资源简介

第十单元　专题突破10　综合PCR的基因工程问题
选择题1～2题，每小题7分，3～8题，每小题8分，共62分。
一、选择题
1．(2024·武汉期末)基因工程中，通过PCR可以特异性地快速扩增目的基因，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳实验进行鉴定。下列有关该实验的叙述，正确的是(　　)
A．在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越快
B．DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度无关
C．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在红外灯下被检测出来
D．如果引物特异性不强，扩增出来的条带可能不止一条
2．(2025·武汉一模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是(　　)
A．需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B．应在PCR扩增体系中添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶
C．可适当降低复性的温度，以减少PCR中非特异性条带的产生
D．用限制酶B作用后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子
3．(2024·厦门质检)如图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B．PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③
D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物
4．(2024·重庆模拟)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是(　　)
A．用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B．进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C．最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
5.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　)
A．过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B．过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键
C．过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶
D．该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的位置
6．(2024·无锡模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(　　)
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因，则需要消耗15个通用引物RP2
7.(2024·安顺调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是(　　)
A．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
B．耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键和水解磷酸二酯键
C．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关
D．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
8．(2025·成都期末)某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2－amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(灰色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A．利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链
B．不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C．dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D．杂交链延伸得到dsred2－amy融合基因的过程不需要加引物
二、非选择题
9．(12分)(2025·长沙模拟)水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌Ti质粒的T－DNA可以转移并随机插入野生型水稻基因组中(可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点)，导致被插入的基因功能丧失，从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，为确定T－DNA插入植物细胞的染色体位置，可根据T－DNA序列，扩增其两侧未知序列比对，从而确定插入的染色体。
(1)图1所示序列使用限制酶酶切后，将所得DNA使用__________酶连成环状(如图2)，再设计引物进行PCR扩增，其中复性过程的作用是____________________________。
(2)请根据图1的T－DNA的一条链的碱基序列，选出PCR中使用的引物序列是______和______(填序号)。
T－DNA序列 引物序列
5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTAT－3′ ①5′－GCGCATAGTT－3′ ②5′－ATAGGCTACG－3′ ③5′－CGTAGCCTAT－3′ ④5′－AACTATGCGC－3′
(3)由图2中环状DNA至少经过______轮循环才能得到图示链状PCR产物(如图3)。
(4)经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA插入2号染色体上的B基因中。研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测B基因可______(填“促进”或“抑制”)水稻穗粒的形成，从而控制高产性状。
10．(14分)(2025·安庆模拟)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现对目标DNA片段的扩增。第一组外引物大小为25 bp，复性温度较高(68 ℃)，扩增后得到中间产物；第二组内引物大小为17 bp，复性温度较低(46 ℃)，内引物的结合部位在中间产物内部。具体过程如图一所示，回答下列问题：
(1)巢式PCR反应体系中除模板、引物、Mg2＋外，还应加入____________________________(答出两点即可)等。
(2)巢式PCR时，复性温度与引物长度呈________(填“正相关”或“负相关”)。若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，则使用内引物进行第二次PCR扩增时，完成配对并扩增的概率会__________。由此可知，巢式PCR相较于常规PCR具有的优点是________________________________________________________________________。
(3)家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品DNA提取 选取滋养层细胞提取DNA
PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计并合成a.______对引物
PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸
鉴定分析 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别
b._______________ 对受体奶牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
①请将表格内容补充完整：a是____________；b是________________。
②巢式PCR产物鉴定结果如图二所示，1～5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是__________。
11．(12分)(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是________________。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有__________________
______________________________________________________。
(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案精析
1．D　[在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越慢，A错误；凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移速率，B错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子经过核酸染料染色后可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，C错误；如果引物特异性不强，引物可能会与目的基因以外的其他的DNA片段结合，扩增出来的条带可能不止一条，D正确。]
2．B　[引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，A错误；PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2＋用于激活DNA聚合酶，B正确；复性温度过低会导致引物与模板链的结合不牢固，会增加PCR中非特异性条带，C错误；与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点，用限制酶B作用后进行电泳，若有3条电泳条带可判断为杂合子，D错误。]
3．D　[根据DNA分子中两条链的反向平行关系及图示可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，A错误；PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，需消耗7个引物③，C错误。]
4．C　[不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。]
5．C　[过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。]
6．D　[两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。]
7．D　[Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。]
