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(共54张PPT)
判断：得到3种黏性末端要用到三种不同的限制酶（ ）
1.基因工程的原理、操作水平、操作结果、场所？
2.为什么不同生物DNA分子能够连接起来？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
3.重组DNA技术的三种工具？
4.限制酶的来源、作用、结果？限制酶存在于原核生物中的作用？为什么不会切割自身的DNA？
5.DAN连接酶的作用、分类？与DNA聚合酶的区别？
6.质粒的本质？载体需要具备的条件？载体的分类、不同点？
8.DNA粗提取的原理？研磨的目的 低温放置的目的？
9.为什么不能选哺乳动物成熟的红细胞？
10.二苯胺试剂的使用条件？
温故知新
第3章 基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
本节聚焦：
◆ 第二步：基因表达载体的构建
◆ 第一步：目的基因的筛选与获取
◆ 第三步：将目的基因导入受体细胞
◆ 第四步：目的基因的检测与鉴定
◆ DNA 片段的扩增及电泳鉴定
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪四个步骤？核心步骤是哪一步？
2.什么是目的基因？常用的目的基因有哪些？举例
Bt基因是什么，Bt抗虫蛋白如何起作用
3.筛选目的基因的有效方法？获取目的基因的主要方法
4.什么是PCR？（全称，原理，操作环境，目的）
进行PCR需要什么条件？缓冲液一般加什么？为什么？
5.PCR与体内DNA复制的区别
6.PCR大致过程是怎样的（注意温度！）？用什么完成？扩增的结果是什么？PCR的产物通常如何鉴定？
7.什么是引物？引物的作用是什么？为什么需要引物？需要几种引物？引物的选择一般需要注意什么？
8.用PCR可以扩增mRNA吗？
自主预习
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
“分子手术刀”
“分子缝合针”
实际操作和这一样都在体外进行吗？
体外
导入
载体
DNA连接酶
重组DNA
限制酶
1.目的基因的筛选和获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
（二）筛选合适的目的基因
1、从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。
一、目的基因的筛选与获取
（二）筛选合适的目的基因
测序技术
序列数据库
序列比对工具
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
2、其它方法：
一、目的基因的筛选与获取
（三）获取目的基因的方法
人工合成
从基因文库中获取
利用PCR获取和扩增目的基因
一、目的基因的筛选与获取
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
解旋酶
DNA母链（两条）
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA（目的基因）模板
4种脱氧核苷酸(dNTP)
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常与两条模板链结合的2种为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2.PCR的进行需要的条件
dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。
2、PCR条件
1）变性（不需要解旋酶）：
待扩增的DNA片段
第一步：变性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
3、PCR反应的过程
当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解聚为两条单链DNA。
变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
2）复性：
第二步：复性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
5’
5’
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为DNA聚合酶不能从0开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
3’
3’
3、PCR反应的过程
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
3）延伸：
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3、PCR反应的过程
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
耐高温的DNA聚合酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
反应结果：以指数形式扩增即2n（n为扩增循环的次数）
3、PCR反应的过程
（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
【问题探究】
5’
3’
3’
5’
（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
【问题探究】
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
3、PCR反应的过程
（3）设计的引物应含有什么样的序列？
引物含有能与目的基因两端（3’端）配对的核苷酸序列。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
【问题探究】
引物的5′端还要添加上限制酶的识别序列。
（2）两种引物都结合在DNA模板链的 端；
脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。
3’
3’
一、目的基因的筛选与获取
①DNA分子有_____个
②总链数_____条
③不含引物的链数：___
④含引物的链数_____
⑤含引物1或2的链数：______
⑥仅含引物1的DNA数：______
⑦仅含引物2的DNA数：______
⑧引物1、2均含有的DNA数：_____
⑨不含引物的DNA数：______
⑩需要引物的总数：______
2n
2n+1
2
2n+1-2
循环n次：
2n-1
1
1
2n-2
0
2n+1-2
★
(4)PCR反应的过程
（4）如果循环n次，则共需消耗 个引物，产物中含有引物A的DNA有 个，含有两种引物的DNA有 个，目的基因有 个。
2n－1
2n+1－2
【问题探究】
2n－2
2n－2n
（5）用PCR可以扩增mRNA吗？
【问题探究】
不能。mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行PCR。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
3．什么是转化？转化植物细胞常用方法有哪些？分别适用于什么植物？
4．转化动物细胞一般用什么方法？通常选用什么细胞作为受体细胞？
5．转化微生物细胞一般采用什么方法？如何使大肠杆菌处于感受态？选择大肠杆菌作为受体细胞有何优势？
6．目的基因导入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，该如何检测与鉴定.
