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第54课时　基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)
课标要求 1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.DNA的粗提取与鉴定。4.阐明基因工程的基本操作程序。
考情 分析 1.基因工程的基本工具 2024·湖南·T5
2.基因工程的基本操作程序 2024·贵州·T21　2024·湖南·T21　2024·甘肃·T21　2024·全国甲·T38 2023·湖北·T4　2023·新课标·T6　2023·广东·T20　2023·海南·T20 2023·山东·T25　2023·天津·T17　2022·广东·T22　2022·北京·T21 2022·山东·T25
3.DNA的粗提取与鉴定 2024·安徽·T14　2024·山东·T13　2022·山东·T13
考点一　基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
[提醒]　基因工程的理论基础
[教材隐性知识]　源自选择性必修3 P68“科技探索之路”肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了____________________________________；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的________有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种______________、__________________和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；__________________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
[提醒]　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
(3)载体
3．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
(2)操作流程
[提醒]　①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
(1)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(2024·贵州，13D)(　　)
(2)羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料(2020·海南，10A)(　　)
(3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物(　　)
(4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行(2022·湖北，4A)(　　)
分析限制酶的作用和选择
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割产生的黏性末端分别是_______________和______________。
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
　限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具
1．(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
2．(2024·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　)
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个
D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
　与DNA有关的几种酶的比较
考向二　DNA的粗提取与鉴定
3．(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
4．(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞________或获得预期______________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知__________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用________________和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR________和扩增目的基因
a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据______________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种________与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行______________的技术。
b．PCR反应的条件：一定的______________、DNA模板、2种________、4种____________、________________DNA聚合酶，以及能自动调控________的仪器。
c．PCR扩增的过程
d．PCR产物的鉴定：常采用________________________________________________来鉴定。
[归纳提升]　(1)耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。
(2)引物(2种)的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)缓冲液的作用：维持反应体系pH稳定。
(4)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
③通过构建________________来获取目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因________________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
[提醒]　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、__________ 显微注射法 _______处理法
受体细胞 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
[辨析]　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
4．目的基因的检测与鉴定
分析基因工程的基本操作程序
接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：
(1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有______________________________。
(2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取________________________并用__________扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。
(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
考向三　辨析基因工程的基本操作程序
5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
6．(2024·河池模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是(　　)
A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶
B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态
C．按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因
D．在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落
1．下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料
B．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
C．因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质
D．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验
E．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
F．加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌
G．两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中
H．将提取的丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色
2．下列关于基因工程中工具酶的叙述，正确的是(　　)
A．限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取
B．限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA
C．不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端
D．DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
E．E.coli DNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来
3．下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是(　　)
A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等
B．基因工程中用的载体大多数为天然质粒
C．质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团
D．必须具有自我复制能力
E．具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入
F．载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选
4．下列关于基因表达载体及其构建过程的说法，正确的是(　　)
A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B．构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代
C．一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构
D．基因表达载体的构建至少需要两种工具酶
E．基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对
F．诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达
G．基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程
5．下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的(　　)
A．农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上
B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌
C．应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内
D．将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作
E．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
F．某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
答案精析
考点一　整合
1．DNA分子　转基因　遗传特性　生物类型　基因重组
教材隐性知识　DNA 可以在同种生物的不同个体之间转移　质粒　限制酶　DNA 连接酶　基因组编辑
