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课时分层作业(五十一)
1．A　2．D　3．A　4．C　
5．C　[橄榄油的主要成分是甘油三酯，培养基中的橄榄油可以提供微生物生长所需要的碳源，A正确；两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外，对培养基中的橄榄油进行分解，B正确；图中透明圈大小不仅与酶活性的大小成正比，也和产酶量相关，两菌株中，Y所产脂肪酶活性高，但X的透明圈更大，说明其酶产量更多，故Y不应首选为理想菌株，还应进行多次筛选，C错误；温度或pH会改变酶的活性，若改变温度或pH，菌株X的透明圈可能会小于菌株Y的透明圈，D正确。]
6．ABC　[据图可知，甲培养基中是各种线的分布，故步骤Ⅰ使用的接种方法是平板划线法；微生物分离和培养的关键就是防止杂菌污染，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都需要进行无菌操作，A正确。本实验的目的是探究拮抗细菌是否对番茄枯萎病有良好的抑制效果，故实验组滤纸片用拮抗菌菌液处理，对照组滤纸片用无菌水处理，B正确。由于对照组没有用拮抗菌菌液处理，故培养至对照组枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加拮抗细菌菌液处理组的统计后，开始测量并计算抑制率，C正确。“平板对峙实验”培养后番茄枯萎病菌菌落直径小的细菌为目的菌，因为番茄枯萎病菌菌落直径越小，说明抑制效果越好，D错误。]
7．B　[伊红—亚甲蓝琼脂培养基属于鉴别培养基，A错误；图中滤膜上菌落数目为17个，该图为将待测水样稀释10倍后取100 mL稀释液时的测定结果，因此1 L待测水样中含大肠杆菌约17÷0.1×10＝1 700个，B正确；为减小误差，一般需对实验组菌落数为30～300的平板进行计数并取平均值，C错误；培养基应湿热灭菌，常采用高压蒸汽灭菌法，D错误。]
8．CD　[白地霉属于霉菌，实验中使用的培养基pH呈弱酸性，其中琼脂是凝固剂的一种，不是营养物质，A错误；白地霉的接种采用了涂布平板法，桔梅奇酵母应采用了平板划线法，B错误；由题意可知，随培养基中FeCl3浓度的增加，普切明酸与Fe3+的结合增强，抑菌圈的红色加深，说明白地霉不能利用与普切明酸结合后的铁是出现红色抑菌圈的原因，C正确；普切明酸与Fe3+形成红色复合物，随培养基中FeCl3浓度的增加，抑菌圈变窄，是由于白地霉从培养基中获得了较多的Fe3+，FeCl3能降低桔梅奇酵母对白地霉的防治效果，D正确。]
9．(除标注外，每空2分，共10分)(1)氮源、碳源(1分)　液体(1分)　(2)不含菌体
ZY-17处理后大丽轮枝菌的菌丝块明显小于ZY-109处理组
(3)假设ZY-17通过分泌相关物质抑制大丽轮枝菌。先用培养基分别培养ZY-17和大丽轮枝菌，一段时间后，将ZY-17及其培养基离心后取其上清液(含有ZY-17的分泌物)，用圆形滤纸小片浸入其中，随后将浸有ZY-17的分泌物的圆形滤纸小片接种到含大丽轮枝菌的培养基上，同时以只接种大丽轮枝菌的平板作为对照，置于细菌培养箱，一段时间后观察，若含有圆形滤纸小片的平板上，大丽轮枝菌菌落明显小于对照组，则说明假设成立
1 / 2第51讲　微生物的培养技术及应用
　1．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。　2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。　3．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。　4．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。　5．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点1　微生物的基本培养技术
一、培养基的配制
1．概念：人们按照微生物对____________的不同需求，配制出供其____________的营养基质。
2．种类
3．营养组成
(1)营养组成：水、无机盐、碳源、________。
(2)需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加__________
霉菌 一般将培养基调至______性
细菌 一般将培养基调至______________性
厌氧微生物 提供________的条件
(3)几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 ________ 、等 光能
硝化细菌 ________ NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 ________ 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
1．(人教版选择性必修3 P10旁栏思考)培养基中加入氮源的原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
二、无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
2．关键：________________。
3．目的：____________________________。
4．消毒与灭菌的比较
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的______________ 或生物等方法　 　 杀死物 体表面 或内部 一部分 微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法　 操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法　 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子　　 湿热灭菌法　 培养基、容器等
干热灭菌法　 玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌法　 接种工具等
5．其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与______________接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在______________附近进行。
2．(人教版选择性必修3 P10相关信息)利用某些微生物可以净化污水、污泥，原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
6．酵母菌的纯培养
3．(人教版选择性必修3 P12探究·实践)倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是_________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
1．培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素。 (　　)
2．某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。培养基pH需偏碱性。 (　　)
3．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。 (　　)
4．玻璃器皿、金属用具等可采用干热灭菌法。 (　　)
