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第二章 细胞工程
动物细胞工程
选择性必修三
动物细胞融合技术与单克隆抗体
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
正在融合的原生质体
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
去壁
去壁
融合
再生出细胞壁
脱分化
再分化
移栽
植物体细胞杂交技术
温故而知新
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。
实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验
人细胞
鼠细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
细胞融合
正在融合的细胞
37°C
培养40min
细胞融合
实验表明：细胞膜具有流动性
有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交？
1970年，科学家用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质分子，用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质分子，将小鼠细胞和人细胞融合。这两种细胞刚融合时，融合细胞的一半发绿色荧光，另一半发红色荧光。在37℃下经过40min，两种颜色的荧光均匀分布。
小鼠细胞
人细胞
细胞融合
37℃,40min
正常融合的细胞
融合细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图
思考：动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？
无需去除细胞壁；
全能性受限制，不能培育成新的动物个体。
显微镜下的
动物细胞融合
一、动物细胞融合技术
1. 概念：
2. 结果：
3. 原理：细胞膜具有一定的流动性。
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
形成单核的杂交细胞，即融合后形成的杂交细胞是具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
一、动物细胞融合技术
4. 诱导融合的常用方法
（1）物理法：电融合法
（3）生物法：灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有的诱导方法）
（2）化学法：聚乙二醇（PEG）融合法
（3）生物法：
灭活病毒诱导法
①灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
动物细胞融合特有的诱导方法
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（能诱导细胞融合）
（3）生物法：灭活病毒诱导法
动物细胞融合特有的诱导方法
②灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
5. 过程
细胞膜融合
细胞核融合
细胞质融合
一、动物细胞融合技术
形成杂交细胞
灭活病毒诱导细胞融合过程
思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
细胞核融合，即两个或多个细胞核融合为一个细胞核。
6. 动物细胞融合完成的标志：
一、动物细胞融合技术
病毒颗粒
灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面
细胞膜融合
细胞核融合
形成杂交细胞
在病毒的作用下，使细胞互相凝聚
一、动物细胞融合技术
7. 意义：
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。
2016年，《ACS Synthetic Biology》杂志上报道了一个日本科学家团队，他们将拟南芥细胞与人类HT1080细胞融合，杂交细胞中产生出了人类/植物融合染色体，同时还能稳定存活、增殖，进行基因表达的案例。
（1）研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
一、动物细胞融合技术
8. 应用
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
植物体细胞杂交
动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
9. 植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
二、单克隆抗体及其应用
病原体
处理
呈递
辅助性T细胞
结合
记忆B细胞
浆细胞
抗体
第一信号
分裂、分化 并分泌
细胞因子
分裂分化
促进
产生分泌
第二信号
B细胞
抗原呈递细胞
结合
抗体与病原体结合后形成沉淀等，进而被其他免疫细胞吞噬消化。
摄取
知识回顾：抗体的产生
二、单克隆抗体及其应用
早期获得抗体的方法
动物体内
抗原
浆细胞
抗体（血清）
反复
注射
缺点：产量低，纯度低，制备的抗体特异性差。
抗原不纯
抗体不纯
多种
（１）动物体内产生的特异性抗体种类多达百万种；
（２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体。
科学家发现：
单
克隆
抗体
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
需解决问题：
遗憾：
如何解决这一难题？
一个B淋巴细胞
B淋巴细胞群
克隆
二、单克隆抗体及其应用
如何获得大量、单一的抗体？
单一抗体
动物细胞融合
融合细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
二、单克隆抗体及其应用
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
浆细胞
肿瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
米尔斯坦【英国】
科勒【德国】
二、单克隆抗体及其应用
1. 制备单克隆抗体的原理
（1）每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，在体外培养条件下，不能无限增殖。
（2）骨髓瘤细胞能无限增殖，不能产生抗体。
（3）通过动物细胞融合技术将两种细胞融合，得到的融合细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。
骨髓瘤细胞
能无限增殖
能产生抗体
B淋巴细胞
注射特定抗原
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
二、单克隆抗体及其应用
多种杂交细胞
2. 单克隆抗体的制备过程
获得能产生特定抗体的B淋巴细胞
02
杂交瘤细胞（多种）
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
融合的细胞
B细胞
自身融合
未融合的
B淋巴细胞
B瘤
骨髓瘤细胞
自身融合
未融合的
骨髓瘤细胞
2. 单克隆抗体的制备过程
B瘤
B瘤
第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
①筛选杂交瘤细胞，一般用HAT培养基，由次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3种关键成分配制而成。
②哺乳动物细胞中合成DNA途径有两条：
一条是从头合成途径（简称D途径），氨基蝶呤可以阻断细胞利用D途径合成DNA；
一条是补救途径（简称S途径），该途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷用来合成DNA。
第一次筛选获得杂交瘤细胞
③骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。当它处于HAT培养基中，合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断。同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。
④杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用S途径来合成DNA。
第一次筛选获得杂交瘤细胞
细胞合成DNA有D和S两条途径
