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第55讲　微生物的培养技术及应用
(时间:30分钟　满分:36分)
基础强化练
选择题:1~6题,每题2分。
1.(微生物纯培养与计数|2024·柳州模拟)某兴趣小组拟检测某品牌冰淇淋中的大肠杆菌数量是否超标。下列叙述正确的是(　　)
[A] 在实验前,应将微生物培养的器皿、接种工具、操作者的手等进行灭菌
[B] 制作大肠杆菌培养基时,一般需将培养基pH调至酸性
[C] 用稀释涂布平板法进行微生物活菌计数时,结果往往比实际值低
[D] 培养基中可加入刚果红对大肠杆菌菌落进行鉴定
2.(微生物分离与计数|2024·赣州二模)硝化细菌在观赏鱼类养殖中发挥着重要的作用,鱼类的排泄物和未吃完的食物会转变成氨和亚硝酸,而硝化细菌可以利用氧化氨和亚硝酸时释放的能量合成有机物。若要对鱼缸中的硝化细菌进行分离和计数,下列有关叙述错误的是(　　)
[A] 可以从观赏鱼类生长良好的鱼缸中进行取样
[B] 筛选硝化细菌的培养基中不需要添加有机碳源
[C] 可用接种环连续划线、逐步稀释,进行纯化和计数
[D] 计数时每隔24 h统计一次,待菌落数目稳定时记录结果
3.(教材基础实验步骤|2024·泉州模拟)同学甲利用含抗生素的滤纸片进行“探究抗生素对细菌的选择作用”实验(实验1),同学乙利用尿素作为氮源进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验(实验2)。下列相关叙述正确的是(　　)
[A] 实验1所用的培养基为选择培养基
[B] 实验1用接种环将菌液接种到固体培养基表面
[C] 实验2取土样前要对铁铲和取样纸袋灭菌处理
[D] 实验2得到的菌落形状、大小和颜色等特征均相同
4.(微生物纯培养|2024·龙岩期末)为得到耐高盐乳酸菌菌种,某同学取泡菜汁样品在培养基上划线接种,培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
[A] 泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
[B] 培养基灭菌后,需要调至适宜乳酸菌生长的pH
[C] 倒平板后需间歇晃动,以保证表面平整
[D] 鉴定细菌种类时,除形态学鉴定外,还可借助生物化学的方法
5.(微生物的选择培养|2024·雅安模拟)稻瘟菌引起的水稻稻瘟病是危害严重的真菌病害之一。土壤中某些微生物能合成并分泌几丁质酶,能抑制稻瘟菌的生长,可用于稻瘟病的防治。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株,通过微生物培养获得几丁质酶。下列说法错误的是(　　)
[A] 筛选土壤中目的微生物时需用以几丁质为唯一碳源的培养基
[B] 纯化培养时,可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种
[C] 在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落均能分泌几丁质酶
[D] 可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株
6.(筛选耐高温的芽孢杆菌|2025·长春一模)芽孢杆菌耐高温,是常见的蛋白酶生产菌。培养基中的蛋白质被蛋白酶降解后,会在菌落周围形成透明圈。如图是筛选蛋白酶高产菌株的过程。下列叙述错误的是(　　)
[A] 70~80 ℃水浴10 min的目的是杀死部分非芽孢杆菌
[B] 在酒精灯火焰旁将样品用无菌水稀释并涂布接种
[C] 以奶粉为唯一氮源的培养基能起到选择作用
[D] 透明圈与菌落直径比值较小的菌株为高产菌株
能力提升练
选择题:7~9题,每题4分。
7.(新情境·污水处理与微生物筛选|2024·合肥三模)某化工厂排出的污水中存在一种有害的难降解的有机化合物X,科研人员设计了如图所示的实验方案以筛选出能高效降解该物质的细菌,从而用于净化污水、保护环境。下列有关分析错误的是(　　)
[A] 实验中需使用物质X作唯一碳源的选择培养基,并应逐步提高其浓度
[B] 振荡培养可以增加培养液的氧气含量,并使培养液与微生物充分接触
[C] 若要研究目的菌的生长规律,应进行液体培养并用细菌计数板计数
[D] 若已筛选出能高效降解物质X的细菌,则可立即用于环境保护实践
8.(高产菌种筛选|2024·鸡西模拟)L天冬酰胺酶由细菌和真菌合成,可分解天冬酰胺释放出氨,然后与奈斯勒试剂反应呈棕色。为筛选获得L天冬酰胺酶高产菌株,某研究小组用含有牛肉膏、蛋白胨、水、NaCl、奈斯勒试剂等成分的培养基进行实验。实验结果如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
[A] 该培养基中含有凝固剂,接种时采用的是稀释涂布平板法
[B] 获得高产L天冬酰胺酶纯培养物的关键是防止杂菌污染
[C] 该培养基属于选择培养基,其中的氮源只有牛肉膏
[D] 应选择菌落c作为高产L天冬酰胺酶菌株进行大量培养
9.(高产菌种筛选|2024·保定二模)纤维素酶能分解秸秆生产酒精,在牛的瘤胃中可以分离纤维素分解菌,相关筛选过程如图1所示。已知刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物,将分离出来的菌落在刚果红培养基平板上进行筛选,筛选结果如图2所示。下列叙述错误的是(　　)
[A] 该过程分离出来的纤维素分解菌为厌氧菌,因此培养基表面加入一层石蜡
[B] 甲、乙、丙培养基都是选择培养基,以纤维素作为唯一碳源
[C] 透明圈出现的原因是纤维素被分解,菌落周围不能形成红色复合物
[D] 菌落②的纤维素分解菌比菌落①③的更适用于生产实践
10.(12分)(水体微生物数量测定|2024·成都模拟)为调查某地人工湖的水质状况,科研小组进行了该湖水样中的细菌培养、分离及计数等工作。回答下列问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　　　　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是　 　。
(2)通常采用　　　法检测水样中细菌含量。在接种前应随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间,这样做的目的是　　　　。
(3)在进行样品稀释时,取10 g水样,加　 　　稀释得到10倍稀释液,再从中吸取　 　　　(填操作过程)得到102倍稀释液,依次类推获得105倍稀释液,在该稀释液倍数下,取3个平板分别接种样品溶液0.1 mL,培养一段时间后,平板上长出的菌落数分别是156、178、191,则每克样品中的细菌数量为　　　　　个。
(4)科研人员将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现,振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。主要原因可能是　　　　　 　　　　。(写出2点即可)
第55讲　微生物的培养技术及应用
1.C　在实验前,应将微生物培养的器皿、接种工具等进行灭菌,而操作者的手需要进行消毒处理;在培养细菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性;用稀释涂布平板法进行微生物计数时,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落;培养基中加入刚果红可以筛选纤维素分解菌,对大肠杆菌菌落进行鉴定用伊红—亚甲蓝培养基。
2.C　鱼类生长良好的鱼缸中,氮循环稳定,鱼缸中含有较多的硝化细菌可以及时将鱼的排泄物和多余的饲料分解。因此可以从生长良好的鱼缸中取样来分离硝化细菌;硝化细菌属于自养生物,可以利用空气中的CO2作碳源,无须添加有机碳源;要对鱼缸中的硝化细菌进行分离和计数,需要用稀释涂布平板法,平板划线法不能用于微生物的计数;对菌落进行计数,要连续观察,将菌落数不再增加时的菌落数作为计数结果。
3.C　实验1所用的培养基含牛肉膏、蛋白胨,不含抗生素,为完全培养基;为获得长满菌落的平板,实验1用涂布器将菌液接种到固体培养基表面;为了减少杂菌的污染,取土样用的铁铲和取样纸袋在使用前都要灭菌;土壤中能分解尿素的微生物不止一种,且自生固氮菌也能在平板上生长,故实验2得到的菌落形状、大小和颜色等特征不一定相同。
4.D　图中可以看到获得菌落利用的是平板划线法,平板划线法不需要先将菌液做稀释处理;应先调pH再灭菌,步骤顺序错误;倒平板冷凝过程中,不能晃动,以保证表面平整;不同种类细菌的理化特性一般不同,鉴定细菌种类时,除根据菌落特征进行形态学鉴定外,还可以借助生物化学的方法进行鉴定。