8．C　[利用PCR技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酶来打开DNA双链，A正确；引物②和引物③中部分序列可互补配对，引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增，B正确；dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交链延伸得到dsred2－amy融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。]
9．(1)DNA连接　使引物通过碱基互补配对结合到模板链上　(2)①　③　(3)3　(4)促进
解析　(2)
T－DNA序列 引物序列
5′—AACTATGCGC……CGTAGCCTAT—3′ 3′—TTGATACGCG……GCATCGGATA—5′ 5′—GCGCATAGTT—3′
5′－CGTAGCCTAT－3′
据上述分析，PCR中使用的引物序列是①和③。(4)该突变体产量明显低于野生型，而突变体内B基因由于插入了T－DNA功能丧失，据此推测B基因促进水稻穗粒的形成。
10．(1)缓冲液、耐高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(或dNTP)　(2)正相关　下降　特异性强、灵敏度高　(3)①4　同期发情　②1、2、4
解析　(2)PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸，巢式PCR时，复性温度与引物长度呈正相关。巢式PCR时，若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，再使用内引物扩增，在错误片段上进行引物配对并扩增的概率会下降，因此，相比于常规PCR而言，巢式PCR特异性强、灵敏度高。(3)①本实验用巢式PCR技术，用的是两轮PCR，因此扩增一种基因片段则需要设计2对引物，而扩增2种基因片段则需要设计4对引物。在胚胎移植前需要对受体奶牛进行同期发情处理，便于移植。②题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSNIS1)并进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条带，雄性有两条带，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚胎是1、2、4。
11．(1)模板、引物　引物的设计　(2)限制酶、DNA连接酶
(3)ABC　(4)P3、P4　(5)电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最主要因素。(2)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(3)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；培养基冷却后才接种，故抗性平板上未长出菌落一般不是因为培养基温度太高，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法接种后在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。(4)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 110(bp)，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(5)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。专题突破10　综合PCR的基因工程问题
课标要求 阐明PCR的原理、反应条件、反应过程；用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定。
考情分析 引物的选择和设计、PCR扩增结果的电泳鉴定与分析、PCR的应用 2024·湖南·T15　2024·山东·T3　2024·黑吉辽·T7 2023·江苏·T22　2022·辽宁·T12　2022·江苏·T24
类型一　PCR引物碱基序列的设计
1．土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为(　　)
A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
2．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
3．以下两组引物设计的均不合理的原因是____________________________________________
_______________________________________________________________________________。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的优劣对PCR反应的效率和特异性影响很大，引物设计的原则主要包括：
(1)引物长度一般为20～30 bp，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。
(2)引物中CG含量要适宜，CG含量越高，复性(退火)温度越高，产物特异性越高。
(3)引物自身、引物之间不能有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影响引物与模板的复性结合。
(4)引物的5′端可以修饰(添加酶切位点、引入突变序列)，但3′端不可修饰(与模板DNA配对)。
类型二　利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
4．(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
1．DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
两液：电泳缓冲液与凝胶载样缓冲液。电泳缓冲液能维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质；凝胶载样缓冲液可影响物质的电泳迁移速率，主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置。
两剂：核酸染料与指示剂。核酸染料是用来染色DNA或RNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带，最常用的核酸染料是溴化乙锭。最常用的指示剂是溴酚蓝，它在电泳凝胶中的迁移速度与DNA或RNA分子的迁移速度相近。在电泳过程中，溴酚蓝通常位于样品的前沿，形成一个明显的蓝色条带，这有助于实验者判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。
2．DNA迁移速率的影响因素
(1)凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，DNA迁移受到的阻力越大，速率越慢。
(2)DNA分子的大小：DNA的分子量越大，迁移速率越慢。
(3)DNA分子的构象：三种构象的质粒在琼脂糖凝胶电泳的前后顺序为环形超螺旋(DNA两条链都是完整的质粒)>线形>开环(DNA双链断了一条成为松弛的环)。
类型三　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接
5．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________。
　检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
类型四　利用PCR技术引导基因定点突变及融合基因的重组构建——重叠延伸PCR
6．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_____________________________
________________________________________________________________________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是___________________________________________
________________________________________________________________________。
　
重叠延伸PCR技术：采用具有互补配对片段的引物，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因或将不同来源的任意DNA片段连接起来。
类型五　利用PCR技术扩增未知基因序列——反向PCR
7．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种______________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化_______________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
　
反向PCR是反向互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增，得到已知序列的旁侧DNA片段。
类型六　利用PCR技术快速检测病原体——荧光定量PCR
8．猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“负相关”)。
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有____________
________________________________________________________________________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。
(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________(多选)。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
　
荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反应进程的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。Ct值是荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系，起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
答案精析
1．A　[图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′(上面链的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面链的引物)作为引物对，A符合题意。]
2．D　[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异条带的产生，A不符合题意；延长热变性的时间不影响引物和模板配对，故不能有效减少反应非特异条带的产生，B不符合题意；一般根据待扩增片段的长度适当延长延伸的时间，但延伸时间过长可能会出现非特异性扩增，C不符合题意；复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生，D符合题意。]