　微生物的分离和培养是现代生物工程应用中的重要环节。如图是大肠杆菌分离和培养过程中部分操作和实验结果示意图。
(1)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染，对于固体培养基应采用的检测方法是什么？
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)上图中平板划线法的正确操作顺序是　　　　　　　　　　　　　　　(用字母和箭头表示)；找出图中两处错误的操作：　　　　　(用字母表示)。
无菌技术
1．(链接人教版选择性必修3 P11资料卡)高压蒸汽条件下持续20分钟会杀死芽孢，因此无菌操作中可利用非致病性的嗜热脂肪杆菌的芽孢作为指示菌来测定灭菌的效果。灭菌时在高压蒸汽灭菌锅的适当位置放置含有生物指示剂的培养液和含芽孢的菌片。灭菌结束后在塑料瓶外挤破含有培养液的玻璃瓶，使嗜热脂肪杆菌菌片浸没在紫色培养液内并进行培养，如图所示。若芽孢可以生长会使培养液变为黄色。下列叙述错误的是(　　)
A．嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性较强，常用作指示菌来测定灭菌的效果
B．灭菌后含有嗜热脂肪杆菌菌片的紫色培养液属于选择培养基
C．湿热灭菌可利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌
D．若培养液颜色没有变化而阳性对照组颜色为黄色，说明达到灭菌目的
微生物的纯培养
2．(链接人教版选择性必修3 P12探究·实践)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是(　　)
A．①②⑤⑥　　　　　 B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
　　平板划线操作中几次灼烧接种环的目的
项目 第一次划线前灼烧 每次划线前灼烧 划线结束后灼烧
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
考点2　微生物的选择培养和计数
一、选择培养基
二、微生物的选择培养
1．土壤取样
铲取土样，将样品装入纸袋中。
2．等比稀释
将10 g土样加入盛有____________ mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3．涂布平板
4．培养观察
(1)待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入__________ ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
(2)在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的__________。
1．(人教版选择性必修3 P18探究·实践)统计菌落种类和数目时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定。若培养时间不足或培养时间太长，分别会导致的结果是________________________、_____________________________
_____________________________________________________________________。
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的______________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为__________的平板进行计数。
(3)计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为__________、适于计数的平板。在______________下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出__________。
(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计结果一般用__________表示。
2．显微镜直接计数法
(1)计数原理：利用特定的________________或________________，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)统计结果：一般是________数和________数的总和。
(3)优点：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
2．(人教版选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板常用于____________的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于____________的细菌等的计数。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
[深化拓展]
1．选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
2．两种纯化细菌的方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
平板示意图
能否用于计数 不能计数 可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 (　　)
2．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。 (　　)
3．若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和无机盐、淀粉。 (　　)
4．某同学进行分离高产脲酶菌的实验设计时，认为可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌。 (　　)
5．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落。 (　　)
　为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行下图A所示的实验。
(1)步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示，推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是　　　　　　　　　　　。
(3)在进行实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是什么？(答出一项即可)　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是　　　　　　　　　　　　　　　。
微生物的选择培养
1．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P17图1-7)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是(　　)
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
微生物的分离和计数
2．(链接人教版选择性必修3 P20拓展应用T2)刚果红是一种染料，可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二