5.C　筛选土壤中目的微生物即降解几丁质的微生物时,应用以几丁质为唯一碳源的培养基进行筛选;纯化培养时,可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种,两种方法均可得到单菌落;在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落不一定都能分泌几丁质酶,可能存在以几丁质的分解产物为碳源的微生物;水解圈是产生几丁质酶的微生物产生相关酶水解几丁质产生的,水解圈直径/菌落直径越大,说明该菌降解几丁质的能力越强,故可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株。
6.D　由题意可知,芽孢杆菌耐高温,70~80 ℃水浴10 min的目的是杀死部分非芽孢杆菌;为防止杂菌污染,需在酒精灯火焰旁将样品用无菌水稀释并涂布接种;奶粉富含蛋白质,以奶粉为唯一氮源的培养基能起到选择作用;透明圈与菌落直径比值越大,说明芽孢杆菌分解蛋白质的能力越强,故透明圈与菌落直径比值较大的菌株为高产菌株。
7.D　实验中需使用物质X作唯一碳源的选择培养基,并应逐步提高其浓度,从而筛选出能高效降解该物质的细菌;振荡培养的主要意义是可以增加培养液的氧气含量,并使培养液与微生物充分接触,有利于需氧型微生物大量繁殖;若要研究目的菌的生长规律,应使用液体培养基,有利于目的菌繁殖和取样,并用细菌计数板计数;若已筛选出能高效降解物质X的细菌,则应该先进行检验、实验,确保安全且功能稳定后再用于环境保护实践。
8.C　从接种结果来看,菌落分布较为均匀,该培养基是固体培养基,含有凝固剂(如琼脂),接种时采用的是稀释涂布平板法;要获得高产L天冬酰胺酶纯培养物的关键是防止杂菌污染;培养基中有奈斯勒试剂,若微生物能产生L天冬酰胺酶则菌落周围会出现棕色圈,因此该培养基从功能来看属于鉴别培养基,其中充当氮源的成分是牛肉膏和蛋白胨;菌落b和菌落c周围棕色圈的直径相同,但菌落c的菌落直径更小,因此菌落c降解天冬酰胺的能力更强,应选择菌落c作为高产L天冬酰胺酶菌株进行大量培养。
9.D　牛的瘤胃内是一个无氧环境,所以要在牛的瘤胃中分离纤维素分解菌,需要创造无氧条件,如在培养基表面加入一层石蜡;甲、乙、丙培养基都是以纤维素作为唯一碳源的选择培养基;依据题意可知,刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物,当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物无法形成,培养基中就会出现以这些菌为中心的透明圈;纤维素分解菌分泌的纤维素酶越多或纤维素酶的活性越高,对纤维素的分解效果越好,以这些菌为中心的透明圈的直径与菌落直径的比值越大,据图比较菌落①的降解能力最强,最适用于生产实践。
10.【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同
(2)稀释涂布平板　检查培养基灭菌是否合格
(3)90 mL无菌水　1 mL注入9 mL无菌水中(其他稀释10倍的操作也可以)　1.75×108
(3分)
(4)振荡培养能提高培养液的溶解氧含量;振荡培养可使菌体与培养液充分接触,高效利用营养物质(3分)
【解析】 (1)葡萄糖只能为细菌提供碳源,硝酸钠为细菌提供无机盐,而蛋白胨既可以为细菌提供碳源,也可以为细菌提供氮源;不同的细菌生长繁殖的最适pH是不同的,因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH。(2)检测水样中细菌含量通常采用稀释涂布平板法,但在接种前应随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间,以检查平板灭菌是否合格。(3)检测水样微生物含量的方法为稀释涂布平板法,稀释的方法为,取10 g水样,加90 mL无菌水稀释得到10倍稀释液,再从中吸取1 mL注入9 mL无菌水中得到102倍稀释液,以此类推。已知稀释倍数为105倍,取3个平板分别接种样品溶液
0.1 mL,培养一段时间后,平板上长出的菌落数分别是156、178、191,则每个平板中的平均菌落数为175个,则每克样品中的细菌数量为175÷0.1×105=1.75×108(个)。(4)振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快,主要原因可能是振荡培养能提高培养液的溶解氧含量;振荡培养可使菌体与培养液充分接触,有利于菌体对营养成分的利用。第55讲　微生物的培养技术及应用
[课标要求]
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。
2.阐明无菌技术是在操作过程中,保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一　微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
[思考] 固体培养基和液体培养基各有什么用途
2.无菌技术
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析。
(2)酵母菌纯培养的操作步骤。
[思考] 平板倒置培养的原因是什么
(3)平板划线法的具体操作。
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P10正文)培养乳酸菌时,除了基本的碳源、氮源、水和无机盐,还需要添加抗生素。(　　)
(2)(选择性必修3 P10相关信息)利用寄生于细菌体内的微生物裂解细菌来净化污水属于生物消毒法。(　　)
(3)(选择性必修3 P11资料卡)超净工作台在使用前进行紫外线照射以杀死物体表面或空气中的微生物。(　　)
(4)(选择性必修3 P12~13探究·实践拓展)用平板划线法接种时,每次划线之前都需蘸取菌液。(　　)
(5)(选择性必修3 P12~13探究·实践)在培养基冷却至50 ℃左右时倒平板后,立即将平板倒过来放置。(　　)
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P12~13探究·实践拓展)平板划线法划线过程中,不能将最后一次的划线与第一次的划线相连,为什么
(2)(选择性必修3 P12~13探究·实践拓展)接种结束后,为什么要将一个未接种的培养基和接种后的培养基放在一起培养
1.几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 N、N等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等 有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白 质等有机物 蛋白质等 有机物
2.常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象。
(2)灭菌方法及适用对象。
3.平板划线操作中几次灼烧接种环的目的
第一次划 线前灼烧 每次划线前灼烧 (第二次及以后) 划线结束后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
能力1　分析培养基的配置及无菌技术,培养理解能力
1.(2024·湖北十堰调研)下表为1 000 mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成。下列叙述错误的是(　　)
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl H2O
含量 5.0 g 10.0 g 5.0 g 定容至 1 000 mL
[A] 蛋白胨为微生物生长提供的主要营养是碳源、氮源和维生素等
[B] 该培养基灭菌可采用高压蒸汽杀死其中所有的微生物
[C] 若用该培养基倒平板,培养基中应加入适量的琼脂
[D] 若用该培养基培养大肠杆菌应将培养基的pH调至酸性
能力2　围绕微生物的纯培养方法及应用,考查综合运用能力
2.(2024·湖南卷,6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
[A] ①②⑤⑥ [B] ③④⑥⑦
[C] ①②⑦⑧ [D] ①③④⑤
考点二　微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作。
取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
(2)涂布平板操作。
3.微生物的数量测定
