活性和特异性，从而提高酶制剂的效果和经济性
考向精细研究
1．选A　琼脂糖凝胶的浓度、待测样品中DNA分子的大小和构象等都会影响DNA分子在电泳中的迁移速率，故琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小，A正确；在电泳过程中，凝胶载样缓冲液中的指示剂不会与DNA结合，而是随着电流的通过而移动，可用于确定样品的迁移方向和距离，不能用于指示DNA分子的具体位置，B错误；在同一电场作用下，DNA片段越长，即DNA相对分子质量越大，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
2．选C　利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A错误。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5′ CTACCCGTGAT 3′，患者的测序结果为5′ CTACCTGTGAT 3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。
3．选C　通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构，进而明确氨基酸序列，最终确定基因中碱基对的排列顺序，A正确；蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因，B正确；由于天冬酰胺和赖氨酸对应的密码子均不是唯一的，则大分子物质a和b的单体序列均不是唯一的，C错误；基因工程是利用已有的基因生产蛋白质，而蛋白质工程师通过改造或合成基因从而获得原本没有的蛋白质，因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质，D正确。
主题研习(四)
基础全面落实
(二)1.特定的细胞、组织和器官　治疗疾病　细胞
(四)生化毒剂　强　广
[自我诊断]
1．(1)×　(2)√　(3)×　(4)×
2．(1)克隆的目的不同，生殖性克隆的目的是用于生育，产生新个体；治疗性克隆的目的是用于医学研究或治疗人类疾病
(2)对待生物武器的态度是在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散；对待转基因产品安全性的态度是趋利避害，而不能因噎废食
考向精细研究
1．选C　实验生物可能导致直接接触者被病毒感染，故对实验生物应该进行严格闭环管理，A正确；治疗性克隆是指将患者的细胞诱导成特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，通过治疗性克隆，可以解决人体移植器官短缺问题，B正确；生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，不包括毒品类，C错误；消除生物武器威胁、防止生物武器及其技术和设备扩散，是生物安全防控的重要方面，D正确。
2．选C　若转基因作物种植区与传统农业种植区混合，容易导致基因扩散，可能会影响野生植物的基因库，从而改变野生植物的遗传多样性，A错误，C正确；转基因作物被动物食用后，相关基因会被分解成核苷酸，因此不会转入动物体细胞中，B错误；以转基因大豆为原料制成的大豆油在销售时需要标注为“转基因大豆加工品(制成品)”或“加工原料为转基因大豆”，D错误。
3．选D　试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的，A错误；治疗性克隆要在严格监管下进行，B错误；生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题，C错误。
4．选A　核移植过程中需对处于减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞去核，这里的“核”其实是纺锤体—染色体复合物，A正确；将图中获得的组织器官移植给个体B，则基本不会发生免疫排斥反应，B错误；体细胞在体外培养时需要提供适量CO2，CO2的主要作用是维持培养液的pH，C错误；治疗性克隆也会面临伦理问题，D错误。课时跟踪检测(五十八)　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题[对应主题研习(一)(二)]
一、选择题
1.(2025·长春模拟)“DNA的粗提取与鉴定”实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”,下列说法正确的是 (　　)
A.实验材料可以选择猪的成熟红细胞或肝细胞
B.将研磨液从冰箱中取出后取沉淀物继续进行实验
C.进行DNA鉴定时,对照组不需要加入DNA
D.可以利用DNA溶于酒精的特性将DNA提取出来
2.菊花是一种双子叶植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长,还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列叙述错误的是 (　　)
A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B.将目的基因GNA插入Ti质粒的T DNA上构建表达载体
C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D.应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
3.(2025·大理模拟)当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后,目的基因可能正向插入载体,也可能反向插入载体(如图),为判断目的基因的插入方向,可使用限制酶处理,并进行电泳检测。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是 (　　)
注:EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列、切割位点均不同,数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数(bp),质粒全长20 000 bp。
A.Hind Ⅲ B.EcoR Ⅰ
C.BamH Ⅰ D.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ
4.现如今随着技术的不断发展,人们发明了多种PCR技术的衍生版本,如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述,正确的是 (　　)
A.已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来,因此可用于较长DNA分子的人工合成
B.已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异,因此可用于病毒的检测与分析
C.已知热不对称性PCR可通过调节复性温度产生多种产物,因此操作时对温度的要求低于常规PCR
D.已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号,因此可用于亲子鉴定
5.(2025·宜昌模拟)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中的实践中,某同学选用EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述,正确的是 (　　)
A.可以避免质粒或者目的基因自身环化
B.可以避免目的基因与质粒反向连接
C.可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
D.可以避免受体菌的EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ将重组质粒中的目的基因切割下来
6.紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素(紫色)。紫色花青素能降低人类患心脏病、糖尿病的风险。如图是花青素基因(S)的cDNA和Ti质粒。下列叙述错误的是 (　　)
A.可以选用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒
B.在用农杆菌侵染时,常要使用一些抗生素来抑制农杆菌生长和筛选转化细胞
C.用于扩增 S基因的引物需满足的条件之一是两种引物分别与两条模板链 3'端的碱基序列互补配对
D.若检测出标记基因所表达的性状,则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞
7.ω 3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)有预防心血管疾病的作用,但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术(将外源DNA转入受体细胞的技术)将LCPUFA合成酶基因(fat 1基因,含1 229 bp)导入小鼠受精卵,培育出转基因小鼠,基本流程如下图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后,利用fat 1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是 (　　)
A.采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B.PCR扩增3轮后,只含一种引物的DNA分子的比例为1/4
C.由图乙可知,只有2组转染成功
D.若fat 1基因单点插入,则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA
8.(2025·长沙模拟)青蒿素是有效的抗疟疾药物,但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况,科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织,获得了黄花蒿的冠瘿组织,改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是 (　　)
A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法
B.图中P位于基因的上游,作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录
C.图中还缺少的结构是标记基因,标记基因的作用是表达出目的基因产物
D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上,可采用PCR技术
9.(2025·景德镇模拟)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述错误的是 (　　)
A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B.设计的引物中GC碱基含量越高,复性的温度越高
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶
卷码 600017121 姓名
1 2 3 4 5 6 7 8 9
二、非选择题(除特别注明外,每空1分)
10.(11分)(2025·泉州模拟)近年来随着甲醇工业产能过剩的情况日益严重,研究人员通过构建甲醇工程菌来有效利用甲醇。RuMP途径是目前研究较多的甲醇同化途径之一,其中MDH酶是同化甲醇的关键酶之一,现科学家利用下图质粒构建表达载体,制备可利用甲醇的大肠杆菌。
(1)为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体,需在目的基因的两端分别加上　　　　的碱基序列。(填编号,2分)