2．(1)原核生物　数千　特定核苷酸序列　磷酸二酯键　(2)磷酸二酯键　大肠杆菌　黏性末端　黏性末端
(3)环状双链DNA分子　噬菌体　有一个至多个　自我复制　受体DNA　标记
3．(1)不溶于　2 mol/L　二苯胺　(2)95%　沸水
判断正误
(1)√
(2)×　[羊属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核，不可作为提取DNA的材料。]
(3)×　[向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞吸水涨破，DNA溶于蒸馏水，观察不到白色丝状物。]
(4)×　[动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行。]
提升
(1)　
(2)用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒，应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。
评价
1．C　[酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]
2．C　[质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。]
3．D　[研磨液中含有NaCl，有利于DNA的溶解，若换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺试剂可用于鉴定DNA，不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。]
4．A　[研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。]
考点二　整合
1．(1)性状　表达产物　(2)①结构和功能清晰　②序列数据库　(3)②获取　a．DNA半保留复制　组分　大量复制　b．缓冲溶液　引物　脱氧核苷酸　耐高温的　温度
c．90　单链　50　引物　72　耐高温的DNA聚合酶　d．琼脂糖凝胶电泳　③基因文库
2．(1)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代　(2)启动子　标记基因
3．花粉管通道法　Ca2＋　体细胞或受精卵　受精卵
提升
(1)用于筛选含有重组表达载体的细胞　启动子和终止子
(2)染色体DNA(基因组DNA)　PCR　(3)从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带
评价
5．D　[若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]
6．C　[按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；重组质粒含有LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，故在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可使菌落呈蓝色，D正确。]
查落实固基础
1．ACDH　[猪血细胞无细胞核，不适合用于提取DNA，A错误；因DNA不溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精，因而可分离DNA与蛋白质，C错误；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，故取上清液进一步实验，D错误；将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，经过沸水浴加热5 min才会出现蓝色，H错误。]
2．AC　[限制酶能够识别双链 DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别剪切RNA，B错误；DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，D错误；E.coli DNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段，也能连接具有平末端的DNA片段，只是连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶，E错误。]
3．BCF　[在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，B错误；质粒是一种双链环状DNA分子，无游离的磷酸基团，C错误；载体质粒中必须有标记基因，但不一定是抗生素抗性基因，F错误。]
4．ABDEF　[基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分，C错误；基因表达载体中启动子具有RNA聚合酶的结合部位，启动转录过程，G错误。]
5．BCF　[农杆菌转化法是将目的基因插入农杆菌的Ti质粒中的T－DNA上，让携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上，A错误；动物受精卵全能性最高，应用显微注射技术将表达载体导入受精卵来获得转基因动物，D错误；可采用PCR检测目的基因是否转录，采用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译，E错误。](共113张PPT)
基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)
生物
大
一
轮
复
习
第54课时
课标要求
1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。
2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。
3.DNA的粗提取与鉴定。
4.阐明基因工程的基本操作程序。
考情分析
1.基因工程的基本工具 2024·湖南·T5
2.基因工程的基本操作程序 2024·贵州·T21　2024·湖南·T21　2024·甘肃·T21　2024·全国甲·T38
2023·湖北·T4　2023·新课标·T6　2023·广东·T20　2023·海南·T20
2023·山东·T25　2023·天津·T17　2022·广东·T22　2022·北京·T21
2022·山东·T25
3.DNA的粗提取与鉴定 2024·安徽·T14　2024·山东·T13　2022·山东·T13
内容索引
课时精练
考点一　基因工程的基本工具
考点二　基因工程的基本操作程序
基因工程的基本工具
< 考点一 >
1.基因工程的概念
必备知识
整合
DNA分子
转基因
遗传特性
生物类型
基因重组
基因工程的理论基础
源自选择性必修3 P68“科技探索之路”肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了____________________________
；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的 有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种 、 和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件； 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
教材隐性知识
DNA 可以在同种生物的不同个
体之间转移
质粒
限制酶
DNA连接酶
基因组编辑
2.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
(3)载体
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
3.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
不溶于
2 mol/L
二苯
胺
(2)操作流程
95%
沸水
①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
(1)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(2024·贵州，13D)(　　)
(2)羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料(2020·海南，10A)(　　)
提示　羊属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核，不可作为提取DNA的材料。
√
×
判断正误
(3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物(　　)
提示　向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞吸水涨破，DNA溶于蒸馏水，观察不到白色丝状物。
×
(4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
(2022·湖北，4A)(　　)
提示　动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行。
×
判断正误
分析限制酶的作用和选择
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶
关键能力
提升
EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是________________
__________和_____________________。
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，
实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
归纳总结
限制酶的选择

(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
归纳总结
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
归纳总结
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
归纳总结
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具
1.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
迁移应用
评价
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
√
酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；
质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；
质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；
若用酶2和酶4切割质粒和目的
基因，会破坏质
粒上的抗生素抗
性基因，连接形
成的基因表达载
体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。
2.(2024·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是
项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
√
质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；
①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；
将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。
归纳提升
与DNA有关的几种酶的比较
考向二　DNA的粗提取与鉴定
3.(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白
质杂质
√
研磨液中含有NaCl，有利于DNA的溶解，若换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；
DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；
在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺试剂可用于鉴定DNA，不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。
4.(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
√
返回
研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；
鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；
加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