项目 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的　　　　　　,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的　　　 　,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的　　　　　 　　　　　　 　　　　　,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
计算 方法 在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出　　　 　　　,则每克样品中的菌落数=(C÷V)×M, C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数,V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是　　　　　 不能区分　　　　　
结果 比实际值偏　 比实际值偏 　　　
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理。
(2)操作步骤。
(3)实验结果分析与评价。
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P16思考·讨论)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的pH降低。(　　)
(2)(选择性必修3 P18正文)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时,统计的菌落数就是活菌的实际数。(　　)
(3)(选择性必修3 P18正文)统计菌落数目时为保证结果准确,一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(　　)
(4)(选择性必修3 P18~19探究·实践)在以尿素为唯一氮源的选择培养基上生长的细菌都是尿素分解菌。(　　)
(5)(选择性必修3 P20拓展应用2)刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物,可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。(　　)
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是什么
(2)(选择性必修3 P18正文拓展)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法
(3)(选择性必修3 P18~19探究·实践拓展)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因有哪些
1.选择培养基的四种制作方法
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)。
(2)改变培养基的营养成分。
(3)利用培养基“特定化学成分”分离。
(4)通过某些“特殊环境”分离。
2.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
能力3　围绕新情境中微生物的选择培养,考查获取信息能力
3.(2023·广东卷,10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断,下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
[A] a点时取样、尿素氮源培养基
[B] b点时取样、角蛋白氮源培养基
[C] b点时取样、蛋白胨氮源培养基
[D] c点时取样、角蛋白氮源培养基
4.(2024·云南昆明模拟)纤维素分解菌能利用分泌的纤维素酶将纤维素分解成葡萄糖并吸收利用。纤维素能与刚果红(一种染料)形成红色复合物,而纤维素分解后则不再形成复合物,从而出现以菌落为中心的透明圈。将不能直接吸收纤维素的甲、乙两种异养菌分别等量接种在两个相同的刚果红培养基中,甲菌落周围出现透明圈,乙菌落周围没有透明圈。下列相关叙述错误的是(　　)
[A] 该刚果红培养基可用来比较纤维素分解菌的分解能力
[B] 初步判断甲菌属于纤维素分解菌
[C] 配制该刚果红培养基时要加入琼脂
[D] 该刚果红培养基以纤维素为唯一碳源
能力4　围绕微生物的分离与计数,培养综合运用能力和实验探究能力
5.(2024·贵州凯里模拟)某研究小组从树林中多年落叶形成的腐殖土壤中分离纤维素分解菌并测定其含量,对土样进行稀释的流程如图所示。摇匀d试管,从d试管中取0.1 mL菌液进行接种,在适宜条件下培养一段时间,测得平板中的平均菌落数为34。下列有关说法正确的是(　　)
[A] 所用的培养基为选择培养基,由琼脂、水和纤维素组成
[B] 每克土样中纤维素分解菌的数量至少是3.4×106个
[C] 采土工具、接种工具、培养基和培养皿可采用干热灭菌法灭菌
[D] 还需设置一个未接种的空白培养基同时培养,以检验灭菌是否彻底
理解计数时设置对照和重复的目的
比较 项目 对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响
实例 空白对照:确定培养基制作是否合格 同一稀释度涂布至少3个平板
考向一　从科学思维角度,考查微生物培养的基本技术
1.(2023·山东卷,15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
[A] 不含氮源的平板不能用于微生物培养
[B] 平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
[C] 接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
[D] 利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
2.(2023·辽宁卷,9)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度(菌落数/m3)。下列叙述错误的是(　　)
[A] 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
[B] 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
[C] 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
[D] 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
考向二　从科学探究角度,考查微生物的分离与计数
3.(2024·黑吉辽卷,19改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是(　　)
[A] 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从未感病植株上采集样品
[B] 将采集的样品充分消毒后,用蒸馏水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测
[C] 将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
[D] 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
4.(2024·全国甲卷,37)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果,结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量,发现测得的细菌数量前者大于后者,其原因是
　　　　　　　　　　。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,再从稀释菌液中取200 μL涂布平板,菌落计数的结果为100,据此推算细菌原液中细菌浓度为
　　　　个/mL。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是
　, 冷却的目的是　
。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是　　　　,判断依据是　
　。(答出两点即可)
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈　　　　色。
第55讲　微生物的培养技术及应用
考点一　微生物的基本培养技术
必备知识·梳理
1.氮源　无机盐　液体培养基　鉴别培养基　pH、特殊营养物质和氧气
[思考] 固体培养基常用于微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种;液体培养基常用于工业生产、微生物的扩大培养。
