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第二章 细胞工程
动物细胞工程
选择性必修三
动物细胞培养
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建的人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞培养
人造皮肤 自体皮肤移植
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程技术
动物细胞工程
动物细胞工程的基础
一、动物细胞培养的概念
1. 动物细胞培养：从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
2. 原理：
取出
分散
适宜条件
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
操作原因：将相关组织分散成单个细胞，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出。
细胞增殖 （有丝分裂）
动物细胞工程的基础
3. 地位：
一、动物细胞培养的概念
获得细胞或细胞产物（人造皮肤的构建，动物分泌蛋白的规模化生产等），不能获得完整动物个体。
4. 目的：
二、动物细胞培养的条件
动物细胞培养所需的基本条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
二、动物细胞培养的条件
（1）成分
①合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。
②天然成分：由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
1. 营养：合成培养基 + 血清等天然成分
二、动物细胞培养的条件
1. 营养：合成培养基 + 血清等天然成分
（2）培养基物理性质：一般使用 培养基，也称为培养液。
液体
2. 无菌、无毒的环境
二、动物细胞培养的条件
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液，以便清除代谢物，
防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
（1）无菌
（2）无毒
在细胞培养液中添加适量的抗生素
思考：如何防止培养过程中的微生物污染？
3. 温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以（36.5±0.5）℃为宜。
（2）适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。
（3）适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。
二、动物细胞培养的条件
4. 气体环境
（3）通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
（1）O2：细胞代谢所必需的。
（2）CO2：主要作用是维持培养液的pH。
二、动物细胞培养的条件
三、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
细胞悬液
原代培养
用机械的方法， 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
加培养液
放入培养皿或培养瓶内
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖（悬浮生长）
一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（贴壁生长）
细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液营养物质缺乏等分裂受阻
接触抑制
CO2培养箱中
传代培养：将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，再用离心法收集
大多数细胞
1. 取动物组织
（1）取材：动物胚胎或幼龄动物的组织。
（2）原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
2. 将组织分散成单个细胞
（2）方法：机械方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理。
（1）原因：从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。分散成单个细胞能使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需的营养物质的供应，另一方面保证细胞内代谢废物的及时排出。
三、动物细胞培养的过程
动物细胞间的物质主要是蛋白质。
不行。
思考：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
注意：
①不能用胃蛋白酶将组织分散成单个细胞，因为胃蛋白酶的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活。
思考：胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
注意：
②动物细胞间的物质主要是蛋白质。
使用胰蛋白酶时，应注意控制好作用时间。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，细胞膜也含有蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
能，应注意时间的控制。
三、动物细胞培养的过程
（1）原代培养：指分瓶之前，动物组织经处理后的初次培养。
（2）传代培养：分瓶后的细胞培养。
3. 原代培养和传代培养
（1）悬浮生长类：能够悬浮在培养液中生长增殖。
（2）贴壁生长类：
4. 体外培养的动物细胞类型
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型。这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
细胞贴壁生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
培养皿
培养瓶
5. 分瓶进行传代培养的原因：
（1）悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
（2）贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。
三、动物细胞培养的过程
6. 接触抑制现象：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
接触抑制现象：细胞间相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加。
刚开始铺展贴壁生长
贴壁生长并进行有丝分裂
单层相互接触出现接触抑制
正常细胞
平面观
（2）癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
肿瘤细胞
失去接触抑制
6. 接触抑制现象
（1）正常细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，当细胞相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加，最后形成一层（或单层）。
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖。
思考：为什么癌变细胞没有接触抑制现象？
①悬浮生长类：直接用离心法收集。
②贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。
（2）将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
7. 收集细胞传代培养
三、动物细胞培养的过程
（1）收集细胞的方法
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
三、动物细胞培养的过程
细胞悬液
细胞株
10代细胞
50代细胞
细胞系
无限传代
遗传物质改变
细胞系
遗传物质一般不改变
延伸拓展：细胞株和细胞系
细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制。
海拉细胞系
来自一位美国黑人妇女海瑞塔·拉克斯的宫颈癌细胞，在1951年进行细胞取样后，她于6个月后去世。这一细胞系是永生的，也就是说，只要有合适的培养环境，它们就能在细胞培养基中无限分裂下去。
不同于其他一般的人类细胞，此细胞不会衰老死亡，并可以无限分裂下去。此细胞系跟其他癌细胞系相比，增殖异常迅速。
归纳总结：植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养过程
培养结果
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
完整植株
动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
获得大量细胞
快速繁殖等
植物激素
原代培养、传代培养
脱分化、再分化
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
四、干细胞培养及其应用
1. 概念：
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。
在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
2. 分布：
干细胞存在于 、 和
等多种组织和器官中。
早期胚胎
骨髓
脐带血
3. 分类：
胚胎干细胞（ES细胞）、成体干细胞等
（1）胚胎干细胞（ES细胞）
①分布：
存在于早期胚胎中
②特点：
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
四、干细胞培养及其应用
胚胎干细胞（ES细胞）
（1）胚胎干细胞（ES细胞）
③应用实例：
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
四、干细胞培养及其应用
（1）胚胎干细胞（ES细胞）
④局限性：
四、干细胞培养及其应用
必须从胚胎中获取，涉及伦理问题，因而限制了在医学上的应用。
①分布：
存在于成体组织或器官内
（2）成体干细胞
四、干细胞培养及其应用
受精卵
囊胚
胎儿
成人
胚胎干细胞
成体干细胞
睾丸中的精原干细胞
②举例：
（2）成体干细胞
四、干细胞培养及其应用
骨髓中的造血干细胞
神经系统中的神经干细胞
血细胞和免疫细胞
分化
分化
神经细胞
分化
精原细胞
③特点：
一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
（2）成体干细胞
四、干细胞培养及其应用
④ 是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
造血干细胞
（2）成体干细胞
四、干细胞培养及其应用
4. 应用：
干细胞有着自我更新能力及分化的潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。
正常造血干细胞
患者体内
受损的血细胞
修复或替换
移植
治疗
白血病
恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍疾病
四、干细胞培养及其应用
（1）造血干细胞
4. 应用：
正常神经
干细胞
患者体内
受损的
神经组织
神经组织损伤
修复或替换
移植
治疗
神经系统退行性疾病
（帕金森病、阿尔茨海默病）
（2）神经干细胞
四、干细胞培养及其应用
资料：2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。
（1）概念：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
5. 诱导多能干细胞（iPS细胞）
四、干细胞培养及其应用
5. 诱导多能干细胞（iPS细胞）
四、干细胞培养及其应用
（2）诱导方法：
①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞均可）；
②用小分子化合物诱导形成。
知识拓展：成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分。细胞扁平，多突起，呈星状，细胞质较丰富，细胞核较大，扁卵圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。
（3）应用
②iPS细胞在治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
①应用iPS细胞可治疗小鼠的镰状细胞贫血。
5. 诱导多能干细胞（iPS细胞）
四、干细胞培养及其应用
（4）优点
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
①诱导过程无需破坏胚胎。
5. 诱导多能干细胞（iPS细胞）
四、干细胞培养及其应用
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
四、干细胞培养及其应用
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
6. 干细胞应用面临的问题及展望
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
（1）面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险。
（2）应用展望：
四、干细胞培养及其应用
练习与应用（P47）
1. 判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖（ ）
×
√
×
×
一、概念检测
2. 干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是（ ）
A. 干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B. 造血干细胞可以分化为各种血细胞
C. 不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D. 由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
练习与应用（P47）
一、概念检测
A
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导产生iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA（Human Leukocyte Antigen，人类白细胞抗原）多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
练习与应用（P47）
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。
例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
练习与应用（P47）
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
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