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(共24张PPT)
基因工程专题
限制酶和引物的选择及设计
非转基因抗虫棉
转基因抗虫棉
（使棉铃虫死亡）
1
NE
限制酶的选择
1、基因工程的核心步骤？
基因表达载体的构建
2、基因表达载体的构建大致流程？
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
1、基因工程的核心步骤？
基因表达载体的构建
2、基因表达载体的构建大致流程？
目的基因
3、选择限制酶切割目的基因和载体的原则是什么？
①不能选择目的基因内部的限制酶，而要选择目的基因两侧的酶。
终止子
③不能破坏启动子、终止子、复制原点、标记基因等原件，但不是全部的标记基因的标记基因均不能破坏，至少保留一个标记基因。
②目的基因插入的位置在启动子和终止子之间，所以要选择载体中的启动子和终止子间的限制酶。
1.(2025适应性考试)在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β-半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β-半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题：

（1）使用限制酶_ _____和__ ____对质粒和插入DNA片段进行切割。
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
2、家禽的谷物饲料中富含纤维素，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，降低了家禽对饲料的吸收与利用。乳酸杆菌是动物胃肠道中的优势有益菌之一，枯草芽孢杆菌可产生降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。研究人员将W基因转入乳酸杆菌，规模化生产后将其添加于饲料，以提高家禽的养殖效率。


（1）要在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中的质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙链为转录模板链。②下表是几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。

为获得能正确表达W基因的重组质粒，应选用限制酶___ _______切割图1中的质粒，选用限制酶_ ___________切割图2中含W基因的DNA片段。
MfeI、HindⅢ
EcoRI、HindⅢ
2
TW
引物的选择与设计
① PCR时的一个关键问题就是设计引物，什么是引物？
② 引物的作用？
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
引物与模板结合时有没有特定的位置？
引物1
引物2
引物只能与母链的3’端结合，引导子链从5’端向3’端延伸
引物与模板结合的位置不同扩增的产物也不相同
引物1
引物2
引物3
引物4
引物与模板结合的位置不同扩增的产物也不相同
引物5
引物6
1、对人干扰素基因进行PCR扩增时需要一对引物，应从下图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取__________（填字母）作为引物。
B、C
1、引物需位于目的基因的两侧、且能顺利扩增出目的基因
2、引物只能与母链的3’端结合，引导子链从5’端向3’端延伸
2、PCR需要两种引物，但是引物序列不同是由于__________________________________________________________；
目的基因两端的核苷酸序列不同
【典例2】(2020·北京·高考真题)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④
B
【典例3】(2023·山东25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物____________________。
正连
反连
F2和R1或F1与R2
【典例4】（2020年江苏节选）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。
①③
【典例5】牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的传染病，是全球最重要的牛传染病之一。BVDT中结构蛋白E0和 E2是主要抗原，据此研究者利用基因工程技术研制有关疫苗防控该病。图1表示由E2和E0基因经处理后拼接而成的融合基因,图2表示人工改造的基因表达载体pcDNA3.1质粒的结构,其中 AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，请回答以下问题:
为保证疫苗防护效果，研究人员将E基因和E基因拼接以期表达出E2-E0 融合蛋白，此融合基因转录的模板链是 (填“A链”“B链”或“A链或B链”)。已知 E2 基因A链的起始序列为5-CACTTGGA-3'，在保证融合基因准确扩增的同时使目的基因与pcDNA3.1质粒正确拼接，F 1引物的 端添加合适的限制酶序列，F 1引物的序列应为
B链
5’
5’-AAGCTTCACTTGGA-3’
1、（三省三校二模）低温是限制农作物产量的重要胁迫因子。科学家将寒带植物中的抗寒基因CBFs转移到拟南芥中构建拟南芥耐寒模型，用于植物低温胁迫机制的相关研究。
（1）设计引物克隆目的基因。如图所示应选择引物 对CBFs基因进行克隆，为了后续能将目的基因正确连接到载体上，应在CBFs基因上游引物的5′端添加 （“SphⅠ”或”Sau3A”或“MunⅠ”）识别序列。




（3）根据图示Ti质粒的结构，应选用限制酶 切割Ti质粒，并通过 酶进行连接，连接后导入农杆菌，在培养基中添加 来筛选成功导入质粒的农杆菌。
EcoRⅠ、SphⅠ
DNA连接
MunⅠ
氨苄青霉素
①④
加 油！
我们需要共同努力！

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