2.杂菌污染　所有的微生物　巴氏消毒法　湿热灭菌　灼烧灭菌
3.(1)固体培养基　一定形态结构　(2)湿热灭菌　干热灭菌
平板划线法　倒置　未接种
[思考] 平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,既可避免培养基表面的水分过快地挥发,又可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(3)火焰　试管口　打开一条缝隙　从第一次划线的末端　与第一次的划线相连
深挖教材
1.(1)×　抗生素会杀死乳酸菌,培养乳酸菌时需要添加维生素。
(2)√　(3)√
(4)×　除第一次划线外,其他各次划线之前不需要蘸取菌液,菌种来源于上一次所划线的末端。
(5)×　倒平板后应等待培养基冷却凝固,再将培养皿倒过来放置。
2.(1)平板划线法通过依次在上一次划线末端再次划线达到菌种稀释,获得单菌落的目的。若将最后一次的划线与第一次的划线相连则无法达到这一目的。
(2)培养未接种培养基的作用是做对照,未接种的培养基经过培养后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,若有菌落形成,说明培养基灭菌不彻底,或培养基被污染了,需要重新制备。
关键能力·提升
能力1
1.D　蛋白胨中含有多种有机物,可为微生物生长提供的主要营养是碳源、氮源和维生素等;该培养基灭菌可采用高压蒸汽灭菌杀死其中所有的微生物,包括芽孢和孢子;若用该培养基倒平板,培养基中应加入适量的琼脂,作为凝固剂;大肠杆菌属于细菌,因而应将培养基的pH调至中性或弱碱性。
能力2
2.D　由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。
考点二　微生物的选择培养和计数
必备知识·梳理
1.抑制或阻止　尿素　高温
2.(2)培养基　酒精　火焰　冷却　涂布器
3.稀释度足够高时　菌落数　细菌计数板或血细胞计数板　平均值　一个菌落　细胞死活　小　大
4.(1)脲酶　尿素　(2)30~300　稀释涂布平板　温度　时间
稳定　(3)30~300
深挖教材
1.(1)×　培养基中的尿素被分解为氨后,培养基的pH升高。
(2)×　由于两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,所以统计结果小于实际数。
(3)×　一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。
(4)×　自生固氮菌可进行固氮作用,也可在以尿素为唯一氮源的培养基上存活。
(5)√
2.(1)前者常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数;后者可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
(2)由于在所划的线中,一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的单菌落,而其他一些菌落往往由两个或多个细菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个细菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目远低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量。
(3)出现多种菌落的可能原因有培养基制备过程中被杂菌污染;接种过程中,无菌操作不符合要求;系列稀释时,无菌操作不符合要求等。
关键能力·提升
能力3
3.D　研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌,因此既要耐高温,又要能够高效降解角蛋白,所以在c点取样,并且用角蛋白氮源培养基进行筛选培养。
4.D　由题意可知,纤维素能与刚果红形成红色复合物,而纤维素分解后则会出现以菌落为中心的透明圈,透明圈越大,说明纤维素被分解的越多,故该刚果红培养基可用来比较纤维素分解菌的分解能力;纤维素分解后则不再与刚果红形成红色复合物,从而出现以菌落为中心的透明圈,甲菌落周围出现透明圈,初步判断甲菌属于纤维素分解菌;微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长,可以形成肉眼可见的菌落,该实验需要观察菌落,故配制该刚果红培养基时要加入琼脂;该实验培养乙菌可以长出菌落,但乙菌落周围却没有透明圈,说明乙菌不能分解纤维素,但利用其他碳源生长,故使用的刚果红培养基不是以纤维素为唯一碳源。
能力4
5.D　所用的培养基是以纤维素为唯一碳源的选择培养基, 成分中除了琼脂、水和纤维素外还应该有氮源和无机盐;据图可知,菌液在接种前被稀释了105倍,因此每克土样中纤维素分解菌的数量,应该为34÷0.1×105=3.4×107个;培养基应采用湿热灭菌法不可用干热灭菌法灭菌;为了检验培养基灭菌是否彻底,需设置一个未接种的空白培养基同时培养。
研练真题·感悟高考
考向一
1.D　不含氮源的平板可用于固氮菌的培养;平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中,然后在火焰上灼烧灭菌,这种操作属于灭菌,不属于消毒;使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理,不能直接丢弃,以免污染环境;脲酶可以催化尿素分解,在以尿素为唯一氮源的平板上,能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖,不能合成脲酶的微生物常因缺乏氮源而无法生长,因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。
2.D　为防止杂菌污染,接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌,对实验操作者的双手进行消毒;纯化培养时,为防止污染培养基和水分蒸发,培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养;微生物计数时在同一稀释度下,应至少需要对3个菌落数目在30~300的平板进行计数,以确保实验的准确性;使用稀释涂布平板法对微生物计数,数值往往偏小,原因是两个或多个细胞连在一起时,在平板上只能观察到一个菌落。
考向二
3.B　某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从未感病植株上采集样品;获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,将采集的样品充分消毒后,应用无菌水冲洗;无菌检测合格说明消毒比较彻底,将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法可分离得到内生菌的单菌落;由题图“抗性检测”可知,判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组,对照组病原菌菌斑周围不接种内生菌,实验组在病原菌菌斑周围接种内生菌,然后比较对照组和实验组的病原菌菌斑大小,实验组病原菌菌斑减小说明有抗性效果,且菌斑越小表明内生菌抗性效果越好。
4.【答案】 (1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数,后者存在两个或多个活菌连在一起形成一个菌落的情况且只计数活菌
(2)5 000
(3)杀死涂布器上可能存在的微生物,防止涂布器上可能存在的微生物污染　防止温度过高杀死菌种
(4)A　A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高
(5)黑
【解析】 (1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法只计数活菌数,还可能存在两个或多个活菌形成一个菌落的情况,故前者的数量大于后者。
(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,即稀释了10倍,细菌原液中细菌浓度=(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数=(100÷0.2)×10=5 000个/mL。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物,防止涂布器上可能存在的微生物污染,冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
