资源简介

(共25张PPT)
第1节重组DNA技术的
基本工具
第二课时
本节聚焦
1、重组DNA技术所需的三种基本工具是什么 它们的作用分别是什么
2、基因工程载体需要具备什么条件
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
为什么需要载体？直接将目的基因导入受体细胞可以吗？
不行
第一：外源基因不能自己进入细胞，需要载体帮忙。
第二：即便能直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在，需要载体帮忙。
第三：载体带有标记基因（如抗生素抗性基因），可以帮助科学家找到成功接收外源基因的细胞。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用：
2.种类：
质粒:
动植物病毒:
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入动植物细胞
将外源基因导入大肠杆菌等细胞
噬菌体:
（1）将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
在细胞中自主复制
整合至受体DNA上，随受体DNA同步复制。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：对受体细胞无害。
问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
供外源基因插入其中
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等或者荧光蛋白基因
3.运载体需具备的条件：
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
4.最常用的载体——质粒：
质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
01
经过人工改造
特殊的标记基因、复制原点、启动子、终止子、目的基因插入位点
质粒的组成要素
02
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒
含目的基因的DNA片段
重组质粒
受体细胞
导入
目的基因
分析1：质粒一定能成功导入受体细胞吗？
答案：不一定能成功导入,成功率不高。因此需要筛选出导入目的基因的受体细胞。
【模拟】载体将外源基因送入受体细胞的过程
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
拓展延伸：标记基因的筛选原理
【注意】抗生素抗性基因≠抗生素基因
如何筛选出含质粒(载体)的受体细胞？
思考
提示：质粒(载体)上的标记基因一般是 ，
而受体细胞本身 抵抗该抗生素的能力。
用含有 的培养基培养受体细胞，能够生存的是 。
某种抗生素的抗性基因
没有
该抗生素
被导入了载体的受体细胞
03
在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因的受体细胞吗？为什么？
思考
提示： ；原因：
导入 的和导入 的受体细胞均能在该培养基中存活。
不一定
空载体
含目的基因载体
①空载体
(含抗性基因的质粒)
氨苄青霉素抗性基因
②含目的基因载体
(含抗性基因和
目的基因的质粒)
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
拓展延伸：标记基因的筛选原理
2016课标I卷40
影印接种法
（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）
甲培养基中加入 ，
乙培养基中加入 。
氨苄青霉素
四环素
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
问题: 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
探究 活动 P73思考讨论 重组DNA分子的模拟操作
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
问题: 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
问题: 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
探究 活动 P73思考讨论 重组DNA分子的模拟操作
图甲中抗病基因是我们所需的目的基因，图乙中阴影部分表示质粒的抗性基因。图上箭头和横线代表酶切位点，若要将目的基因切割，并连在图乙的质粒上，应选择怎样的酶切割？
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。
产生相同末端，便于连接。
问题：目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？
用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
目的基因与目的基因相连
质粒与质粒相连
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
正向连接
反向连接
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
正向连接
反向连接
转录方向
转录方向
模板链
模板链
反向连接将导致最终基因不表达或错误表达！
小结
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了：
。但是使用该法缺点是容易发生
以及 ，
为了避免上述情况发生，可采取的措施是
。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶（双酶切法）去切割目的基因和运载体
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
小结
不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
(2)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
③切割目的基因和质粒时： 。
理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接
最好选用不同的限制酶切割
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
DNA的粗提取与鉴定
实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
思考：1、从哪里提取DNA？
2、如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？
细胞
细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。
DNA不溶于酒精溶液
但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液
在一定温度下（沸水浴）， DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA（蛋白质不溶）
鉴定 DNA
1、实验原理
DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菜花和猪肝等。
(1)选材：
(2)试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
2、材料用具
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
思考：猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
限制酶
作用部位：
种类
E.coli DNA连接酶
运载
工具
条件
③ 有一个至多个限制酶切割位点
质粒、噬菌体、动植物病毒
DNA连
接酶
作用部位：
切开DNA分子的磷酸二酯键
来源：
主要存在于原核生物中
特点：
具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）
T4 DNA连接酶
① 对受体细胞无害
② 能自我复制或整合到宿主DNA上。
④ 常有特殊的标记基因
种类：
磷酸二酯键
作用结果：
产生黏性末端或平末端
课堂小结
一.概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶.下列相关叙述正确的是 ( )
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
练习与应用
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
一.概念检测
练习与应用
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
一.拓展与应用
练习与应用
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
一.拓展与应用
练习与应用

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