资源简介

(共31张PPT)
第三章 基因工程
重组DNA技术的工具
选择性必修三
图解“基因工程实质”
转移
A生物
B生物
萤火虫
普通动植物
发光基因
转基因抗虫棉
接
剪
运
限制性核酸内切酶
“分子手术刀”
DNA连接酶
“分子缝合线”
基因进入受体细胞的载体
“分子运输车”
限制性核酸内切酶
来源 从微生物（主要是原核生物）体内分离出来
功能 能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性
作用位点 “切割”的是磷酸二酯键，且只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
图解专一性
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
限制性核酸内切酶的命名
限制酶的命名法则是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制性核酸内切酶
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
暮天遥对寒窗雾；
雾窗寒对遥天暮。
在切割部位，一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链5’往3’读的顺序完全一致
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ形成的黏性末端
EcoRⅠ 形成的黏性末端
Hind Ⅲ 形成的黏性末端
Bgl Ⅱ 形成的黏性末端
GATC
AATT
AGCT
GATC
总结 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶
理性思考
01
02
03
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？
限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
烧脑练习
限制酶 Bam HI Ⅰ EcoR Ⅰ Sau 3A Ⅰ Kpn Ⅰ
识别序列及切割位点 -GGATCC- -GAATTC- -GATC- -GGTACC-
已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G GATCC-,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是- GATC-，回到下列问题：
（1）能被限制酶Ⅰ切割的DNA， （填“能”，“不能”或“不一定能”）被限制酶Ⅱ切割；
（2）能被限制酶Ⅱ切割的DNA， （填“能”，“不能”或“不一定能”）被限制酶Ⅰ切割；
能
不一定能
关于DNA的连接
作用
把两条ＤＮＡ末端之间的缝隙“缝合”起来
恢复两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
DNA连接酶
实质
DNA连接酶
DNA连接酶
关于DNA的连接
作用
把两条ＤＮＡ末端之间的缝隙“缝合”起来
恢复两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
DNA连接酶
实质
DNA连接酶
注意 DNA连接的不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
关于DNA的连接
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
思考T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同吗？
不同，因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
大自然的启示
目的基因如何转移到受体细胞？
利用病毒的侵染能力
利用接合作用中质粒的转移能力
基因进入受体细胞的载体
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
质粒是基因工程中最常用的载体
01
在基因工程中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
经过人工改造
特殊的标记基因 复制原点
启动子 终止子 目的基因插入位点
质粒的组成要素
质粒
02
质粒
粒是基因工程中最常用的载体
01
02
03
04
自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
有一个至多个限制酶切割位点
对受体细胞无害、易分离
具有多种特殊的标记基因
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
供外源DNA片段(基因)插入其中
对受体细胞无害，避免受体细胞受到损伤
便于筛选含有重组DNA分子的细胞
筛选含有重组DNA分子的细胞
抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
特殊的标记基因可以是抗生素抗性基因，也可以是荧光蛋白基因
筛选含有重组DNA分子的细胞
四环素
抗性基因
青霉素
抗性基因
选择抗青霉素不抗四环素的工程菌
加青霉素
0加四环素
影印培养法
典型例题
【例1】表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法错误的是（ ）
A.一个图1所示的质粒分子经Smal切割
后，含有4个游离的磷酸基团
B.用图1中的质粒和图2中的目的基因
构建重组质粒，不能使用Smal切割
C.图2中为防止酶切后单个含目的基因
的DNA片段自身连接成环状，不能使用
EcORI
D.若对图中质粒进行改造，插入的Smal酶切位点越多，质粒的热稳定性越高
典型例题
若使用 EcoRⅠ切割对目的基因和质粒进行处理，能产生相同的黏性末端，理论上能构建重组质粒，但是……
理想结果
反向连接
甚至还会出现目的基因、质粒的自身环化的结果
典型例题
【例1】表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法错误的是（ ）
A.一个图1所示的质粒分子经Smal切割
后，含有4个游离的磷酸基团
B.用图1中的质粒和图2中的目的基因
构建重组质粒，不能使用Smal切割
C.图2中为防止酶切后单个含目的基因
的DNA片段自身连接成环状，不能使用
EcORI
D.若对图中质粒进行改造，插入的Smal酶切位点越多，质粒的热稳定性越高
用限制酶切割时需注意的事项
1.获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了 。但是使用该法缺点是容易发生 。
以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因、质粒的自身环化
目的基因与质粒反向连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
2.选择限制酶切割位点的基本原则：
切割目的基因时： 。
切割质粒时： 。
。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
烧脑练习
限制酶 Bam HI Ⅰ EcoR Ⅰ Sau 3A Ⅰ Kpn Ⅰ
识别序列及切割位点 -GGATCC- -GAATTC- -GATC- -GGTACC-
用同尾酶构建载体时，使切割位点的选择范围扩大
典型例题
【例2】（《三维设计》P76.课堂演练4）基因工程中,需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切割位点是-G↓GAIC-,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切割位点是-↓GATC-。根据图示分析下列叙述正确的是（ ）
A.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限
制酶Ⅰ切割
B.用限制酶切割获得目的基因时，有四
个磷酸二酯键被水解
C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端不同
D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞
典型例题
【例3】为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
（1）使用BgI II处理重组质粒，可
以得到 。
A．长度为3300bp的环状DNA
B．长度为3300bp的线形DNA
C．长度为2800bp和500bp的线形DNA
D．长度为2800bp的环状DNA
（2）要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择______________________的培养基。
A
含卡那霉素但不含亮氨酸
典型例题
【例4】某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有2个和2个
B.a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C.a酶与b酶对线性DNA分子的处理必须在细胞中完成
D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序列会明显增多
DNA的粗提取与鉴定
原理一
原理二
原理三
思路
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
DNA的粗提取与鉴定流程图
第一步
第四步
第三步
研磨
加酒精析出
溶解与鉴定
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
将丝状物或沉淀物溶于试管中的NaCl溶液中。然后，向试管中各加入4mL的二苯胺试剂鉴定（注意做对照实验）
第二步
提取上清液
研磨液过滤到烧杯中，置于4℃冰箱中，几分钟后，再取上清液（也可以通过离心处理后再取上清液）
典型例题
【例5】如图是“DNA 的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,下列相关叙述正确的是( )
A.图1中的溶液a是上清液
B.图1所示操作的原理是蛋白质等杂质
能溶于酒精,而DNA不溶
C.图2所示实验操作中有一处明显错误,
可能导致试管2中蓝色变化不明显
D.图2中试管1的作用是证明2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
谢 谢 观 看

展开更多......

收起↑