自主预习
受体细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
（我国科学家独创）
（常用）
显微注射法
Ca2+处理法
（一）导入方法
三、将目的基因导入受体细胞
植物细胞
花粉管通道法
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
（我国科学家独创）
三、将目的基因导入受体细胞
（我国科学家独创）
植物细胞
花粉管通道法
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
三、将目的基因导入受体细胞
植物细胞
农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
农杆菌
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
Ti质粒
T—DNA
农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将_______上的_______（______________）转移到被侵染的细胞，并且将其________________________________
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
三、将目的基因导入受体细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
Ti质粒
T—DNA
目的基因
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
农杆菌转化法：
（如：叶片、花序等）
三、将目的基因导入受体细胞
研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？
转两个T基因
普通棉花细胞
甲
乙
丙
思考·讨论
有三种情况，如右图所示。
若甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？
甲自交→全为抗虫
乙自交→抗虫：不抗虫=3:1
丙自交→抗虫：不抗虫=15:1
三、将目的基因导入受体细
2. 导入动物细胞
—— 显微注射法
（1）受体细胞：
一般是受精卵
原因： 体积大，易操作；
受精卵全能性高，易培养成完整个体。
显微注射仪
将目的基因注射到动物受精卵中
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
三、将目的基因导入受体细
3. 导入微生物细胞
—— Ca2+ 处理转化法
（1）原核生物作为受体细胞的优点：
繁殖快、易培养操作、多为单细胞、遗传物质相对较少等
（2）操作过程：
大肠
杆菌
Ca2+
表达
载体
Ca2+ 处理法示意图
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收 DNA 分子
一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态。
三、将目的基因导入受体细
3. 导入微生物细胞
利用工程菌生产真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外加工。
因为原核生物没有内质网、高尔基体等细胞器，无法完成蛋白质的加工。
【拓展】 病毒侵染法
也可以用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，用病毒去感染受体细胞，使目的基因导入受体细胞内。这种方法比较常见于将目的基因导入动物细胞。
如疫情期间我国陈薇院士团队研发的重组新型冠状病毒疫苗是用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白引发相应的免疫反应。
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功，标记基因（如抗生素抗性基因）筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？
若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。
此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。
思考：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
你认为可以从哪些方面/水平进行检测？
（1）检测目的基因是否已经导入（检测DNA ）
（2）检测目的基因是否已经转录（检测mRNA）
（3）检测目的基因是否已经表达（检测蛋白质）
（4）检测目的基因是否已经发挥作用（检测个体是否获得某种特性）
四、目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质——
（一）分子水平检测
PCR等技术
抗原—抗体杂交
四、目的基因的检测与鉴定
转基因生物中提取DNA，进行PCR反应
——检测染色体DNA上是否插入了目的基因
PCR等技术
琼脂糖凝胶电泳
判断标准：是否扩增出目的基因
——检测目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
琼脂糖凝胶电泳
判断标准：是否扩增出
目的基因cDNA
【拓展】 利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录
基因探针：一段带有标记（放射性同位素标记或荧光标记）能与目的基因的的一条链碱基互补配对的单链核苷酸片段。
检测方法：将待测DNA 或 RNA 与基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
【拓展】 利用基因探针来检测目的基因是否导入或者转录
基因探针：一段带有标记（放射性同位素标记或荧光标记）能与目的基因的的一条链碱基互补配对的单链核苷酸片段。
检测方法：将待测DNA 或 RNA 与基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
DNA分子杂交
分子杂交
苏云金杆菌
Bt蛋白
注射到小鼠体内
抗体
标记抗体
抗原
杂交
脱分化
——检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
利用了抗原与抗体的特异性结合原理。
（二）个体生物学水平鉴定
方法：
抗虫或抗病接种实验
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
——检测目的基因是否表现出相应的性状
四、目的基因的检测与鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
检测方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选和获取
利用PCR获取和扩增
人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
小结：
②鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
1. 实验原理
（2）电泳的原理
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
电源
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
PCR仪
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
2.材料用具
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （1pg～1μg） 5～10μL
总体积 50μL
PCR反应体系的配方
2.材料用具
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。
（1）DNA片段的扩增（1、2、3）
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min
3.方法步骤
（2）DNA片段的电泳鉴定
配制琼脂糖溶液（加核酸染液）
制备凝胶
加样
电泳
观察记录
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
4.注意事项
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
5.结果分析与评价
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：
漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：
引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
5.结果分析与评价
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
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