3．引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
4．A　[在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，需根据待分离DNA片段的大小配制琼脂糖溶液，故琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑待分离DNA片段的大小，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，且DNA在电场中从负极向正极移动，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子可在波长为300 nm的紫外灯(不是紫光灯)下被检测，并且需染色，D错误。]
5．乙、丙　目的基因反向连接
解析　分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。
6．(1)改造基因(或基因定点突变)　(2)T－A或C－G　A或G　(3)3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用　(4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
解析　(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。
7．(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④
解析　(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合延伸形成子链，该引物是②。
8．(1)逆转录　(2)①碱基互补配对　②正相关
(3)①TaqDNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降　②越小　③阳性　(4)abc
解析　(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。根据题干信息可知，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关。(3)②样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。③Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2中荧光阈值大概是25，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性，故选a、b、c。(共88张PPT)
综合PCR的基因工程问题
生物
大
一
轮
复
习
专题突破10
课标要求
阐明PCR的原理、反应条件、反应过程；用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定。
考情分析
引物的选择和设计、PCR扩增结果的电泳鉴定与分析、PCR的应用 2024·湖南·T15　2024·山东·T3　2024·黑吉辽·T7
2023·江苏·T22　2022·辽宁·T12　2022·江苏·T24
类型一　PCR引物碱基序列的设计
1.土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为
A.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′
B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′
C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′
D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′
√
图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′(上面链的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′
(下面链的引物)作为引物对，A符合题意。
2.(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
√
增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异条带的产生，A不符合题意；
延长热变性的时间不影响引物和模板配对，故不能有效减少反应非特异条带的产生，B不符合题意；
一般根据待扩增片段的长度适当延长延伸的时间，但延伸时间过长可能会出现非特异性扩增，C不符合题意；
复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生，D符合题意。
3.以下两组引物设计的均不合理的原因是___________________________
_______________________________________________________________。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的优劣对PCR反应的效率和特异性影响很大，引物设计的原则主要包括：
(1)引物长度一般为20～30 bp，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。
(2)引物中CG含量要适宜，CG含量越高，复性(退火)温度越高，产物特异性越高。
(3)引物自身、引物之间不能有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影响引物与模板的复性结合。
(4)引物的5′端可以修饰(添加酶切位点、引入突变序列)，但3′端不可修饰(与模板DNA配对)。
归纳总结
类型二　利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
4.(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
√
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，需根据待分离DNA片段的大小配制琼脂糖溶液，故琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑待分离DNA片段的大小，A正确；
凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，B错误；
DNA片段的迁移速率与其大小成反比，且DNA在电场中从负极向正极移动，C错误；
琼脂糖凝胶中的DNA分子可在波长为300 nm的紫外灯(不是紫光灯)下被检测，并且需染色，D错误。
1.DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
两液：电泳缓冲液与凝胶载样缓冲液。电泳缓冲液能维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质；凝胶载样缓冲液可影响物质的电泳迁移速率，主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置。
两剂：核酸染料与指示剂。核酸染料是用来染色DNA或RNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带，最常用的核酸染料是溴化乙锭。最常用的指示剂是溴酚蓝，它在电泳凝胶中的迁移速度与DNA或RNA分子的迁移速度相近。在电泳过程中，溴酚蓝通常位于样品的前沿，形成一个明显的蓝色条带，这有助于实验者判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。
归纳总结
2.DNA迁移速率的影响因素
(1)凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，DNA迁移受到的阻力越大，速率越慢。
(2)DNA分子的大小：DNA的分子量越大，迁移速率越慢。
(3)DNA分子的构象：三种构象的质粒在琼脂糖凝胶电泳的前后顺序为环形超螺旋(DNA两条链都是完整的质粒)>线形>开环(DNA双链断了一条成为松弛的环)。
归纳总结
类型三　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接
5.(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基
因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_________________。
乙、丙
目的基因反向连接
正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。
分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
归纳总结
类型四　利用PCR技术引导基因定点突变及融合基因的重组构建——重叠延伸PCR
6.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________________来完成。
(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______
_______才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______(假设引物为单链DNA)。
改造基因(或基因定点突变)
或C－G
T－A
A或G
若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。
_________________________________________________。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_______________
3
引物2和3中存在
互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
若两个反应系统均进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。
___________________________________。
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是___________________________
M1、M2中的一种引物与N1、N2
中的一种引物必须具有互补配对的片段
重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。
重叠延伸PCR技术：采用具有互补配对片段的引物，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因或将不同来源的任意DNA片段连接起来。
归纳总结
类型五　利用PCR技术扩增未知基因序列——反向PCR
7.(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种____
__________________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。
限制
性内切核酸(或限制)
核苷酸序列