①EcoRⅠ　②KpnⅠ　③Acc65Ⅰ　④BglⅡ
(2)应选取氨苄青霉素　　　　(填“敏感型”或“耐药型”)的大肠杆菌作为受体细胞,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
(3)甲醇工程菌培养12 h后,挑取单菌落分离DNA进行PCR扩增,若扩增后的DNA样品电泳结果显示有1 566 bp的片段,则下图(深色部分为目的基因区段)中对应DNA片段的引物为　　　　(填图中序号,2分)。
(4)DNA探针是一种人工合成的具有特定核苷酸序列的单链DNA片段,利用DNA探针与待测样本中DNA互补结合,可确定受体细胞中是否含有目的基因。检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因,原因可能是表达过程中的　　　　　过程受阻;现拟利用DNA探针对该原因做出进一步的精准判断,请简要写出实验思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(3分)。
11.(9分)(2025·北京通州模拟)学习下面材料,回答(1)~(5)题。
CRISPR Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统。细菌中转入有益基因时,CRISPR基因功能会缺失,当外源基因对细菌生存造成威胁时,CRISPR的表达会发生上调,启动细菌的适应性免疫。其防御机制分为适应阶段、基因表达阶段和干扰阶段。
有害的外源核酸中部分短序列会被细菌整合并插入到其CRISPR序列中(图1)、随后相关基因表达出Cas蛋白、TracrRNA,以及CRISPR序列会表达出一条前体crRNA(Pre crRNA),Pre crRNA的某些序列被剪切,形成多个crRNA。
每条crRNA、TracrRNA与Cas蛋白形成稳定的效应复合物。在干扰阶段中,复合物中Cas蛋白使外源DNA解旋,RNA①与之互补配对形成特殊结构,随后Cas蛋白构象发生变化并切割该段DNA的特定序列。在此过程中,Cas蛋白主要切割与RNA①互补配对的DNA单链的H位点和非互补配对链的R位点(如图2所示)。
经改造的细菌CRISPR Cas系统已被广泛应用到基因定点编辑、基因组筛选、基因转录调控等领域、但仍存在许多问题有待深入解决与探索。
(1)细菌将外源DNA整合到CRISPR序列中,是对可遗传变异类型中的　　　　　的扩展。
(2)结合图1分析,有害的外源DNA被细菌整合并插入到CRISPR序列中,成为　　　　序列,CRISPR序列中　　　　序列的转录产物存在核酸酶的识别位点,因此Pre crRNA被剪切形成多个crRNA。结合图2分析,TracrRNA和crRNA有　　　　(选填“相同”或“互补”)序列,可相互结合,进而与Cas蛋白形成效应复合物。
(3)结合材料分析,图2中RNA①是　　　　(填“crRNA”或“TracrRNA”),起到对外源DNA的识别作用,进而将复合物精准定位。
(4)下列说法正确的有　　　　(2分)。
A.细菌体内的Cas是具有类似解旋酶和限制酶作用的双功能蛋白
B.Cas剪切外源DNA片段的精准性与RNA①的长度呈正相关
C.可通过CRISPR Cas技术靶向治疗21 三体综合征患者
D.细菌CRISPR序列中重复序列的种间差异小于间隔序列
(5)从进化观分析,转入有益基因时,细菌CRISPR基因功能缺失的积极意义是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
12.(14分)(2024·邢台二模)研究发现,GsERF6基因可以提高水稻的耐盐性。图1是某研究小组利用PCR技术扩增GsERF6基因的过程,图2是该研究小组通过基因工程的方法获得GsERF6基因超表达水稻新品种的过程。请据图分析回答下列有关问题:
(1)图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的　　　　　,这两个步骤的温度都相对较高,可能与　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)中碱基C和G的含量较高有关;循环n次能获得等长目的基因　　　　个。
(2)图2中A为构建的GsERF6基因超表达载体的部分序列(图中和分别为T DNA的左、右边界,NeoR为新霉素抗性基因,为终止子),35S的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
(3)超表达载体中T DNA的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分),将重组GsERF6基因超表达载体导入农杆菌,①过程利用含　　　　的培养基筛选出重组的农杆菌。
(4)愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有　　　　　　　　,另外该过程还需要光照,光照的作用是
　　　　　　　　　　　　(写出两个,2分)。
(5)请你设计实验检验此转基因水稻新品种是否培育成功:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
(写出实验设计思路,2分)。
13.(11分)(2025年1月·八省联考河南卷)核酮糖 1,5 二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是植物固定CO2的关键酶。某研究小组通过导入相关基因在大肠杆菌中搭建图1所示的代谢通路,以筛选结合CO2能力更强的Rubisco。回答下列问题。
(1)为将Rubisco基因导入大肠杆菌,研究小组使用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切以构建重组质粒。图2表达载体中,片段2为　　　　　(填“启动子”或“终止子”),其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