基因工程的基本操作程序
< 考点二 >
必备知识
整合
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用 和序列比对工具进行筛选。
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR 和扩增目的基因
a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。
b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种_____
、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。
获取
DNA半保留复制
组分
大量复制
缓冲溶液
引物
脱氧
核苷酸
耐高温的
温度
c.PCR扩增的过程
90
单链
50
引物
72
耐高温的DNA聚合酶
d.PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
琼脂糖凝胶电泳
归纳提升
(1)耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。
(2)引物(2种)的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)缓冲液的作用：维持反应体系pH稳定。
(4)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
③通过构建 来获取目的基因。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
基因文库
在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代
(2)基因表达载体的组成及作用
启动子
标记基因
(3)构建过程
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所 需要的地方 停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、_____ ________ 显微注射法 处理法
受体细胞 ______________ _______ 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
3.将目的基因导入受体细胞
花粉
管通道法
Ca2＋
体细胞或受精卵
受精卵
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳
定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
4.目的基因的检测与鉴定
分析基因工程的基本操作程序
接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：
(1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有 。
关键能力
提升
用于筛选含有重组表达载体的细胞
启动子和终止子
(2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 并用 扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。
(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_______________________________________________
_________________________________。
染色体DNA(基因组DNA)
PCR
从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带
考向三　辨析基因工程的基本操作程序
5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
迁移应用
评价
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的
培养基中能形成菌落
√
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；
DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的
DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，
能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
归纳提升
双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
归纳提升
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
6.(2024·河池模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是
A.将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶
B.需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处
于一种易于吸收周围环境中DNA分
子的状态
C.按图示构建的重组质粒导入大肠杆
菌后，大肠杆菌可正常表达该目的
基因
D.在含X－gal的培养基上培养导入了
重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落
√
重组质粒含有LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，故在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可使菌落呈蓝色，D正确。
按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；
1.下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是
A.与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料
B.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
C.因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质
D.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验
E.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
F.加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌
G.两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中
H.将提取的丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色
√
√
√
√
猪血细胞无细胞核，不适合用于提取DNA，A错误；
因DNA不溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精，因而可分离DNA与蛋白质，C错误；
研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，故取上清液进一步实验，D错误；
将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，经过沸水浴加热5 min才会出现蓝色，H错误。
2.下列关于基因工程中工具酶的叙述，正确的是
A.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取
B.限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA
C.不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端
D.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
E.E.coli DNA 连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来
√
√
限制酶能够识别双链 DNA分子的特定核苷酸序列，不能识别剪切RNA，B错误；
DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，D错误；
E.coli DNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段，也能连接具有平末端的DNA片段，只是连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶，E错误。
3.下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是
A.基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等
B.基因工程中用的载体大多数为天然质粒
C.质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团
D.必须具有自我复制能力
E.具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入
F.载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选
√
√
√
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，B错误；
质粒是一种双链环状DNA分子，无游离的磷酸基团，C错误；
载体质粒中必须有标记基因，但不一定是抗生素抗性基因，F错误。
4.下列关于基因表达载体及其构建过程的说法，正确的是
A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B.构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗
传给下一代
C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止
密码子等结构
D.基因表达载体的构建至少需要两种工具酶
E.基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对
F.诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达
G.基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程
√
√
√
√
√
基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分，C错误；
基因表达载体中启动子具有RNA聚合酶的结合部位，启动转录过程，G错误。
5.下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的
A.农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受
体植物细胞的染色体DNA上
B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌
C.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内
D.将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作
E.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
F.某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
√
√
√
农杆菌转化法是将目的基因插入农杆菌的Ti质粒中的T－DNA上，让携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上，A错误；
动物受精卵全能性最高，应用显微注射技术将表达载体导入受精卵来获得转基因动物，D错误；
可采用PCR检测目的基因是否转录，采用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译，E错误。
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课时精练
对一对
1
2
3
4
5
6
7
8
9
答案
题号 1 2 3 4 5 6
答案 B B B D B B
(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)　
(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR
(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
7.