糖、葡萄糖等发生这种反应。从落叶较多的腐质土取10 g土壤，用无菌水稀释106倍后，取0.1 mL涂布到三个平板中(培养基配方：纤维素钠盐5～10 g、酵母膏1 g、土豆汁100 mL、KH2PO40.25 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL)培养，菌落数目稳定后加入刚果红染色，洗去浮色后对纤维素分解菌进行分离与计数，三个平板菌落数无显著差异，平均值为200个，出现透明圈的菌落数平均值为30。下列叙述正确的是(　　)
A．上述实验中使用的培养基为选择培养基
B．该培养基pH需要调为中性或者弱酸性
C．涂布的0.1 mL培养液中活菌数可能高于200个
D．10 g土样中纤维素分解菌的数目约为3.0×108个
1．(2024·浙江6月卷)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是(　　)
A．镍是组成脲酶的重要元素
B．镍能提高尿素水解反应的活化能
C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
2．(2023·山东卷)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
3．(2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题：
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是____________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
__________________，冷却的目的是________________________。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是______，判断依据是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出两点即可)。
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈__________色。
13 / 14课时分层作业(五十一)　微生物的培养技术及应用
(建议用时：30分钟；本套共9小题，共30分。第1～6小题，每小题2分；第7～8小题，每小题4分；第9小题10分。)
1．(2024·广东名校联盟模拟)固氮微生物可将空气中的氮气(N2)还原为氨，并转化为细胞中的含氮物质，是土壤中氮素的主要来源。表格是一个用于分离培养固氮微生物的培养基配方，其中甘露醇的分子式为C6H14O6，下列叙述中错误的是(　　)
物质名称 C6H14O6 K2HPO4 MgSO4·7H2O NaCl CaSO4·2H2O CaCO3 H2O
含量 20 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.1 g 5 g 1 000 mL
A．甘露醇在培养基中的作用是调节渗透压
B．固氮微生物合成的氨属于初生代谢物
C．对该培养基先调节pH再进行湿热灭菌
D．该培养基为选择培养基，不含凝固剂
2．(2024·广东深圳一模)在“酵母菌纯培养”的实验课中，学生进行平板划线的实践操作。下列叙述错误的是(　　)
A．开始接种前和划线完毕后都要将接种环进行灼烧
B．棉塞拔出后和塞上前装有培养液的试管口都要通过火焰
C．在酒精灯火焰附近用接种环蘸取一环菌液
D．将皿盖完全打开后用接种环在培养基表面连续划线
3．(2024·山东青岛模拟)稀释涂布平板法和稀释倒平板法是分离微生物的两种方法。稀释倒平板法是指将稀释的菌液和琼脂混合，然后将其倒入无菌培养皿中进行培养。下列说法正确的是(　　)
A．培养过程中所用的培养基采用湿热灭菌法灭菌
B．两种方法均可通过统计菌落数实现对活菌的准确计数
C．稀释倒平板法对好氧菌、热敏感菌的分离效果优于稀释涂布平板法
D．为了防止培养基温度过高杀死微生物，应将琼脂冷却至室温后再倒平板
4．(2024·湖南株洲一模)L-天冬酰胺酶由细菌和真菌合成，可分解天冬酰胺释放出氨，然后与奈斯勒试剂反应呈棕色。为筛选获得L-天冬酰胺酶高产菌株，设计了如下固体培养基。固体培养基的主要成分有牛肉膏、蛋白胨、水、NaCl、琼脂、奈斯勒试剂。实验结果如下图。下列叙述错误的是(　　)
A．根据实验结果可知，接种时采用的是稀释涂布平板法
B．应选择菌落C作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养
C．该培养基从功能来看属于选择培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏
D．无菌技术还可以避免操作者被有害微生物感染，实验结束后的培养基不能直接丢弃
5．(2024·江苏扬州模拟)橄榄油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄榄油平板透明圈法”筛选获得两株产脂肪酶的菌株X 和Y, 检测结果如表。下列相关叙述错误的是(　　)
酶活性(U·mL-1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A．培养基中的橄榄油可为微生物生长提供碳源
B．以上两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外
C．两菌株中，Y所产脂肪酶活性高，应首选为理想菌株
D．改变温度或pH，菌株X的透明圈可能会小于菌株Y的透明圈
6．(不定项)(2024·山东济南模拟)研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中分离筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的拮抗细菌。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用甲培养基进行筛选纯化后，将获得的不同菌株分别接种至乙培养基扩大培养，48 h后进行“平板对峙实验”：在丙培养基的空白平板一侧放置一直径为5 mm的番茄枯萎病菌的菌块，在平行另一侧放置相同大小的滤纸片，实验流程如下图。下列说法正确的是(　　)
A．Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法，Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作
B．对照组滤纸片用无菌水处理，实验组滤纸片用拮抗细菌菌液处理
C．应培养至对照组病菌菌落长满丙培养基时开始测量并计算抑制率
D．选择丙培养基上直径大的病菌菌落对应的拮抗细菌作为目的菌
7．(2024·湖北黄冈模拟)测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红—亚甲蓝的固体培养基上长出的菌落呈紫黑色。滤膜法测定大肠杆菌数目的流程如下：用滤膜过滤待测水样或其稀释液→水样或稀释液中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红—亚甲蓝琼脂平板上培养→统计滤膜上菌落数目。下图为将待测水样稀释10倍后取100 mL稀释液时的测定结果。下列相关叙述正确的是(　　)
A．伊红—亚甲蓝琼脂培养基属于选择培养基
B．图中1 L待测水样中含大肠杆菌约1 700个
C．为减小误差，应对所有实验组平板进行计数并取平均值
D．为防止杂菌污染，过滤装置和培养基使用前需干热灭菌