(2)为检测转化的菌落是否携带含有Rubisco基因的重组质粒,将P1、P2和P3引物(引物位置如图2所示,→表示引物5'→3'方向)共同加入反应体系后,分别以3个菌落的DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示,菌落　　　(填“1”或“2”或“3”,2分)携带正确的重组质粒。
(3)通过单独或共同转化prkA基因、Rubisco基因获得三种大肠杆菌,涂布在同一平板的不同区域(区域①涂布未携带目的基因的大肠杆菌),一段时间后,菌落分布及生长状况如图4所示,推测区域②④内菌落携带的目的基因分别是　　　　　　　、　　　　　　　　　。现有多种Rubisco突变基因,应用该共同转化体系可筛选出高活性Rubisco的依据是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
(4)Rubisco的活性与植物有机物的积累密切相关。现已筛选出携带高活性Rubisco编码基因的重组质粒(无法转化植物),研究小组拟使用农杆菌转化法培育高产量大豆品种,简要写出实验思路　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2分)。
课时跟踪检测(五十八)
1．选C　猪为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA粗提取时，要将研磨液过滤到烧杯中，在冰箱放置一段时间后，由于上清液中含有DNA和蛋白质，故取上清液继续进行实验，B错误；进行DNA鉴定时，对照组不需要加入DNA，只加二苯胺试剂作为空白对照组，目的是与实验组进行颜色对照，以鉴定提取出的物质是DNA，C正确；利用DNA不溶于酒精的特性，而蛋白质等溶于酒精的特性，可将DNA与蛋白质等分离，D错误。
2．选A　分析题意可知，需将目的基因导入菊花细胞，故受体细胞可以选择菊花叶片细胞，但不能选择桃蚜细胞，A错误；基因工程中构建表达载体时，由于TDNA可以转移到受体细胞内，所以可以将目的基因GNA插入Ti质粒的TDNA上，B正确；菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功导入，C正确；应用抗虫接种实验，检测转GNA基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度，D正确。
3．选B　图中质粒用限制酶Hind Ⅲ处理，并进行电泳后，无论正向插入还是反向插入均会出现DNA片段为5 000＋4 000＝9 000(bp)和1 000＋2 000＋5 000＋3 000＝11 000(bp)，因此用该限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向，A不符合题意；图中质粒用限制酶EcoR Ⅰ处理，并进行电泳后，正向插入的质粒会出现的DNA片段为1 000＋2 000＋5 000＝8 000(bp)和5 000＋4 000＋3 000＝12 000(bp)，而反向插入的质粒切割后会出现的DNA片段为1 000＋2 000＋4 000＝7 000(bp)和5 000＋3 000＋5 000＝13 000(bp)，因此正向插入和反向插入用限制酶EcoR Ⅰ处理，并进行电泳后，得到的DNA片段大小不同，可以判断目的基因的插入方向，B符合题意；图中质粒用限制酶BamH Ⅰ处理，并进行电泳后，无论正向插入还是反向插入均会出现DNA片段为5 000＋1 000＝6 000(bp)和4 000＋2 000＋5 000＋3 000＝14 000(bp)，因此用该限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向，C不符合题意；图中质粒用限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ共同处理，并进行电泳后，无论正向插入还是反向插入均会出现DNA片段为2 000＋1 000＝3 000(bp)、5 000 bp、4 000 bp、5 000＋3 000＝8 000(bp)，因此用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向，D不符合题意。
4．选A　重叠延伸PCR可将多个DNA片段连接起来，因此可用于较长DNA分子的人工合成，A正确；等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，可用于亲子鉴定以及遗传病的筛查，无法检测是否存在某种病毒，B错误；热不对称性PCR需对温度进行精细控制，对温度的要求高于常规PCR，C错误；荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，可用于某些病毒的检测，无法判断两份DNA间的细微差别，因此无法用于亲子鉴定，D错误。
5．选D　两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免质粒或者目的基因自身环化，也不能避免目的基因与质粒反向连接，A、B错误；两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因，C错误；若质粒被EcoR Ⅰ酶切后的黏性末端与目的基因被Mfe Ⅰ酶切后的黏性末端连接，质粒被Mfe Ⅰ酶切后的黏性末端与目的基因被EcoR Ⅰ酶切后的黏性末端连接，则正好将目的基因正向连接，这样的重组质粒，既无EcoR Ⅰ识别位点，又无Mfe Ⅰ识别位点，故可以避免受体菌的EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ将重组质粒中的目的基因切割下来，D正确。
6．选D　由图可知，选用Xba Ⅰ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒，既能保证目的基因与载体产生相同的黏性末端，又不破坏目的基因，A正确；在用农杆菌侵染时，既要筛选转化细胞，又要避免农杆菌的大量繁殖，因此培养基中通常加入抗生素，B正确；用于扩增S基因的引物需满足的条件之一是两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对，以保证子链从5′端向3′端延伸，C正确；若检测出目的基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞，D错误。