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能合成DNA，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
B淋巴细胞
合成DNA
S途径
D途径
不能分裂增殖
骨髓瘤细胞
合成DNA
D途径
能无限增殖
一般用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞，其中氨基喋呤阻断D途径。
第一次筛选获得杂交瘤细胞
骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT、TK。
02
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
能分泌专一抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
杂交瘤细胞（多种）
2. 单克隆抗体的制备过程
96孔板
第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞
使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
96孔板培养和筛选
抗体检测原理：
抗原和抗体能够特异性结合
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
2. 单克隆抗体的制备过程
注射到小鼠腹腔
注射抗原
用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞
多种B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合
诱导融合
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长
多轮次的克隆化培养和抗体检测
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
体外培养
注射到腹腔
单克隆抗体
从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体
2. 单克隆抗体的制备过程
脾中产生多种
B淋巴细胞
提取
（产生特定抗体）
给小鼠注射特定抗原
培养小鼠骨髓瘤细胞
（能无限增殖）
骨髓瘤细胞
诱导
融合
多种细胞
第一次筛选
特定的
选择性培养基
只有融合的
杂交瘤细胞
克隆化培养、
抗体检测
第二次筛选
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
注射到
小鼠腹腔
大量单克隆抗体
腹水
培养液
B细胞 瘤细胞
B-B细胞
瘤-瘤细胞
杂交瘤细胞
2. 单克隆抗体的制备过程
获得能产生特定抗体的B淋巴细胞
（1）注射特定抗原的目的是：
2. 单克隆抗体的制备过程
回顾重点
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}项目
第一次筛选
第二次筛选（需多次筛选）
筛选
原因
筛选
目的
筛选出
筛选出 的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞。
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}项目
第一次筛选
第二次筛选（要多次筛选）
筛选
方法
用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
死亡
抗体检测
生长
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
（4）抗体检测
①原理：抗原和抗体能够特异性结合
②技术：抗原-抗体杂交技术
2. 单克隆抗体的制备过程
（6）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞特点：
（3）克隆化培养：由单个细胞分裂增殖获得细胞团的培养过程。
（5）杂交瘤细胞特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体。
既能迅速大量增殖又能产生特异性（专一）抗体，能与特定抗原结合。
（7）获取大量单克隆抗体的方法
Ⅰ. 优点：
Ⅱ. 缺点：规模小，产量少
Ⅰ. 优点：可大规模培养，大量生产
Ⅱ. 缺点：需要人为控制培养条件，成本相对较高
2. 单克隆抗体的制备过程
①腹腔培养
②体外培养
不需培养基，易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
①技术：动物细胞融合、动物细胞培养
2. 单克隆抗体的制备过程
（8）应用到的细胞工程技术及原理
②原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
（1）能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。
（2）可以大量制备。
二、单克隆抗体及其应用
3. 单克隆抗体的优点
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
资料1：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素（HCG），是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。
资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
资料2：
抗体-药物偶联（antibody-drugconjugate，ADC）
通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
抗体
接头
药物
资料2：ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
思考 ? 讨论
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
讨论2： 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
思考 ? 讨论
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
思考 ? 讨论
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高。
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
讨论4：你可以课后搜集资料，单克隆抗体在临床上还有哪些应用？
思考 ? 讨论
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。
①单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。
②在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
（1）广泛用作诊断试剂：例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
结合荧光标记的单克隆抗体药物
结合同位素的单克隆抗体药物
优点：准确、高效、简易、快速。
小结
（2）运载药物（生物导弹）：例如，ADC等。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
①抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
②ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
优点：位置准确、特异性强、灵敏度高。
（3）用于治疗疾病：单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。
二、单克隆抗体技术及其应用
4. 单克隆抗体的应用
优点：位置准确、疗效高、毒副作用小。
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
练习与应用
一、概念检测
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
练习与应用
一、概念检测
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。
练习与应用
二、拓展应用
谢 谢 观 看

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