(4)A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高,因此A消毒液杀菌效果最好。
(5)大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。(共86张PPT)
第55讲
微生物的培养技术及应用
[课标要求]
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。
2.阐明无菌技术是在操作过程中,保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
微生物的基本培养技术
考点一　
1.培养基的配制
氮源
[思考] 固体培养基和液体培养基各有什么用途
【提示】 固体培养基常用于微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种;液体培养基常用于工业生产、微生物的扩大培养。
无机盐
液体培养基
鉴别培养基
pH、特殊营养物质和氧气
2.无菌技术
杂菌污染
所有的微生物
巴氏消毒法
湿热灭菌
灼烧灭菌
固体培养基
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析。
一定形态结构
(2)酵母菌纯培养的操作步骤。
湿热灭菌
干热灭菌
平板划线法
倒置
未接种
[思考] 平板倒置培养的原因是什么
【提示】 平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,既可避免培养基表面的水分过快地挥发,又可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(3)平板划线法的具体操作。
火焰
试管口
打
开一条缝隙
从第一
次划线的末端
与第一次
的划线相连
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P10正文)培养乳酸菌时,除了基本的碳源、氮源、水和无机盐,还需要添加抗生素。(　　)
×
【提示】 抗生素会杀死乳酸菌,培养乳酸菌时需要添加维生素。
(2)(选择性必修3 P10相关信息)利用寄生于细菌体内的微生物裂解细菌来净化污水属于生物消毒法。(　　)
√
(3)(选择性必修3 P11资料卡)超净工作台在使用前进行紫外线照射以杀死物体表面或空气中的微生物。(　　)
(4)(选择性必修3 P12～13探究·实践拓展)用平板划线法接种时,每次划线之前都需蘸取菌液。(　　)
√
【提示】 除第一次划线外,其他各次划线之前不需要蘸取菌液,菌种来源于上一次所划线的末端。
×
(5)(选择性必修3 P12～13探究·实践)在培养基冷却至50 ℃左右时倒平板后,立即将平板倒过来放置。(　　)
×
【提示】 倒平板后应等待培养基冷却凝固,再将培养皿倒过来放置。
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P12～13探究·实践拓展)平板划线法划线过程中,不能将最后一次的划线与第一次的划线相连,为什么
【提示】 平板划线法通过依次在上一次划线末端再次划线达到菌种稀释,获得单菌落的目的。若将最后一次的划线与第一次的划线相连则无法达到这一目的。
(2)(选择性必修3 P12～13探究·实践拓展)接种结束后,为什么要将一个未接种的培养基和接种后的培养基放在一起培养
【提示】 培养未接种培养基的作用是做对照,未接种的培养基经过培养后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,若有菌落形成,说明培养基灭菌不彻底,或培养基被污染了,需要重新制备。
1.几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白 质等有机物 蛋白质等 有机物
2.常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象。
(2)灭菌方法及适用对象。
3.平板划线操作中几次灼烧接种环的目的
第一次划 线前灼烧 每次划线前灼烧 (第二次及以后) 划线结束后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
能力1　分析培养基的配制及无菌技术,培养理解能力
1.(2024·湖北十堰调研)下表为1 000 mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成。下列叙述错误的是(　　)
D
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl H2O
含量 5.0 g 10.0 g 5.0 g 定容至1 000 mL
[A] 蛋白胨为微生物生长提供的主要营养是碳源、氮源和维生素等
[B] 该培养基灭菌可采用高压蒸汽杀死其中所有的微生物
[C] 若用该培养基倒平板,培养基中应加入适量的琼脂
[D] 若用该培养基培养大肠杆菌应将培养基的pH调至酸性
【解析】 蛋白胨中含有多种有机物,可为微生物生长提供的主要营养是碳源、氮源和维生素等;该培养基灭菌可采用高压蒸汽灭菌杀死其中所有的微生物,包括芽孢和孢子;若用该培养基倒平板,培养基中应加入适量的琼脂,作为凝固剂;大肠杆菌属于细菌,因而应将培养基的pH调至中性或弱碱性。
D
能力2　围绕微生物的纯培养方法及应用,考查综合运用能力
2.(2024·湖南卷,6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
[A] ①②⑤⑥ [B] ③④⑥⑦
[C] ①②⑦⑧ [D] ①③④⑤
【解析】 由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。
考点二　
微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
抑制或阻止
尿素
高温
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作。
取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
培养基
(2)涂布平板操作。
酒精
涂布器
火焰
冷却
3.微生物的数量测定
稀释度足够高时
项目 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的 ,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的 ,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的
,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
菌落数
细菌计数板或血细
胞计数板
平均值
计算 方法 在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出 ,则每克样品中的菌落数= (C÷V)×M, C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数,V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×
104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是 不能区分
结果 比实际值偏 比实际值偏
一个菌落
细胞死活
小
大
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理。
脲酶
尿素
(2)操作步骤。
30～
300
稀释涂布平板
温度
时间
稳定
(3)实验结果分析与评价。
30～300
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P16思考·讨论)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的pH降低。(　　)
×
【提示】 培养基中的尿素被分解为氨后,培养基的pH升高。
(2)(选择性必修3 P18正文)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时,统计的菌落数就是活菌的实际数。(　　)
×
【提示】 由于两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,所以统计结果小于实际数。
(3)(选择性必修3 P18正文)统计菌落数目时为保证结果准确,一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(　　)