7．选A　农杆菌转化法适用于植物细胞，对于动物细胞受精卵而言应采用显微注射法，A错误；PCR扩增3轮后，共得到8个DNA分子，只有最原始的1个DNA分子的两条链不含引物，导致含有这两条链的2个DNA分子只含有其中一种引物，其余6个DNA分子均含有2种引物，故PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为1/4，B正确；据图乙可知，仅2组出现条带，且条带介于1 000～2 000 bp，说明只有2组转染成功，C正确；若fat1基因单点插入，相应的基因型表示为FO(F表示插入fat1基因)，则转基因小鼠相互交配后代基因型为1FF、2FO、1OO，即产生的大多数后代体内能合成LCPUFA，D正确。
8．选C　将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；图中P为启动子，位于基因的上游，作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录，B正确；图中还缺少的标记基因等结构，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来，C错误；要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用PCR技术，D正确。
9．选C　DNA子链合成的方向为5′端到3′端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确；引物中GC碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性时的温度越高，B正确；PCR产物是包含所有未知序列和部分已知序列的链状DNA分子，C错误；整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温DNA聚合酶，D正确。
10．解析：(1)由题图可知，Kpn Ⅰ的酶切位点在AmpR之中，Acc65 Ⅰ识别的序列与KpnⅠ识别的序列相同，不能选择KpnⅠ和Acc65Ⅰ，否则会破坏AmpR，因此为了使目的基因能与图示质粒高效正确构建表达载体，需在目的基因的两端分别加上EcoRⅠ和BglⅡ的碱基序列。
(2)氨苄青霉素敏感型的大肠杆菌对氨苄青霉素没有抗性，由于质粒上有氨苄青霉素的抗性基因，若导入质粒，则氨苄青霉素敏感型大肠杆菌能抗氨苄青霉素，应选取氨苄青霉素敏感型的大肠杆菌作为受体细胞，理由是有利于受体细胞的筛选。
(3)由图可知，若扩增后的DNA样品电泳结果显示有2 402－908＋72＝1 566(bp)片段，则对应DNA片段的引物为⑤⑦。
(4)检测发现部分受体细胞无目的蛋白却有目的基因，原因可能是表达过程中的转录或翻译过程受阻；要对原因做出进一步的精准判断，可以用目的基因的一条链设计成探针(探针核苷酸序列与目的基因转录时的模板链相同)，对目的基因的转录产物mRNA进行分子杂交，检测是否出现杂交带，如果出现杂交带，说明出现这种现象的原因是翻译过程受阻；如果没有出现杂交带，说明出现这种现象的原因是转录过程受阻。
答案：(1)①④　(2)敏感型　有利于受体细胞的筛选　(3)⑤⑦　(4)转录或翻译　用目的基因的一条链设计成探针(探针核苷酸序列与目的基因转录时的模板链相同)，对目的基因的转录产物mRNA进行分子杂交，检测是否出现杂交带
11．解析：(1)将外源DNA整合到CRISPR序列中，属于广义上的基因重组。
(2)由图1可知，有害的外源DNA被细菌整合并插入到CRISPR序列中成为间隔序列。CRISPR序列会表达出一条PrecrRNA，而PrecrRNA会被剪切，形成多个crRNA，因此PrecrRNA是CRISPR序列中重复序列的转录产物且PrecrRNA上存在核酸酶的识别位点。结合图2可知，TracrRNA和crRNA有互补序列，可以相互结合，进而与Cas蛋白形成效应复合物。
(3)结合材料和图2可知，RNA①是crRNA，起到对外源DNA的识别作用，进而将复合物精准定位。
(4)由材料可知，Cas是具有类似解旋酶(解开DNA的双螺旋)和限制酶(对DNA进行切割)作用的双功能蛋白，A正确；由材料可知，Cas剪切外源DNA片段的精准性与RNA①的长度呈正相关，即越长越精准，B正确；21三体综合征是多了一条染色体，CRISPRCas技术针对基因，不能靶向治疗该病，C错误；细菌CRISPR序列中重复序列的种间差异小于间隔序列，D正确。
(5)CRISPR基因会对外源基因进行切割，因此转入有益基因时，细菌CRISPR基因功能缺失有利于细菌获取有益基因，获得新性状，更好的适应环境。
答案：(1)基因重组　(2)间隔　重复　互补　(3)crRNA　(4)ABD　(5)有利于细菌获取有益基因，获得新性状，更好地适应环境
12．解析：(1)图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的变性、复性，这两个步骤的温度都相对较高，可能与模板DNA和两种引物中碱基C和G的含量较高有关，因为碱基C和G之间可以形成三个氢键。由图1可知，第三次循环可以得到两个等长目的基因，因此循环n次能获得等长目的基因2n－2n个。
(2)图2中A为构建的GsERF6基因超表达载体的部分序列，由于A中应存在终止子、目的基因、标记基因、启动子，结合题意可知，35S是启动子，作用是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA。
(3)TDNA又叫可转移的DNA，因此TDNA的作用是将目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上。将重组GsERF6基因超表达载体导入农杆菌，①过程利用含新霉素的培养基筛选出重组的农杆菌。