2
3
4
5
6
7
8
9
答案
1
(1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解成葡萄糖　单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)　
(2)NV基因　＞　突变体NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中碱基对增加而发生突变　
(3)突变体　便于筛选出成功导入NV基因的细胞
8.
2
3
4
5
6
7
8
9
答案
1
(1)BglⅡ、BstE Ⅱ　—CATTG　
(2)3　核酸染料
(3)N　2、3　
(4)A菌　B菌分解纤维素能力比A菌更强
9.
2
3
4
5
6
7
8
9
答案
1
一、选择题
1.(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是
A.限制酶失活，更换新的限制酶
B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
1
2
3
4
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6
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8
9
答案
√
限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；
在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B错误；
质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确；
质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
1
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6
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9
答案
2.(2024·石家庄调研)图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是
A.在基因工程中若只用一种限制
酶完成对质粒和外源DNA的切
割，则可选EcoR Ⅰ
B.如果将一个外源DNA分子和一
个质粒分别用EcoR Ⅰ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重
组DNA，此重组DNA中EcoR Ⅰ切割位点有1个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH Ⅰ和
HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因
D.一个如图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
√
1
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9
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
答案
图中目的基因两侧都有EcoR Ⅰ酶切位点，质粒上也存在EcoR Ⅰ酶切位点，若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoR Ⅰ，A正确；
EcoR Ⅰ切割外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶连接，形成的含目的基因的重组DNA分子中，EcoRⅠ酶切割位点有2个，B错误；
为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用
BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒和目的基因，C正确；
该质粒分子经EcoR Ⅰ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D正确。
1
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8
9
答案
离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确。
3.(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
√
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9
答案
4.(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是
A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
1
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√
答案
1
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3
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9
裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A正确；
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
答案
1
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9
DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的纯度，C正确；
将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。
答案
5.(2025·黄石模拟)如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的是
A.用PCR技术可检测GNA和
ACA基因是否导入棉花细
胞中
B.将棉花细胞接种在含氨苄
青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
C.用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因
D.与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向
正确
√
1
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9
答案
根据GNA－ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞的染色体DNA上，A正确；
由于重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B错误；
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答案
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9
答案
GNA和ACA基因均有BsaBⅠ酶切位点，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，C正确；
图中质粒与GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D正确。
6.(2025·十堰调研)当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。
氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。如图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是
1
2
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5
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7
8
9
答案
A.要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的
基因
B.实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C.步骤④阶段使用的MS培养
基中要加入植物激素和卡那
霉素等物质
D.为了评估目的基因抑制苹果
褐变的效果，可与导入含
pBI 121质粒的植株作对照
√
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答案
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9
答案
褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物变成黄色所致，故要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确；
步骤①是目的基因表达载体的
构建，该过程中需要限制性内
切核酸酶和DNA连接酶的参与，
B错误；
同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。
步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确；
为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含 目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒本身对实验结果的影响，
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答案
二、非选择题
7.(2024·重庆，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
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答案
启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因转录，是一段有特殊序列结构的DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
(1)基因S启动子的基本组成单位是___________________________。
脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
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答案
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是_________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是_____________________________________________________
______________________________。
EcoR Ⅰ
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答案
酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)
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答案
根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是_____。
酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段
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答案
PCR
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答案
DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段；在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________________________________________________