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成_____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得_________；Taq DNA聚合酶的作用是催化______________________
_______。
磷酸二酯键
DNA单链
以DNA为模板的DNA链
的延伸
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列

PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
②④
PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合延伸形成子链，该引物是②。
反向PCR是反向互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增，得到已知序列的旁侧DNA片段。
归纳总结
由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。
类型六　利用PCR技术快速检测病原体——荧光定量PCR
8.猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
逆转录
(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生
荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。
碱基互补配对
在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。根据题干信息可知，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关。
②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“负相关”)。
正相关
(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有___________
______________________________________________。
合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降
TaqDNA聚
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就______。
越小
样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。
③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤
37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____。
阳性
Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2中荧光阈值大概是25，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。
(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有_______
(多选)。
a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c.病毒发生变异
abc
阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性，故选a、b、c。
荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反应进程的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。Ct值是荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系，起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
归纳总结
课时精练
对一对
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
题号 1 2 3 4 5 6 7 8
答案 D B D C C D D C
(1)DNA连接　使引物通过碱基互补配对结合到模板链上　
(2)①　③　
(3)3　
(4)促进
9.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
(1)缓冲液、耐高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(或dNTP)　
(2)正相关　下降　特异性强、灵敏度高　
(3)①4　同期发情　②1、2、4
10.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
(1)模板、引物　引物的设计　
(2)限制酶、DNA连接酶
(3)ABC　
(4)P3、P4　
(5)电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
11.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
一、选择题
1.(2024·武汉期末)基因工程中，通过PCR可以特异性地快速扩增目的基因，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳实验进行鉴定。下列有关该实验的叙述，正确的是
A.在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越快
B.DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度无关
C.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在红外灯下被检测出来
D.如果引物特异性不强，扩增出来的条带可能不止一条
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越慢，A错误；
凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移速率，B错误；
琼脂糖凝胶中的DNA分子经过核酸染料染色后可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，C错误；
如果引物特异性不强，引物可能会与目的基因以外的其他的DNA片段结合，扩增出来的条带可能不止一条，D正确。
答案
2.(2025·武汉一模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是
A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B.应在PCR扩增体系中添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶
C.可适当降低复性的温度，以减少PCR中非特异性条带的产生
D.用限制酶B作用后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，A错误；
PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2＋用于激活DNA聚合酶，B正确；
复性温度过低会导致引物与模板链的结合不牢固，会增加PCR中非特异性条带，C错误；
与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点，用限制酶B作用后进行电泳，若有3条电泳条带可判断为杂合子，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
3.(2024·厦门质检)如图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是
A.②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
B.PCR 过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制
C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③
D.物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双
链产物
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
根据DNA分子中两条链的反向平行关系及图示可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，A错误；
PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之后才进行复制，B错误；
以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，需消耗7个引物③，C错误。
例通常为1∶100。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是
4.(2024·重庆模拟)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
C.最后大量获得的ssDNA与图
中乙链的碱基序列一致
D.因为双链DNA和单链DNA
的分子量大小不同，可通
过电泳方法将其分离
A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
√
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。
5.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不
正确的是
A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键
C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和
解旋酶
D.该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的
位置
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。
6.(2024·无锡模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是
A.过程①需要把两对引物同时加入一个
扩增体系以提高扩增效率
B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所示
PCR产物
C.过程②的产物都可以完成延伸过程
D.若过程④得到16个突变基因，则需要
消耗15个通用引物RP2
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；
过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；
过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。
水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是
7.(2024·安顺调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作
用是形成磷酸二酯键和水解磷酸二酯键