【提示】一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
×
(4)(选择性必修3 P18～19探究·实践)在以尿素为唯一氮源的选择培养基上生长的细菌都是尿素分解菌。(　　)
×
【提示】 自生固氮菌可进行固氮作用,也可在以尿素为唯一氮源的培养基上存活。
(5)(选择性必修3 P20拓展应用2)刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合
物,可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。(　　)
√
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是
什么
【提示】 前者常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数;后者可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
(2)(选择性必修3 P18正文拓展)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法
【提示】 由于在所划的线中,一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的单菌落,而其他一些菌落往往由两个或多个细菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个细菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目远低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量。
(3)(选择性必修3 P18～19探究·实践拓展)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因有哪些
【提示】 出现多种菌落的可能原因有培养基制备过程中被杂菌污染;接种过程中,无菌操作不符合要求;系列稀释时,无菌操作不符合要求等。
1.选择培养基的四种制作方法
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)。
(2)改变培养基的营养成分。
(3)利用培养基“特定化学成分”分离。
(4)通过某些“特殊环境”分离。
2.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
能力3　围绕新情境中微生物的选择培养,考查获取信息能力
3.(2023·广东卷,10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断,下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
[A] a点时取样、尿素氮源培养基
[B] b点时取样、角蛋白氮源培养基
[C] b点时取样、蛋白胨氮源培养基
[D] c点时取样、角蛋白氮源培养基
D
【解析】 研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌,因此既要耐高温,又要能够高效降解角蛋白,所以在c点取样,并且用角蛋白氮源培养基进行筛选培养。
4.(2024·云南昆明模拟)纤维素分解菌能利用分泌的纤维素酶将纤维素分解成葡萄糖并吸收利用。纤维素能与刚果红(一种染料)形成红色复合物,而纤维素分解后则不再形成复合物,从而出现以菌落为中心的透明圈。将不能直接吸收纤维素的甲、乙两种异养菌分别等量接种在两个相同的刚果红培养基中,甲菌落周围出现透明圈,乙菌落周围没有透明圈。下列相关叙述错误的是(　　)
[A] 该刚果红培养基可用来比较纤维素分解菌的分解能力
[B] 初步判断甲菌属于纤维素分解菌
[C] 配制该刚果红培养基时要加入琼脂
[D] 该刚果红培养基以纤维素为唯一碳源
D
【解析】 由题意可知,纤维素能与刚果红形成红色复合物,而纤维素分解后则会出现以菌落为中心的透明圈,透明圈越大,说明纤维素被分解的越多,故该刚果红培养基可用来比较纤维素分解菌的分解能力;纤维素分解后则不再与刚果红形成红色复合物,从而出现以菌落为中心的透明圈,甲菌落周围出现透明圈,初步判断甲菌属于纤维素分解菌;微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长,可以形成肉眼可见的菌落,该实验需要观察菌落,故配制该刚果红培养基时要加入琼脂;该实验培养乙菌可以长出菌落,但乙菌落周围却没有透明圈,说明乙菌不能分解纤维素,但利用其他碳源生长,故使用的刚果红培养基不是以纤维素为唯一碳源。
能力4　围绕微生物的分离与计数,培养综合运用能力和实验探究能力
5.(2024·贵州凯里模拟)某研究小组从树林中多年落叶形成的腐殖土壤中分离纤维素分解菌并测定其含量,对土样进行稀释的流程如图所示。摇匀d试管,从d试管中取0.1 mL菌液进行接种,在适宜条件下培养一段时间,测得平板中的平均菌落数为34。下列有关说法正确的是(　　)
[A] 所用的培养基为选择培养基,由琼脂、水和纤维素组成
[B] 每克土样中纤维素分解菌的数量至少是3.4×106个
[C] 采土工具、接种工具、培养基和培养皿可采用干热灭菌法灭菌
[D] 还需设置一个未接种的空白培养基同时培养,以检验灭菌是否彻底
D
【解析】 所用的培养基是以纤维素为唯一碳源的选择培养基, 成分中除了琼脂、水和纤维素外还应该有氮源和无机盐;据图可知,菌液在接种前被稀释了105倍,因此每克土样中纤维素分解菌的数量,应该为34÷0.1×105=3.4×
107个;培养基应采用湿热灭菌法不可用干热灭菌法灭菌;为了检验培养基灭菌是否彻底,需设置一个未接种的空白培养基同时培养。
归纳总结
理解计数时设置对照和重复的目的
比较项目 对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响
实例 空白对照:确定培养基制作是否合格 同一稀释度涂布至少3个平板
考向一　从科学思维角度,考查微生物培养的基本技术
1.(2023·山东卷,15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
[A] 不含氮源的平板不能用于微生物培养
[B] 平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
[C] 接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
[D] 利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
研练真题·感悟高考
D
【解析】 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养;平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中,然后在火焰上灼烧灭菌,这种操作属于灭菌,不属于消毒;使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理,不能直接丢弃,以免污染环境;脲酶可以催化尿素分解,在以尿素为唯一氮源的平板上,能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖,不能合成脲酶的微生物常因缺乏氮源而无法生长,因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。
2.(2023·辽宁卷,9)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度(菌落数/m3)。下列叙述错误的是(　　)
[A] 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
[B] 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
[C] 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
[D] 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
D
【解析】 为防止杂菌污染,接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌,对实验操作者的双手进行消毒;纯化培养时,为防止污染培养基和水分蒸发,培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养;微生物计数时在同一稀释度下,应至少需要对3个菌落数目在30～300的平板进行计数,以确保实验的准确性;使用稀释涂布平板法对微生物计数,数值往往偏小,原因是两个或多个细胞连在一起时,在平板上只能观察到一个菌落。
