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第三章
基因工程
第2节
基因工程的基本操作程序
学生实践展示
从实践中学
从实践中学
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
从社会中来
▲ 普通棉桃（左）和转基因抗虫棉桃（右）
抗虫机制：
转基因抗虫棉的抗虫机制及培育过程
Bt 抗虫蛋白赋予棉花抗虫能力
苏云金杆菌
Bt 抗虫蛋白
破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
培育过程：
苏云金杆菌
Bt 抗虫蛋白基因
提取
与载体拼接
导入
棉花细胞
抗虫棉
表达
Bt基因的筛选与获取
Bt基因表达载体的构建
将Bt基因导入受体细胞
Bt基因的检测与鉴定
第一步：Bt基因的筛选与获取
Bt 抗虫蛋白基因（Bt基因）
1. 目的基因：
是编码Bt抗虫蛋白质的基因
也可以是具有调控Bt基因的因子
第一步：Bt基因的筛选与获取
2. 筛选Bt基因：
可以从苏云金杆菌中筛选Bt基因。
还可以利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到Bt基因。
问题：筛选出来的目的基因如何获取呢？
第一步：Bt基因的筛选与获取
3. 获取Bt基因的方法：
（1）人工合成Bt基因
在明确Bt基因碱基序列的基础上，利用 DNA 合成仪自动化合成所需的 DNA片段。
▲ DNA 合成仪
注：仅适用于较短的DNA。
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。
第一步：Bt基因的筛选与获取
（2）从基因文库中获取
苏云金杆菌
基因组 DNA
DNA片段
限制酶
酶切
与载体重组
导入
mRNA
逆转录
cDNA
与载体重组
导入
基因组
文库
cDNA
文库
基因文库
提取
提取
第一步：Bt基因的筛选与获取
（3）利用 PCR 特异性地快速扩增Bt基因
① 概念：
PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
② 原理：
DNA半保留复制
③ 优点：
可以短时间内大量扩增目的基因
凯利·穆里斯
（1944.12-2019.8.7）
④ 条件：
第一步：Bt基因的筛选与获取
体内 DNA 复制参与的组分 在 DNA 复制中的作用 PCR 中参与的组分
打开 DNA 双链
提供 DNA 复制的模板
合成子链的原料
催化合成 DNA 子链
维持 pH 稳定
激活 DNA 聚合酶
使 DNA 聚合酶能够从引物的3' 端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA 母链
4种脱氧核苷酸（实为dNTP）
DNA 聚合酶
缓冲物质
Mg2+
引物（短的单链 RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA 母链
4种脱氧核苷酸（实为dNTP）
耐高温的 DNA 聚合酶
缓冲液
Mg2+
引物（2种，短的单链 DNA）
解旋
RNA引物
冈崎片段
▲ 体内DNA 复制过程（部分）
3'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
第一步：Bt基因的筛选与获取
相关信息——引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合游离的脱氧核苷酸，必须由引物提供 3' 端之后才能开始连接脱氧核苷酸。由于DNA双链是反向平行的，所以 PCR 需要 2 种引物。
引物的作用：使DNA聚合酶能从引物的 3' 开始连接脱氧核苷酸，启动DNA的复制。
注：PCR中的引物为短单链 DNA，通常含20~30个核苷酸。
第一步：Bt基因的筛选与获取
DNA片段
第一步：Bt基因的筛选与获取
⑤ 过程：
变性
复性
延伸
思考·讨论
PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？
由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？
不是
扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段；
引物是根据目的基因两端的（或两条链3'部分）核苷酸序列来设计的。
第一步：Bt基因的筛选与获取
引物设计要求：
a. 引物自身不能环化（即引物自身内部不能形成局部双链）
b. 两种引物之间不能互补配对
c. 引物长度不宜过短或过长，防止出现引物与模板的非特异性结合
d. 引物的 GC 含量不宜太高（通常建议在40%-60%之间），且两种引物之间GC含量（或比例）要相当，以免出现复性温度不统一
1．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
习题巩固
D
2．为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④
习题巩固
B
获取了足够量的 Bt 基因后，能不能直接将它导入受体细胞呢？
不能。游离的 DNA 进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的 DNA 片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
第二步：基因表达载体的构建
1. 目的：
让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；
使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
第二步：基因表达载体的构建
2. 组成：
基因表达载体
标记基因
复制原点
终止子
启动子
插入目的基因
位于基因的上游；
RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出 mRNA
DNA 复制的起始位点
人们所需要的基因
位于基因的下游；
终止转录
便于重组 DNA 分子的筛选（将含有目的基因的受体细胞筛选出来）
非编
码区
非编
码区
原核生物基因
启动子
终止子
编码区
非编
码区
非编
码区
真核生物基因
启动子
终止子
编码区
外显子
内含子
【拓展延伸】
真、原核生物基因的结构及转录和加工过程
转 录
前体mRNA
加 工
成熟mRNA
转 录
mRNA
注意：启动子和终止子都是DNA序列，而起始密码子和终止密码子则位于mRNA上，分别是翻译的起点和终点。
【拓展延伸】
启动子的类型（根据转录模式分）
① 组成型启动子
这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
② 组织特异性启动子
其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。
③ 诱导型启动子
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
分析基因表达载体构建的方法
（1）构建基因表达载体时，能否用 Sma Ⅰ 限制酶切割质粒？为什么？
不能；因为 SmaⅠ 切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组 DNA 分子）。
质粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
图1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
图2
分析基因表达载体构建的方法
（2）若只用 EcoR Ⅰ 限制酶切质粒和外源 DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？
质粒自身环化
正向连接
反向连接
目的基因多拷贝与质粒连接
质粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
图1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
图2
分析基因表达载体构建的方法
（3）为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源 DNA 进行切割？
使用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA。
质粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
图1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
图2
优点：①避免质粒自身环化；②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接。
双酶切法
分析基因表达载体构建的方法
问题：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
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3'
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3'
5'
3'
3'
引入限制酶识别序列
课堂小结

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