_____________。
品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更
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答案
高，种子更大
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根据(4)题目信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
8.(2024·贵州，21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示无)。
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答案
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
回答下列问题：
(1)据表可推测______诱导了NV基因表达。NV酶的作用是_____________
_________________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是_____
______________________________________(答出1点即可)。
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答案
蔗糖
代谢，将蔗糖分解成葡萄糖
参与蔗糖分解
时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)
单位
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答案
根据表格可知，野生型菌株在加入蔗糖的培养基中会合成NV酶，不加蔗糖不会合成NV酶，推测蔗糖诱导了NV基因表达。分析表格可知，有NV酶时，菌株就能将蔗糖分解成葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程。检测NV酶活性时，需测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
(2)表中突变体由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与________(填“T－DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度_____(填“>”“＝”或“<”)野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是_______________________________
_________________________________。
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答案
NV基因
突变体NV基因中插入了T－DNA序
＞
列，使基因中碱基对增加而发生突变
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
从题目中可知，突变体是由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时，使用的引物需要与特定的DNA序列互补配对，才能启动DNA的扩增。野生型菌株的基因组DNA中没有T－DNA的插入，所以只有用与NV基因配对的引物进行扩增时，才可以扩增出两种菌株的基因片段。突变体中的NV基因中插入了T－DNA序列，导致其碱基对增加，因此若突变体扩增片段长度＞野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。
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答案
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是________________________________。
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答案
突变体
便于筛选出成功导入NV基因的细胞
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变，无法正常表达NV酶，导致相关生理功能缺失或异常。将正常的NV基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明NV基因确实具有特定的功能。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，便于筛选出成功导入NV基因的细胞。
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答案
9.(2024·衡水模拟)研究人员从分解纤维素的细菌(A菌)中提取出一种纤维素酶基因(CBHⅡ)并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒(图1)连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌(B菌)。请回答下列问题：
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答案
几种限制酶识别序列及酶切位点
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答案
限制酶 识别序列及酶切位点
BglⅡ 5′－A↓GATCT－3′
BstE Ⅱ 5′－G↓GTNACC－3′(N为任意碱基)
Sac Ⅰ 5′－GAGCT↓C－3′
Msp Ⅰ 5′－C↓CGG－3′
BamH Ⅰ 5′－G↓GATCC－3′
(1)构建成重组质粒时，应选择限制酶_______________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段(X和Y)，X两端的黏性末端分别为
－CTAG和－CAATG，则Y两端的黏性末端分别为－CTAG和__________。
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答案
BglⅡ、BstE Ⅱ
—CATTG
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答案
需要将目的基因插入高效启动子之后，至少保留一个标记基因M或N，故选择BglⅡ、BstE Ⅱ对质粒进行酶切。根据表格中BstE Ⅱ识别序列和切割位点，X端的黏性末端有—CAATG，则Y端与之互补为—CATTG。
(2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，PCR扩增过程中，最早经过_____轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。为了能在波长为300 nm紫外灯下检测出DNA分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的__________。
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答案
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核酸染料
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答案
PCR扩增过程中，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。因此PCR扩增过程中，最早经过3轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。为了便于对分离后的DNA片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素_____(填“M”或“N”)的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示(片段过小时检测不到条带)。据图分析，菌落______中成功导入了重组质粒。
N
2、3
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答案
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答案
所选限制酶破坏了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒导入A菌，并将其接种在含抗生素N的培养基上培养。图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。
(4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基均分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种_____，说明__________
___________________。
A菌
维素能力比A菌更强
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答案
B菌分解纤
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答案
对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由图4可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强。
返回第十单元　课时练54　基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)
选择题1～2题，每小题7分，3～6题，每小题8分，共46分。
一、选择题
1．(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2．(2024·石家庄调研)图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(　　)
A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoR Ⅰ
B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoR Ⅰ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoR Ⅰ切割位点有1个
C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH Ⅰ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因
D．一个如图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
3．(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
4．(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
5．(2025·黄石模拟)如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的是(　　)
A．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
B．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
C．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因
D．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
6．(2025·十堰调研)当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。如图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是(　　)
A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI 121质粒的植株作对照
二、非选择题