(4)愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有生长素和细胞分裂素，另外该过程还需要光照，光照的作用是诱导叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
(5)检验此转基因水稻新品种是否培育成功可以将此转基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中，观察和对比这两种水稻的长势。
答案：(1)变性、复性　模板DNA和两种引物　2n－2n　(2)RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA　(3)将目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上　新霉素　(4)生长素和细胞分裂素　诱导叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要　(5)将此转基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中，观察和对比这两种水稻的长势
13．解析：(1)转录过程中，mRNA延伸的方向是5′→3′，因此根据模板链的位置可知Rubisco基因转录的方向是从右向左，即EcoRⅠ靠近启动子，BamHⅠ靠近终止子，即片段2为启动子，片段1是终止子；启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录。(2)将P1、P2和P3引物共同加入反应体系，根据引物的位置可知，引物P1、P2可扩增普通质粒和重组质粒，扩增普通质粒时扩增出的DNA片段较小，扩增重组质粒时扩增出的DNA片段较大；引物P1、P3只能扩增重组质粒，不能扩增普通质粒，因此若未导入质粒则无扩增DNA片段，若导入普通质粒，则有一种DNA片段，若导入重组质粒，则有两种DNA片段，故菌落3携带正确的重组质粒。
(3)未导入prkA基因、Rubisco基因时，大肠杆菌可正常代谢，若只导入prkA基因，则大肠杆菌产生的核酮糖1,5二磷酸会抑制大肠杆菌的生长，即②区域；若同时导入prkA基因、Rubisco基因，则在Rubisco的作用下，核酮糖1,5二磷酸和CO2结合形成3磷酸甘油酸，参与大肠杆菌正常代谢，可缓解核酮糖1,5二磷酸对大肠杆菌的抑制作用，对应区域④；若只导入Rubisco基因，由于不含核酮糖1,5二磷酸，Rubisco无法起作用，与对照组相同，即③区域。Rubisco可缓解核酮糖1,5二磷酸对大肠杆菌的抑制作用，因此Rubisco越高，大肠杆菌菌落生长状况越好，即携带高活性Rubisco基因的菌落生长状况更好。
(4)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。携带高活性Rubisco编码基因的重组质粒无法转化植物，可将重组质粒导入农杆菌，用农杆菌感染大豆愈伤组织，通过植物组织培养培育出大豆植株，筛选高产量大豆品种。
答案：(1)启动子　RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录　(2)3　(3)prkA基因　prkA基因、Rubisco基因　携带高活性Rubisco基因的菌落生长状况更好　(4)将重组质粒导入农杆菌，用农杆菌感染大豆愈伤组织，通过植物组织培养培育出大豆植株，筛选高产量大豆品种课时跟踪检测(五十九)　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题[对应主题研习(三)(四)]
一、选择题
1.下列关于凝胶电泳实验操作,叙述错误的是 (　　)
A.加样孔应靠近负极端,以便带负电的DNA分子向正极移动
B.接通电源后电泳一段时间,离加样孔越近的DNA分子越小
C.紫外灯照射下,凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关
D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
2.(2025·哈尔滨模拟)PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,下列相关叙述错误的是 (　　)
A.带负电的DNA分子在电泳时由负极向正极移动
B.在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关
C.PCR反应体系中只需添加Mg2+、引物、模板、Taq DNA聚合酶
D.采用PCR技术对一个DNA进行扩增,若每个DNA分子的每条链都做模板,则第n次循环共需要引物2n个
3.为了制定出控制转基因大豆向野生大豆基因漂移的安全管理措施,以下不能作为评估风险程度依据的是 (　　)
A.转基因大豆与野生大豆的地理分布
B.转基因大豆与野生物种间的亲缘关系
C.野生大豆所含主要蛋白质种类及含量
D.传粉昆虫的种类、数量及生活习性
4.(2025·白山模拟)生物技术是以现代生命科学理论为基础,在个体、细胞及分子水平上研究及制造产品或改造动物、植物、微生物等,并使其具有所期望的品质和特性。下列叙述错误的是 (　　)
A.干细胞培养在临床医学等领域前景广泛,但也可能面临安全性问题
B.蛋白质工程是在基因操作水平上改造或创造新的蛋白质
C.治疗性克隆的研究与应用必须受到相应法律法规的规范限制
D.生物武器主要影响人畜健康,对植物的影响不大
5.地球上纤维素含量丰富,其酶解产物利用广泛,但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等,导致生产成本过高以至于影响了其实际应用,采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述错误的是 (　　)
A.通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作