C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内
样本DNA的含量呈正相关
D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越
多，患者危险性更高
A.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段
√
Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
8.(2025·成都期末)某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2－amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(灰色区域)可互补配对。下列说法错误的是
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链
B.不能在同一反应体系中进
行dsred2基因和amy基因的
扩增
C.dsred2基因和amy基因混合
后只能得到一种类型的杂
交链
D.杂交链延伸得到dsred2－
amy融合基因的过程不需要加引物
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
利用PCR技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酶来打开DNA双链，A正确；
引物②和引物③中部分序列可互补配对，引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增，B正确；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；
杂交链延伸得到dsred2－amy融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。
二、非选择题
9.(2025·长沙模拟)水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌Ti质粒的T－DNA可以转移并
随机插入野生型水稻基因组中(可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点)，导致被插入的基因功能丧失，从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，为确定T－DNA插入植物细胞的染色体位置，可根据T－DNA序列，扩增其两侧未知序列比对，从而确定插入的染色体。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
(1)图1所示序列使用限制酶酶切后，将所得DNA使用_________
酶连成环状(如图2)，再设计引物进行PCR扩增，其中复性过程的作用是_________________
_____________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
DNA连接
使引物通过碱基互
补配对结合到模板链上
(2)请根据图1的T－DNA的一条链的碱基序列，选出PCR中使用的引物序列是______和______(填序号)。
T－DNA序列 引物序列
5′－AACTATGCGC ……CGTAGCCTAT－3′ ①5′－GCGCATAGTT－3′
②5′－ATAGGCTACG－3′
③5′－CGTAGCCTAT－3′
④5′－AACTATGCGC－3′
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
①
③
T－DNA序列 引物序列
5′—AACTATGCGC…… CGTAGCCTAT—3′ 3′—TTGATACGCG…… GCATCGGATA—5′ 5′—GCGCATAGTT—3′
5′－CGTAGCCTAT－3′
据上述分析，PCR中使用的引物序列是①和③。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
(3)由图2中环状DNA至少经过______轮循环才能得到图示链状PCR产物(如图3)。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
3
(4)经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA插入2号染色体上的B基因中。研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测B基因可_____(填“促进”或“抑制”)水稻穗粒的形成，从而控制高产性状。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
促进
该突变体产量明显低于野生型，而突变体内B基因由于插入了T－DNA功能丧失，据此推测B基因促进水稻穗粒的形成。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
10.(2025·安庆模拟)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现对目标DNA片段的扩增。第一组外引物大小为25 bp，复性温度较高(68 ℃)，扩增后得到中间产物；第二组内引物大小为17 bp，复性温度较低(46 ℃)，内引物的结合部位在中间产物内部。具体过程如图一所示，回答下列问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
(1)巢式PCR反应体系中除模板、引物、Mg2＋外，还应加入____________
________________________________________________________(答出两点即可)等。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(或dNTP)
缓冲液、耐
(2)巢式PCR时，复性温度与引物长度呈________(填“正相关”或“负相关”)。若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，则使用内引物进行第二次PCR扩增时，完成配对并扩增的概率会______。由此可知，巢式PCR相较于常规PCR具有的优点是___________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
正相关
下降
特异性强、灵敏度高
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
时产生了错误片段，再使用内引物扩增，在错误片段上进行引物配对并扩增的概率会下降，因此，相比于常规PCR而言，巢式PCR特异性强、灵敏度高。
PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸，巢式PCR时，复性温度与引物长度呈正相关。巢式PCR时，若使用外引物进行第一次PCR扩增
(3)家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。
①请将表格内容补充完整：a是_____；b是___________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
4
同期发情
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品DNA提取 选取滋养层细胞提取DNA
PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计并合成a._____对引物
PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸
鉴定分析 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别
b._________ 对受体奶牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
本实验用巢式PCR技术，用的是两轮PCR，因此扩增一种基因片段则需要设计2对引物，而扩增2种基因片段则需要设计4对引物。在胚胎移植前需要对受体奶牛进行同期发情处理，便于移植。
题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSNIS1)并进行电泳，雌性个体没有SRY，只有一条带，雄性有两条带，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚胎是1、2、4。
②巢式PCR产物鉴定结果如图二所示，1～5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求的胚胎是_________。
1、2、4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
11.(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反
应体系中不同的有__________，扩增程序中最主要的不同是___________。
模板、引物
引物的设计
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
PCR反应进行的条件：引物、酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需
要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最主要因素。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有______
_______________。
限制
酶、DNA连接酶
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。
(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。
A.稀释涂布平板需控制每
个平板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落
的原因一般是培养基温
度太高
C.抗性平板上常常会出现
大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化
ABC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；
培养基冷却后才接种，故抗性平板上未长出菌落一般不是因为培养基温度太高，B错误；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法接种后在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。
EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 110(bp)，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
P3、P4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_______
_______________________________________________________________。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
答案
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。

展开更多......

收起↑