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人教版高中生物 选择性必修3
第1章　第2节　微生物的培养技术及应用
第二课时 微生物的选择培养和计数
学习目标
1.能运用生物与环境相适应的观点，解释选择培养基筛选微生物的原理。
2.能按照科学探究的要求，应用稀释涂布平板法和微生物数量测定的方法，设计从土壤中分离分解尿素的细菌并进行计数的方案。依据设计的方案，运用无菌操作技术和微生物分离、培养的方法初步分离出目标菌。
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
事实1
稀释涂布平板法中出现的杂菌
新课导入
科学实例
寻找耐高温的DNA聚合酶
在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。
美国黄石公园
相应的生存环境中寻找
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
选择培养基
实验室微生物筛选原理:人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。
纤维素分解菌
启示
目录
选择培养基、微生物的选择培养和数量测定
01
探究 实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
02
高温环境下培养
无氧环境下培养
1.选择培养基：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2.方法：
（1）在培养基中加入某种化学物质。
（2）改变培养基中的营养成分。
（3）改变微生物的培养条件。
耐高温微生物
厌氧型微生物
兼性厌氧型
（一）选择培养基
分离得到酵母菌、霉菌等
加高浓度食盐的培养基
分离得到金黄色葡萄球菌
加入青霉素的培养基
分离固氮菌
分离自养型微生物
不加含碳有机物的无碳培养基
不加氮源的无氮培养基
尿素施入土壤后，会被某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中细菌的数量最多，能分解尿素的细菌只是其中的一部分。
事实2
结合材料思考
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
3.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若对照培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
1.选择培养基的作用：
2.微生物选择培养获取纯培养物的方法：
分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。
由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。
选择培养基
+
稀释涂布平板
单菌落
（二）微生物的选择培养
梯度稀释
涂布平板
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
3.稀释涂布平板法的操作过程：
（二）微生物的选择培养
（1）梯度稀释
微量
移液器
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养。
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
3.稀释涂布平板法的操作过程：
（二）微生物的选择培养
（2）涂布平板
梯度稀释
涂布平板
放入30~37℃恒温箱中
培养1～2d
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
思考：
设置空白对照组的目的是什么？
检测培养基灭菌是否彻底，保证实验结果的准确性。
根据实验结果，能否计算出细菌数目的是多少？原理是什么？
可以。
4.培养与观察
（二）微生物的选择培养
①分离微生物
②统计样品中活菌的数目
（三）微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
② 计数原则：
① 原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
活菌
活菌
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
M：代表稀释倍数；
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个
③ 计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
1.1×108
——间接计数法
（三）微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
利用特定的____________或 ______________在________下观察、计数，然后再计算 __________的样品中微生物的数量；
①原理：
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
②优点：
③缺点：
快速、直观
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
——直接计数法
（三）微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
计数区
放大后的计数室
④计数方法：
每毫升原液所含细菌数＝
每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
（三）微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法
——直接计数法
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、_____________ 　　　　　　 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的　 　数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝ 每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数
血细胞计数板
或细菌计数板
菌落
（三）微生物的数量测定
每克样品中的菌株数＝
两种计数方法
知识总结
1、选择培养基的类型
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80 ℃的高温 水生栖热菌
添加某种化学物质 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐 金黄色葡萄球菌
特殊碳源、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
营养缺陷 不加碳源 自养型微生物
不加氮源 固氮菌
平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤
接种工具
单菌落的获得
用途
培养结果
相同点 接种环在固体培养基表面连续划线
等比稀释操作和涂布平板操作
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
平板划线法不能达到对细菌进行计数的目的，因为平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，
均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。
2、两种纯培养方法比较
跟踪训练
1.(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是
A.a点时取样、尿素氮源培养基
B.b点时取样、角蛋白氮源培养基
C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D.c点时取样、角蛋白氮源培养基
√
研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。
跟踪训练
跟踪训练
√
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是
A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
跟踪训练
根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；
图甲、乙中若均为选择
培养基，均可用于分离
微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；
稀释涂布平板法接种工具为涂布器，平板划线法接种工具为接种环，C错误；
图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。
视频示范
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题：
（1）土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
（2）每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以分离。
2.做出假设：
3.实验原理：
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
4.实验步骤：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
（一）实验设计
（1）无菌操作：
（2）做好标记：
（3）规划时间：
本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
如
在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
取土样的用具在使用前都需要灭菌。
（二）操作提示
（三）实验过程
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
制备牛肉膏蛋白胨培养基
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
（三）实验过程
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
（三）实验过程
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。
（三）实验过程
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。
（三）实验过程
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
土壤中分解尿素的细菌的分离、计数与鉴定
任务2
案例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的做法正确吗？ 如果有问题，错在哪？ 如何改进？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
土壤中分解尿素的细菌的分离、计数与鉴定
任务2
3.尝试完成表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂菌污染的判断 ____________________________ 未被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌
选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目______选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
对照组的培养基中无菌落生长
大于
①培养：
②观察：
根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。
b．记录菌落的特征：
包括菌落的形状、大小和颜色等。
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定都是能分解尿素的微生物；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
（三）实验过程
土壤取样
制备培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
鉴定培养基
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
鉴定培养基
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别不同的微生物
培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)
跟踪训练
3.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，不正确的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏
　蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不
　会使酚红指示剂变红
√
跟踪训练
利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低、菌落数目太多，会连在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；
若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置接种在没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；
分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。
跟踪训练
4.(2023·江苏连云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B.将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
　可以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，
　则可以证明甲同学操作无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
√
B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复原则，D错误。
课堂小结
本堂课你学到了哪些知识？画出概念图进行总结

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