B.与基因工程相比,通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶
C.设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤
D.改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列,实现纤维素酶功能的改变
6.(2025·南昌模拟)萤火虫的荧光素酶能催化ATP激活的荧光素氧化发光,这一现象在生物检测和成像方面有重要的应用价值。为了解决天然荧光素酶不能高效催化人工合成的荧光素DTZ发光的问题,研究人员采用蛋白质工程(又称为第二代基因工程)对它进行了改造。下列关于改造天然荧光素酶的叙述,正确的是 (　　)
A.通过化学诱变剂可定向改造天然荧光素酶的基因序列
B.改造天然荧光素酶所用的基因表达载体不需要启动子和终止子
C.可用PCR方法检测突变的荧光素酶基因是否翻译成蛋白质
D.改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能
7.(2025·哈尔滨模拟)人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟,产生巨大生产力的同时,也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述正确的是 (　　)
A.如果确实有证据表明某种转基因食品有害,就应该禁止转基因技术的应用
B.利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性,其原因之一是人体不会对它们产生免疫反应
C.试管婴儿技术已经成熟,移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造
D.科学家将α 淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中,可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性,从而防止转基因花粉传播造成基因污染
8.(2025·三明模拟)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。下列叙述错误的是 (　　)
A.水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关
B.酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露
C.要获得水蛭素的基因,可以从水蛭细胞中提取mRNA,经逆转录获得目的基因
D.上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构
9.(2025·昆明模拟)每出生5 000名婴儿就约有1人患有线粒体有害突变引起的疾病,可通过如下技术培育“三亲婴儿”,实现线粒体替代疗法阻断线粒体病的遗传,但这是一个充满了争议的技术。据此推测正确的是 (　　)
A.该技术涉及动物细胞核移植、动物细胞培养、体外受精等技术
B.利用该技术培育“三亲婴儿”属于无性生殖
C.卵母细胞捐赠者携带的红绿色盲基因能遗传给“三亲婴儿”
D.此技术之所以存在较大争议仅仅是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲和卵母细胞捐赠者的部分基因的伦理问题
二、非选择题(除特别注明外,每空2分)
10.(11分)(2025·天津一模)人体内的t PA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的基因工程t PA会诱发颅内出血。研究证实,将t PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的t PA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因,可制造出性能优异的t PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点及其上游DNA序列,引物c、d用来扩增突变位点及其下游DNA序列)。请回答下列问题:
(1)科学家将t PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优异的t PA突变蛋白的生物技术手段属于　　　　　(1分)范畴。
(2)获得性能优异的t PA突变蛋白的正确顺序是　　　　　。
①t PA蛋白功能分析和结构设计
②借助定点突变改造t PA基因序列
③检验t PA蛋白的结构和功能
④设计t PA蛋白氨基酸序列和基因序列
⑤利用工程菌发酵合成t PA蛋白
(3)已知t PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中t PA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基,引物b中该突变位点的碱基是　　　　。
(4)据图可知,重叠延伸后,进行PCR需要的引物是　　　　　　,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(5)若获得的t PA突变基因如图所示,那么质粒pCLY11需用限制酶　　　　　　　切开,才能与t PA突变基因高效连接。
课时跟踪检测(五十九)
1．选B　若DNA分子带负电，则靠近加样孔的一端为负极，接通电源，带负电的DNA分子向正极移动而使不同DNA逐渐分离，A正确；相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子迁移越慢，分子量越大，B错误；为了便于对分离后的DNA片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA分子结合发荧光，DNA含量越多，荧光强度越强，即凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关，C正确；点样时应在样品中加入指示剂，根据指示剂泳动的位置判断是否停止电泳，D正确。
