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第2节 基因工程的基本操作程序
（第1课时）
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
普通棉花
转基因抗虫棉
从社会中来
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
苏云金杆菌
Bt蛋白基因
棉花细胞
（核心）
抗虫棉
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？
培育转基因抗虫棉的简要过程
（一)目的基因
1概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因(也可以是一些具有调控作用的因子)
2实例：
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
抗虫棉
产生胰岛素的基因
编码蛋白质的基因
产生果胶酶的基因
一 第一步：目的基因的筛选与获取
基因1 基因2 基因3
DNA片段
放大
基因通常是 。
非编码区
非编码区
编码区
能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段
不直接编码蛋白质，能调控基因表达
不直接编码蛋白质，能调控基因表达
知识拓展 ：基因的结构
有遗传效应的DNA片段
——通常能编码特定的蛋白质
在人类基因组中，非编码区占比超过98%，远超编码区（约2%）
1、原核细胞的基因结构
编码区（基因）
非编码区
非编码区
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
2、真核细胞的基因结构
启动子
前体mRNA
转录
成熟mRNA
汉水丑生侯伟作品
终止子
编码区上游
编码区下游
剪切、拼接
外显子
内含子
编码区（基因）
非编码区
非编码区
1 较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
苏云金杆菌
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
(二)目的基因的筛选
【资料1】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
序列比对工具
利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
测序技术
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
序列数据库
美国国家生物信息中心
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
2 认识基因结构和功能的技术方法：
苏云金杆菌
Bt基因
？
大量Bt基因
提取
(三)利用PCR获取和扩增目的基因
全称：
原理：
操作环境：
目的：
优点：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖
PCR扩增仪
1 PCR的概念：
模拟细胞内DNA的复制过程，在体外快速扩增特定的DNA片段。
模板：
原料：
能量：
酶：
DNA的两条母链
4种游离的脱氧核苷酸
③复制特点:
①边解旋边复制
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
①条件
②复制原则:
要点回顾 ：体内DNA复制
ATP
②半保留复制
DNA聚合酶（形成磷酸二酯键）
解旋酶（解螺旋，打开氢键）
④子链的延伸方向：
5'端→3'端
DNA聚合酶的特点1：只能从5'端向3'端延伸子链。
是一小段能与DNA母链的一段碱基序列 的短单链核酸。
DNA聚合酶的特点2：无法从头合成DNA链
拓展 ：引物
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
解旋酶
引物结合在模板链的____端。
3’
引物的概念：
细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物（不切除）
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除）
引物的本质：
互补配对
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
反应还需要其它条件： 解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA（目的基因）模板
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA）
如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备
2PCR进行需要的条件：
打开DNA双链，破坏氢键
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
条件：温度超过______以上时，
(1)变性：
变性
90℃
待扩增的DNA片段
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
不需要解旋酶
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是一个固定的温度？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
3 PCR的过程：
变性
复性
延伸
双链DNA解聚为单链
3’
5’
3’
5’
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
思考：为什么需要引物？
引物结合在模板链的什么位置？
①因为DNA聚合酶不能从头开始添加核苷酸合成DNA，只能从一个已有的核苷酸链的3'端延伸DNA链
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(2)复性：
50℃
便于引物与互补DNA链结合
条件：当温度下降 到左右时，
当温度上升到______左右时，溶液中的4种_____________在耐高温的______________
__________的作用下，根据_____________原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
(3)延伸：
(Taq酶)
3’
5’
3’
5’
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
Taq酶
3’
Taq酶
3’
思考2：为什么温度要上升至72℃？
72℃是Taq酶的最适温度
碱基互补配对
思考1：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
Taq酶结合在引物的3’端
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
PCR的过程小结：
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
2、PCR扩增过程中 需要源源不断的加入。
1、一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的 。
模板
引物、原料
第二轮循环的产物
第三轮的产物
第一轮循环的产物
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数
含引物的DNA分子数
含引物1的DNA分子数
同时含引物1和2的DNA分子数
消耗引物数量
2n
2n
2n-1
2n-2
2n+1-2
2 4 8
2 4 8
1 3 7
0 2 6
2 6 14
问题1：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
①引物与DNA模板结合
②解开的两条模板链重新结合
③引物与引物结合
思考 · 讨论
加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
在设计引物时，避免引物之间的碱基序列互补
问题2：怎样提高复性时引物与模板配对结合率，
而不是模板链之间配对结合呢？
问题3：如何避免引物与引物结合？
①DNA聚合酶无法识别RNA；
②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。
问题4：用PCR可以扩增mRNA吗？（p79）
不能！
单链RNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
引物、DNA聚合酶
双链DNA
PCR扩增
需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
问题5：如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？
要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。
2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。
5’-ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA-3’
3’-TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT-5’
①
②
③
④
3’… ATT-5’
5’-ATG… 3’
问题6：根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。
1、PCR扩增时至少需要____种引物，原因是________________________________________
2
2、设计引物的要求：
①2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_______________________________。
②同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_________________________
防止引物自身配对折叠
防止引物之间配对，
导致引物不能与模板链结合
DNA的两条链是反向平行的（序列不同）
一般不是；
扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段；
问题7：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？
思考 · 讨论
设计引物时必须依据：
目的基因的核苷酸序列
问题8：由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？
PCR进行的前提条件是：
已知目的基因的DNA序列
问题9：利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考 · 讨论
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
第一次扩增
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
第二次扩增
第三次扩增
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
第四次扩增
中长链-短链DNA____个
6
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
15
15
短链-短链DNA______个
8
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n

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