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(共30张PPT)
第1节 重组DNA技术的基本工具
（第2课时）
三 DNA连接酶---分子缝合针
如何将目的外源基因和载体连接形成重组DNA？
DNA连接酶的作用展示1
两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能连接起来。
DNA连接酶→磷酸二酯键
DNA连接酶→磷酸二酯键
DNA连接酶可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来
DNA连接酶的作用展示2
DNA连接酶→磷酸二酯键
DNA连接酶→磷酸二酯键
DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接两条”游离“单链DNA片段!
DNA连接酶对碱基的排列顺序没有要求，只要粘性末端相同都可以连接
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
1 作用：
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
2 种类：
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 缝合 和 ； 缝合__________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
磷酸二酯键
平末端
（连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶）
平末端
DNA连接酶没有对碱基序列识别特异性
旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
▲ DNA复制中DNA聚合酶发挥作用
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶作用示意图：
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
DNA复制、基因工程
DNA复制、基因工程
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
DNA连接酶 vs DNA聚合酶
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶
作用部位
作用对象
作用结果
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割双链DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
E.coli DNA连接酶
③ 有一个至多个限制酶切割位点
质粒、噬菌体、动植物病毒
作用部位：
种类
DNA连
接酶
切开DNA分子的磷酸二酯键
主要存在于原核生物中
具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）
T4 DNA连接酶
① 对受体细胞无害
② 能自我复制或整合到宿主DNA上。
④ 常有特殊的标记基因
运载
工具
条件
种类：
磷酸二酯键
限制酶
作用部位：
来源：
特点：
作用结果：
产生黏性末端或平末端
重组DNA技术的基本工具
1.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
④
图甲
限制酶的选择技巧
①不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；
②应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择EcoRⅠ或PstⅠ
1、根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
2、根据质粒的特点确定限制酶的种类
图乙
①质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙不能选择SmaⅠ
②所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端
方案一：
只用PstⅠ切割目的基因和质粒
方案二：
同时用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒
哪种方案更好？
用DNA连接酶处理后会出现哪些产物？(只考虑两两结合)
目的基因自身环化、
质粒的自身环化、
目的基因与质粒反向连接
使用同种限制酶效果一定好吗？
小结
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了：
。但是使用该法缺点是容易发生
以及 ，
为了避免上述情况发生，可采取的措施是
。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶（双酶切法）去切割目的基因和运载体
1.选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌
筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中
添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
①或②
①
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（一)实验原理
1 粗提取DNA的原理
2 鉴定DNA的原理
某种蛋白质的溶解度
(2)在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
四 DNA的粗提取与鉴定
(1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
(二)材料用具
1 选材
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合；鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
（1）选什么样的材料实验更易成功？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
2 试剂
研磨液
体积分数为95%的酒精
2mol/L 的NaCl溶液
二苯胺试剂
试剂
蒸馏水
溶解并提取DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用，棕色试剂瓶存放(P117)
研磨液成分 作用
SDS
EDTA
Tris-HCl缓冲液
使蛋白质变性与DNA分离
抑制DNA酶的作用
稳定DNA
(三)方法步骤
取材研磨
过 滤
DNA析出
DNA鉴定
(2)研磨不充分对实验结果的影响？
会使DNA分子从细胞核中释放出来的少，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
(1)目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(3)研磨时间不宜太长,不宜太用力
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(4)在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
取材研磨
过 滤
DNA析出
DNA鉴定
方法1：在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；
方法2：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
纱布
上清液
上清液
(1)过滤的纱布不能用滤纸代替
因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
(2)上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
DNA析出
DNA鉴定
取材研磨
过 滤
(1)此步骤的目的
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
(2)酒精预冷的作用（4℃冰箱）
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
（3)搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
在上清液中加入体积相等的 溶液,静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
预冷的酒精
白色丝状物
实验组
对照组
沸水浴加热
DNA析出
DNA鉴定
取材研磨
过 滤
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加
入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
二苯胺
2mol/L的NaCl
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
1.提取出丝状物或沉淀物一定是白色的吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.本实验的检测结果蓝色较浅的原因可能是什么？
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现用现配，二苯胺易被空气氧化，影响鉴定效果。
（四)结果分析与评价
为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
加2mol/L的NaCl溶液的目的：
加蒸馏水的目的：
溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。
降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。
（五)进一步探究
通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。
与DNA溶解度不同
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
拓展探究：
DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分
预冷后才能使用。
(3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并
沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量
不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
1.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序是__________________________
(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目的是 。
③→②→①→④→⑤
溶解DNA
巩固练习
(3)步骤①的目的是 ，
其依据的原理是 。
析出并获得DNA
DNA不溶于酒精
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加 ________试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。
白
二苯胺
沸水浴加热
蓝色
(5)由于鸡血较难找到，某学生试图用猪血代替，结果没有成功，其原因最可能是_______________________________________________________。
猪是哺乳动物，哺乳动物血液中成熟的红细胞没有细胞核
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
磷酸二酯键
DNA聚合酶的作用
T4 DNA连接酶可以连接互补的黏性末端，又可连接平末端
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
二、扩展应用
XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，扩大了切割位点的选择范围。

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