考向二　从科学探究角度,考查微生物的分离与计数
3.(2024·黑吉辽卷,19改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是(　　)
[A] 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从未感病植株上采集样品
[B] 将采集的样品充分消毒后,用蒸馏水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测
[C] 将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
[D] 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
B
【解析】 某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从未感病植株上采集样品;获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,将采集的样品充分消毒后,应用无菌水冲洗;无菌检测合格说明消毒比较彻底,将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法可分离得到内生菌的单菌落;由题图“抗性检测”可知,判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组,对照组病原菌菌斑周围不接种内生菌,实验组在病原菌菌斑周围接种内生菌,然后比较对照组和实验组的病原菌菌斑大小,实验组病原菌菌斑减小说明有抗性效果,且菌斑越小表明内生菌抗性效果越好。
4.(2024·全国甲卷,37)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果,结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量,发现测得的细菌数量前者大于后者,其原因是
　 。
前者微生物分散的活菌和死菌一起计数,后者存在两个或多个活菌连在一起形成一个菌落的情况且只计数活菌
【解析】 (1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法只计数活菌数,还可能存在两个或多个活菌形成一个菌落的情况,故前者的数量大于后者。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,再从稀释菌液中取200 μL涂布平板,菌落计数的结果为100,据此推算细菌原液中细菌浓度为　　　　个/mL。
5 000
【解析】 (2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,即稀释了10倍,细菌原液中细菌浓度=(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数=
(100÷0.2)×10=5 000个/mL。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是 　,
冷却的目的是　 。
杀死涂布器上可能存在的微生物,防止涂布器上可能存在的微生物污染
【解析】 (3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物,防止涂布器上可能存在的微生物污染,冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
防止温度过高杀死菌种
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 　,判断依据是
　 。(答出两点即可)
A
【解析】 (4)A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高,因此A消毒液杀菌效果最好。
A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈　　　　色。
【解析】 (5)大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。
黑
(时间:30分钟　满分:36分)
基础强化练
选择题:1～6题,每题2分。
1.(微生物纯培养与计数|2024·柳州模拟)某兴趣小组拟检测某品牌冰淇淋中的大肠杆菌数量是否超标。下列叙述正确的是(　　)
[A] 在实验前,应将微生物培养的器皿、接种工具、操作者的手等进行灭菌
[B] 制作大肠杆菌培养基时,一般需将培养基pH调至酸性
[C] 用稀释涂布平板法进行微生物活菌计数时,结果往往比实际值低
[D] 培养基中可加入刚果红对大肠杆菌菌落进行鉴定
C
【解析】 在实验前,应将微生物培养的器皿、接种工具等进行灭菌,而操作者的手需要进行消毒处理;在培养细菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性;用稀释涂布平板法进行微生物计数时,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落;培养基中加入刚果红可以筛选纤维素分解菌,对大肠杆菌菌落进行鉴定用伊红—亚甲蓝培养基。
2.(微生物分离与计数|2024·赣州二模)硝化细菌在观赏鱼类养殖中发挥着重要的作用,鱼类的排泄物和未吃完的食物会转变成氨和亚硝酸,而硝化细菌可以利用氧化氨和亚硝酸时释放的能量合成有机物。若要对鱼缸中的硝化细菌进行分离和计数,下列有关叙述错误的是(　　)
[A] 可以从观赏鱼类生长良好的鱼缸中进行取样
[B] 筛选硝化细菌的培养基中不需要添加有机碳源
[C] 可用接种环连续划线、逐步稀释,进行纯化和计数
[D] 计数时每隔24 h统计一次,待菌落数目稳定时记录结果
C
【解析】 鱼类生长良好的鱼缸中,氮循环稳定,鱼缸中含有较多的硝化细菌可以及时将鱼的排泄物和多余的饲料分解。因此可以从生长良好的鱼缸中取样来分离硝化细菌;硝化细菌属于自养生物,可以利用空气中的CO2作碳
源,无须添加有机碳源;要对鱼缸中的硝化细菌进行分离和计数,需要用稀释涂布平板法,平板划线法不能用于微生物的计数;对菌落进行计数,要连续观察,将菌落数不再增加时的菌落数作为计数结果。
3.(教材基础实验步骤|2024·泉州模拟)同学甲利用含抗生素的滤纸片进行“探究抗生素对细菌的选择作用”实验(实验1),同学乙利用尿素作为氮源进行“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验(实验2)。下列相关叙述正确的是
(　　)
[A] 实验1所用的培养基为选择培养基
[B] 实验1用接种环将菌液接种到固体培养基表面
[C] 实验2取土样前要对铁铲和取样纸袋灭菌处理
[D] 实验2得到的菌落形状、大小和颜色等特征均相同
C
【解析】 实验1所用的培养基含牛肉膏、蛋白胨,不含抗生素,为完全培养
基;为获得长满菌落的平板,实验1用涂布器将菌液接种到固体培养基表面;为了减少杂菌的污染,取土样用的铁铲和取样纸袋在使用前都要灭菌;土壤中能分解尿素的微生物不止一种,且自生固氮菌也能在平板上生长,故实验2得到的菌落形状、大小和颜色等特征不一定相同。
4.(微生物纯培养|2024·龙岩期末)为得到耐高盐乳酸菌菌种,某同学取泡菜汁样品在培养基上划线接种,培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
[A] 泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
[B] 培养基灭菌后,需要调至适宜乳酸菌生长的pH
[C] 倒平板后需间歇晃动,以保证表面平整
[D] 鉴定细菌种类时,除形态学鉴定外,还可借助生物化学的方法
D
【解析】 图中可以看到获得菌落利用的是平板划线法,平板划线法不需要先将菌液做稀释处理;应先调pH再灭菌,步骤顺序错误;倒平板冷凝过程中,不能晃动,以保证表面平整;不同种类细菌的理化特性一般不同,鉴定细菌种类时,除根据菌落特征进行形态学鉴定外,还可以借助生物化学的方法进行鉴定。
5.(微生物的选择培养|2024·雅安模拟)稻瘟菌引起的水稻稻瘟病是危害严重的真菌病害之一。土壤中某些微生物能合成并分泌几丁质酶,能抑制稻瘟菌的生长,可用于稻瘟病的防治。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株,通过微生物培养获得几丁质酶。下列说法错误的是(　　)
[A] 筛选土壤中目的微生物时需用以几丁质为唯一碳源的培养基
[B] 纯化培养时,可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种