2. 选C　在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，故带负电的DNA分子在电泳时由负极向正极移动，A正确；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，B正确；PCR反应的缓冲液中需添加Mg2＋、引物、Taq DNA聚合酶、模板、4种脱氧核苷酸、缓冲液、无菌水等，C错误；一个DNA分子有两条链，第n次复制形成2n个DNA，相当于新合成2n－1个DNA分子，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n－1×2＝2n(个)，D正确。
3．选C　转基因大豆与野生大豆的地理分布的远近与转基因大豆和野生大豆的基因交流有关，A不符合题意；转基因作物与近缘野生种间发生基因交流，进而发生基因漂移，使一些近缘物种表现出转基因的性状，B不符合题意；野生大豆的蛋白质含量只与野生大豆的营养物质有关，C符合题意；传粉昆虫的种类、数量及生活习性与野生大豆和转基因大豆之间的传粉和基因交流有关，D不符合题意。
4．选D　干细胞培养在临床医学等领域前景广泛，但也可能存在安全性问题，A正确；蛋白质工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质或创造新的蛋白质，B正确；治疗性克隆的研究与应用必须受到相应法律法规的规范限制，C正确；生物武器对人畜、植物等均可能造成重大伤害，D错误。
5．选A　蛋白质工程就是通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行改造或合成新蛋白，需要对基因进行操作，A错误。
6．选D　通过化学诱变剂可以让天然荧光素酶的基因发生突变，基因突变是不定向的，A错误；改造天然荧光素酶所用的基因表达载体必须包含启动子和终止子，启动子启动基因转录，而终止子使转录终止，B错误；检测目的基因是否翻译为蛋白质的方法为抗原—抗体杂交法，C错误；改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能，D正确。
7．选D　转基因技术本身是中性的，如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止产品的使用，不应该禁止转基因技术的应用，A错误；转基因技术制造的新型致病菌，致病能力和传染能力以及抗药能力等大幅度增加，因而导致具有极大的危害性，B错误；试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断，不涉及基因改造，C错误；科学家将α 淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，不参与受精作用，从而防止转基因花粉传播造成基因污染，D正确。
8．选A　两种酶水解水蛭蛋白后，肽含量比较接近，而抗凝血活性差距较大，说明抗凝血活性与肽含量关联不大，A错误；酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性先上升后相对稳定，由此推测酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露，B正确；为了获得水蛭素基因，可以从细胞中提取水蛭素基因转录的mRNA，经逆转录获取目的基因，C正确；题述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构，D正确。
9．选A　据图可知，该技术涉及动物细胞核移植、动物细胞培养、体外受精、胚胎移植等技术，A正确；该技术存在精子和换核后的卵细胞的融合过程，属于有性生殖，B错误；卵母细胞捐献者提供的是细胞质，而红绿色盲基因位于细胞核内的染色体上，因此卵母细胞捐赠者携带的红绿色盲基因不能遗传给“三亲婴儿”，C错误；此技术之所以存在较大争议不仅是因为孩子同时拥有自己父亲、母亲和卵母细胞捐赠者的部分基因的伦理问题，还存在技术尚不完备、仍需要更充足的检验等原因，D错误。
10．解析：(1)由题干信息可知，题述生产改良t PA蛋白的技术是先对天然的t PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的t PA蛋白，因此属于蛋白质工程。
(2)蛋白质工程的一般过程是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，故获得性能优异的t PA突变蛋白的正确顺序是①t PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t PA蛋白→③检验t PA蛋白的结构和功能。
(3)已知t PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中t PA基因的上链)上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G。
(4)由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3′端结合，故据图可知，重叠延伸后，为扩增完整的序列，需要引物a和d；DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(5)如图所示，目的基因的两端的黏性末端碱基序列分别是CCGG、CTAG，所以应用XmaⅠ和BglⅡ两种限制酶切割，以便于把目的基因连接到质粒pCLY11上。
答案：(1)蛋白质工程　(2)①④②⑤③　(3)G　(4)引物a和引物d
使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　(5)XmaⅠ、BglⅡ

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