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第三章 基因工程
基因工程的基本操作程序
选择性必修三
基因工程的基本操作程序
苏云金杆菌内获得Bt抗虫蛋白基因
转入棉花内
获
构
导
检
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
编码区上游
与RNA聚合酶
结合位点
启动子
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
非编码区
编码区
非编码区
原核生物
真核生物
目的基因的筛选与获取
一
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
目的基因
目的基因的筛选与获取
一
1.筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的 和 的基因中进行筛选。
已知结构
功能清晰
(2)实例：
Bt蛋白基因的筛选过程
目的基因的筛选与获取
一
相关信息P77
Bt抗虫蛋白的原理:当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响.
目的基因的筛选与获取
一
2.目的基因的获取方法
①前提: 基因比较小、核普酸序列已知
②方法: 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
（1）人工合成
目的基因的筛选与获取
一
目的基因的mRNA
单链DNA
双链DNA
（即目的基因）
反转录
合成
2.目的基因的获取方法
（1）人工合成
反转录法
根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
结构基因的核苷酸序列
目的基因
化学合成
目的基因的筛选与获取
一
2.目的基因的获取方法
（2）PCR技术
PCR是 的缩写，是一项根据 原理，在
提供参与DNA复制的 与 ，对 进行 的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制的
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
穆里斯等
1985年
全称
原理
操作环境
目的
优点
聚合酶链式反应
DNA半保留复制、DNA的热变性原理
PCR仪，DNA复制的各种组分和条件
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
特异性快速扩增目的基因
①
目的基因的筛选与获取
一
2.目的基因的获取方法
（2）PCR技术
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4中脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的
3'端开始连接脱氧核苷酸
（体外用高温代替）
（dNTP）
（耐高温的DNA聚合酶）
（2种）
DNA复制所需要的条件
目的基因的筛选与获取
一
2.目的基因的获取方法
（2）PCR技术
②PCR条件
DNA模板
4种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA聚合酶
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
PCR仪控制不同的温度
目的基因的筛选与获取
一
目的基因的筛选与获取
一
③PCR反应过程
目的基因DNA 后 ， 与单链相应互补序列结合；然后以 为模板在 作用下进行 ，即将
加到 ，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为 、 、 三步。
由于延伸后得到的 又可以作为下一个循环的 ，因而每次循环后目的基因的量可以增加 ，即成 形式扩增。（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
受热变性
解聚为单链
引物
单链DNA
DNA聚合酶
延伸
4种
脱氧核苷酸
引物的3'端
变性
复性
延伸
产物
模板
一倍
指数
目的基因的筛选与获取
一
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录形成cDNA再扩增
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子;
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
基因表达载体的构建
二
1.目的
获得了足量的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？若这样操作，效果如何？
核心步骤——基因表达载体的构建
目的：确保目的基因在受体细胞 中稳定存在和表达，并且 能遗传给下一代。
基因表达载体的构建
二
2.组成
作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA
终止转录
鉴别和筛选含目的基因的受体细胞
能带着插入的目的基因一起复制
基因操作中使用的外源基因
目的基因：
启动子：
终止子：
标记基因：
复制原点：
酶切位点：
目的基因
启动子
终止子
标记基因
复制原点
1.下面是四种不同质粒的示意图,其中 ori为复制必需的序列,ampr为氨苄青霉素抗性基因,tetr为四环素抗性基因,箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组 DNA的细胞，应选用的质粒是
A
B
C
D
C
2.如图是利用基因工程技术培育转基因植物,生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中 PstI、SmaI、EcoRI、Apal为四种限制酶。下列说法错误的是
A.图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶
B.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C.构建基因表达载体时需要用到限制酶 SmaI
D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
将目的基因导入受体细胞
三
1.转化
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程
2.转化的受体细胞
将目的基因导入受体细胞
三
（1）农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
（1）农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
载体：农杆菌Ti质粒
（1）农杆菌转化法
T-DNA
受体细胞：主要是双子叶植物 和裸子植物
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
（1）农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
Ti质粒
目的基因
基因表达载体
农杆菌
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
新性状
构建
转入
导入
表达
（2）花粉管通道法
将目的基因导入受体细胞
三
①用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
同步P55
目的基因的检测与鉴定
四
类型 检测内容 方法 结果显示
分子水平 的检测 目的基因是否插入 转基因生物的DNA上 PCR技术或 DNA分子杂交技术 是否成功显示出杂交带
目的基因是否 转录出mRNA PCR技术或 核酸分子杂交技术 目的基因是否 翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交 个体生物学 水平的鉴定 是否具有抗性 及抗性程度 抗性接种实验 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性
产品的功能活性是否相同 比较功能活性
DNA片段的扩增及电泳鉴定
五
1.实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR扩增DNA片段还利用了半保留复制的原理。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
五
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，
这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
②PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。（主要考虑分子量）
④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
1.琼脂糖凝胶电泳是分子实验室中常用的分离DNA的方法
2.核酸为两性电解质，其等电点为pH2~2.5，在常规的pH约8.5的电泳缓冲液中，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动
3.线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。这样就可以将不同分子量大小的DNA片段分离开
DNA片段的扩增及电泳鉴定
五
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
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