[C] 在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落均能分泌几丁质酶
[D] 可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株
C
【解析】 筛选土壤中目的微生物即降解几丁质的微生物时,应用以几丁质为唯一碳源的培养基进行筛选;纯化培养时,可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种,两种方法均可得到单菌落;在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落不一定都能分泌几丁质酶,可能存在以几丁质的分解产物为碳源的微生物;水解圈是产生几丁质酶的微生物产生相关酶水解几丁质产生的,水解圈直径/菌落直径越大,说明该菌降解几丁质的能力越强,故可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株。
6.(筛选耐高温的芽孢杆菌|2025·长春一模)芽孢杆菌耐高温,是常见的蛋白酶生产菌。培养基中的蛋白质被蛋白酶降解后,会在菌落周围形成透明圈。如图是筛选蛋白酶高产菌株的过程。下列叙述错误的是(　　)
[A] 70～80 ℃水浴10 min的目的是杀死部分非芽孢杆菌
[B] 在酒精灯火焰旁将样品用无菌水稀释并涂布接种
[C] 以奶粉为唯一氮源的培养基能起到选择作用
[D] 透明圈与菌落直径比值较小的菌株为高产菌株
D
【解析】 由题意可知,芽孢杆菌耐高温,70～80 ℃水浴10 min的目的是杀死部分非芽孢杆菌;为防止杂菌污染,需在酒精灯火焰旁将样品用无菌水稀释并涂布接种;奶粉富含蛋白质,以奶粉为唯一氮源的培养基能起到选择作用;透明圈与菌落直径比值越大,说明芽孢杆菌分解蛋白质的能力越强,故透明圈与菌落直径比值较大的菌株为高产菌株。
选择题:7～9题,每题4分。
7.(新情境·污水处理与微生物筛选|2024·合肥三模)某化工厂排出的污水中存在一种有害的难降解的有机化合物X,科研人员设计了如图所示的实验方案以筛选出能高效降解该物质的细菌,从而用于净化污水、保护环境。下列有关分析错误的是(　　)
[A] 实验中需使用物质X作唯一碳源的选择培养基,并应逐步提高其浓度
[B] 振荡培养可以增加培养液的氧气含量,并使培养液与微生物充分接触
[C] 若要研究目的菌的生长规律,应进行液体培养并用细菌计数板计数
[D] 若已筛选出能高效降解物质X的细菌,则可立即用于环境保护实践
D
能力提升练
【解析】 实验中需使用物质X作唯一碳源的选择培养基,并应逐步提高其浓度,从而筛选出能高效降解该物质的细菌;振荡培养的主要意义是可以增加培养液的氧气含量,并使培养液与微生物充分接触,有利于需氧型微生物大量繁殖;若要研究目的菌的生长规律,应使用液体培养基,有利于目的菌繁殖和取样,并用细菌计数板计数;若已筛选出能高效降解物质X的细菌,则应该先进行检验、实验,确保安全且功能稳定后再用于环境保护实践。
8.(高产菌种筛选|2024·鸡西模拟)L-天冬酰胺酶由细菌和真菌合成,可分解天冬酰胺释放出氨,然后与奈斯勒试剂反应呈棕色。为筛选获得L-天冬酰胺酶高产菌株,某研究小组用含有牛肉膏、蛋白胨、水、NaCl、奈斯勒试剂等成分的培养基进行实验。实验结果如图所示。下列有关叙述错误的是(　 　)
[A] 该培养基中含有凝固剂,接种时采用的是稀释涂布平板法
[B] 获得高产L-天冬酰胺酶纯培养物的关键是防止杂菌污染
[C] 该培养基属于选择培养基,其中的氮源只有牛肉膏
[D] 应选择菌落c作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养
C
【解析】 从接种结果来看,菌落分布较为均匀,该培养基是固体培养基,含有凝固剂(如琼脂),接种时采用的是稀释涂布平板法;要获得高产L-天冬酰胺酶纯培养物的关键是防止杂菌污染;培养基中有奈斯勒试剂,若微生物能产生L-天冬酰胺酶则菌落周围会出现棕色圈,因此该培养基从功能来看属于鉴别培养基,其中充当氮源的成分是牛肉膏和蛋白胨;菌落b和菌落c周围棕色圈的直径相同,但菌落c的菌落直径更小,因此菌落c降解天冬酰胺的能力更强,应选择菌落c作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养。
9.(高产菌种筛选|2024·保定二模)纤维素酶能分解秸秆生产酒精,在牛的瘤胃中可以分离纤维素分解菌,相关筛选过程如图1所示。已知刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物,将分离出来的菌落在刚果红培养基平板上进行筛选,筛选结果如图2所示。下列叙述错误的是(　　)
[A] 该过程分离出来的纤维素分解菌为厌氧菌,因此培养基表面加入一层石蜡
[B] 甲、乙、丙培养基都是选择培养基,以纤维素作为唯一碳源
[C] 透明圈出现的原因是纤维素被分解,菌落周围不能形成红色复合物
[D] 菌落②的纤维素分解菌比菌落①③的更适用于生产实践
D
【解析】 牛的瘤胃内是一个无氧环境,所以要在牛的瘤胃中分离纤维素分解菌,需要创造无氧条件,如在培养基表面加入一层石蜡;甲、乙、丙培养基都是以纤维素作为唯一碳源的选择培养基;依据题意可知,刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物,当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物无法形
成,培养基中就会出现以这些菌为中心的透明圈;纤维素分解菌分泌的纤维素酶越多或纤维素酶的活性越高,对纤维素的分解效果越好,以这些菌为中心的透明圈的直径与菌落直径的比值越大,据图比较菌落①的降解能力最强,最适用于生产实践。
10.(12分)(水体微生物数量测定|2024·成都模拟)为调查某地人工湖的水质状况,科研小组进行了该湖水样中的细菌培养、分离及计数等工作。回答下列问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是　 　。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同
【解析】 (1)葡萄糖只能为细菌提供碳源,硝酸钠为细菌提供无机盐,而蛋白胨既可以为细菌提供碳源,也可以为细菌提供氮源;不同的细菌生长繁殖的最适pH是不同的,因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH。
(2)通常采用　　 　法检测水样中细菌含量。在接种前应随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间,这样做的目的是
　　 　　。
稀释涂布平板
检查培养基灭菌
是否合格
【解析】(2)检测水样中细菌含量通常采用稀释涂布平板法,但在接种前应随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间,以检查平板灭菌是否合格。
(3)在进行样品稀释时,取10 g水样,加　　　 　稀释得到10倍稀释液,再从中吸取　　 　　(填操作过程)得到102倍稀释液,依次类推获得105倍稀释液,在该稀释液倍数下,取3个平板分别接种样品溶液0.1 mL,培养一段时间后,平板上长出的菌落数分别是156、178、191,则每克样品中的细菌数量为　　　　　个。
90 mL无菌水
1 mL注入9 mL无菌水中(其他稀释10倍的操作也可以)
1.75×108
【解析】 (3)检测水样微生物含量的方法为稀释涂布平板法,稀释的方法为,取10 g水样,加90 mL无菌水稀释得到10倍稀释液,再从中吸取1 mL注入
9 mL无菌水中得到102倍稀释液,以此类推。已知稀释倍数为105倍,取3个平板分别接种样品溶液0.1 mL,培养一段时间后,平板上长出的菌落数分别是156、178、191,则每个平板中的平均菌落数为175个,则每克样品中的细菌数量为175÷0.1×105=1.75×108(个)。
(4)科研人员将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现,振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。主要原因可能是
　　　　　　　　 　。(写出2点即可)
振荡培养能提高培养液的溶解氧含量;振荡培养可使菌体与培养液充分接触,高效利用营养物质
【解析】 (4)振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快,主要原因可能是振荡培养能提高培养液的溶解氧含量;振荡培养可使菌体与培养液充分接触,有利于菌体对营养成分的利用。

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