7．(16分)(2024·重庆，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是____________。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________________________________________。
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有________________________________________________________________________。
经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______________。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是___________________________________
________________________________________________________________________。
8．(20分)(2024·贵州，21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示无)。
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 ＋ ＋ ＋
野生型 － － －
突变体 ＋ － －
转基因菌株 ＋ ＋ ＋
回答下列问题：
(1)据表可推测__________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是____________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是________________________________________________
_______________________________________________________________(答出1点即可)。
(2)表中突变体由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与__________(填“T－DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度__________(填“>”“＝”或“<”)野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是______________________________
________________________________________________________________________。
(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入__________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是_______________________
________________________________________________________________________。
9．(18分)(2024·衡水模拟)研究人员从分解纤维素的细菌(A菌)中提取出一种纤维素酶基因(CBHⅡ)并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒(图1)连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌(B菌)。请回答下列问题：
几种限制酶识别序列及酶切位点
限制酶 识别序列及酶切位点
BglⅡ 5′－A↓GATCT－3′
BstE Ⅱ 5′－G↓GTNACC－3′(N为任意碱基)
Sac Ⅰ 5′－GAGCT↓C－3′
Msp Ⅰ 5′－C↓CGG－3′
BamH Ⅰ 5′－G↓GATCC－3′
(1)构建成重组质粒时，应选择限制酶__________________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段(X和Y)，X两端的黏性末端分别为－CTAG和－CAATG，则Y两端的黏性末端分别为－CTAG和______________。
(2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，PCR扩增过程中，最早经过________轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。为了能在波长为300 nm紫外灯下检测出DNA分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的____________。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素________(填“M”或“N”)的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示(片段过小时检测不到条带)。据图分析，菌落________中成功导入了重组质粒。
(4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基均分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种________，说明_____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
1．B　[限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
2．B　[图中目的基因两侧都有EcoR Ⅰ酶切位点，质粒上也存在EcoR Ⅰ酶切位点，若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoR Ⅰ，A正确；EcoR Ⅰ切割外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶连接，形成的含目的基因的重组DNA分子中，EcoRⅠ酶切割位点有2个，B错误；为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒和目的基因，C正确；该质粒分子经EcoR Ⅰ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D正确。]
3．B　[离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确。]
4．D　[裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。]
5．B　[根据GNA－ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞的染色体DNA上，A正确；由于重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B错误；GNA和ACA基因均有BsaB Ⅰ酶切位点，所以用限制酶BsaB Ⅰ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，C正确；图中质粒与GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D正确。]
6．B　[褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物变成黄色所致，故要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确；步骤①是目的基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确；为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含 目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。]
7．(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)　(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR
(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
解析　(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因转录，是一段有特殊序列结构的DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段；在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据(4)题目信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
8．(1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解成葡萄糖　单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)　(2)NV基因　＞　突变体NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中碱基对增加而发生突变　(3)突变体　便于筛选出成功导入NV基因的细胞
解析　(1)根据表格可知，野生型菌株在加入蔗糖的培养基中会合成NV酶，不加蔗糖不会合成NV酶，推测蔗糖诱导了NV基因表达。分析表格可知，有NV酶时，菌株就能将蔗糖分解成葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程。检测NV酶活性时，需测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。(2)从题目中可知，突变体是由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时，使用的引物需要与特定的DNA序列互补配对，才能启动DNA的扩增。野生型菌株的基因组DNA中没有T－DNA的插入，所以只有用与NV基因配对的引物进行扩增时，才可以扩增出两种菌株的基因片段。突变体中的NV基因中插入了T－DNA序列，导致其碱基对增加，因此若突变体扩增片段长度＞野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变，无法正常表达NV酶，导致相关生理功能缺失或异常。将正常的NV基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明NV基因确实具有特定的功能。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，便于筛选出成功导入NV基因的细胞。
9．(1)BglⅡ、BstE Ⅱ　—CATTG　(2)3　核酸染料
(3)N　2、3　(4)A菌　B菌分解纤维素能力比A菌更强
解析　(1)需要将目的基因插入高效启动子之后，至少保留一个标记基因M或N，故选择BglⅡ、BstE Ⅱ对质粒进行酶切。根据表格中BstE Ⅱ识别序列和切割位点，X端的黏性末端有—CAATG，则Y端与之互补为—CATTG。(2)PCR扩增过程中，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。因此PCR扩增过程中，最早经过3轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。为了便于对分离后的DNA片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。(3)所选限制酶破坏了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒导入A菌，并将其接种在含抗生素N的培养基上培养。图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。(4)对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由图4可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强。

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