8．(不定项)(2024·山东实验中学模拟)白地霉侵染是导致柑橘酸腐病的主要原因，实验证明桔梅奇酵母对白地霉具有生物防治能力。已知铁是真菌生长的必需元素，是胞内重要酶活性中心的组成部分。普切明酸是桔梅奇酵母产生的一种水溶性铁螯合剂，能快速在培养基中扩散并与其中的Fe3+形成稳定红色复合物。研究配制的含有不同浓度FeCl3的培养基如下表所示。实验结果为桔梅奇酵母菌落周围出现红色抑菌圈，随FeCl3浓度增大，抑菌圈红色加深但变窄，如下图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
成分 MgSO4 NaH2PO4 蛋白胨 FeCl3溶液 水 琼脂
用量 5 g 7 g 15 g 500 mL 7 g 20 g
A．实验中使用的培养基pH呈弱碱性，其中琼脂不是营养物质
B．白地霉采用了平板划线法，桔梅奇酵母采用了涂布平板法
C．白地霉不能利用与普切明酸结合后的铁是出现红色抑菌圈的原因
D．补足Fe3+可以使桔梅奇酵母对白地霉的抑制效果逐渐减弱
1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ＋0.5
9．(10分)(2024·北京房山期末)大丽轮枝菌侵染棉花导致其减产。科学家欲用芽孢杆菌对其进行生物防治。请回答下列问题：
(1)培养基中的蛋白胨可为菌体生长提供______________________和维生素等。将现有的芽孢杆菌ZY-17、ZY-109置于________(填“液体”或“固体”)培养基中进行扩大培养。
(2)在培养基平板中央分别放置大丽轮枝菌的菌丝块，然后在菌丝块对应三角点分别滴加ZY-17和ZY-109的菌液，以接种____________________的培养基为空白对照，进行“平板对峙实验”，结果如图1。
①若在一个平板中完成图1中三组平板对峙实验，请在图2中画出实验方案。
②分析实验结果可知ZY-17的抑菌效果较好，依据是_______________________
_____________________________________________________________________。
(3)为探究ZY-17抑制大丽轮枝菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证：____________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
主要实验材料和设备：ZY-17、大丽轮枝菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
1 / 5第51讲　微生物的培养技术及应用
　1．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。　2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。　3．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。　4．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。　5．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点1　微生物的基本培养技术
一、培养基的配制
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．种类
(1)按物理性质分—
(2)按用途分—
3．营养组成
(1)营养组成：水、无机盐、碳源、氮源。
(2)需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加维生素
霉菌 一般将培养基调至酸性
细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性
厌氧微生物 提供无氧的条件
(3)几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 、等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
1．(人教版选择性必修3 P10旁栏思考)培养基中加入氮源的原因是___________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
二、无菌技术
1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
2．关键：防止杂菌污染。
3．目的：获得纯净的微生物培养物。
4．消毒与灭菌的比较
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 湿热灭菌法 培养基、容器等
干热灭菌法　 玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌法　 接种工具等
5．其他操作
(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
2．(人教版选择性必修3 P10相关信息)利用某些微生物可以净化污水、污泥，原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解
6．酵母菌的纯培养
3．(人教版选择性必修3 P12探究·实践)倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是_________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上，防止培养基水分过快蒸发
1．培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素。 (√)
2．某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。培养基pH需偏碱性。 (×)
提示：乳酸菌经过无氧呼吸产生乳酸，故其生活的环境是酸性，培养基pH需偏酸性。
3．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。 (×)
提示：一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。
4．玻璃器皿、金属用具等可采用干热灭菌法。 (√)
微生物的分离和培养是现代生物工程应用中的重要环节。如图是大肠杆菌分离和培养过程中部分操作和实验结果示意图。
(1)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染，对于固体培养基应采用的检测方法是什么？
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：将未接种的培养基在适宜的条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生
(2)上图中平板划线法的正确操作顺序是________________(用字母和箭头表示)；找出图中两处错误的操作：__________(用字母表示)。
提示：A→B→G→F→E→C→D→H　C、D
无菌技术
1．(链接人教版选择性必修3 P11资料卡)高压蒸汽条件下持续20分钟会杀死芽孢，因此无菌操作中可利用非致病性的嗜热脂肪杆菌的芽孢作为指示菌来测定灭菌的效果。灭菌时在高压蒸汽灭菌锅的适当位置放置含有生物指示剂的培养液和含芽孢的菌片。灭菌结束后在塑料瓶外挤破含有培养液的玻璃瓶，使嗜热脂肪杆菌菌片浸没在紫色培养液内并进行培养，如图所示。若芽孢可以生长会使培养液变为黄色。下列叙述错误的是(　　)
A．嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性较强，常用作指示菌来测定灭菌的效果
B．灭菌后含有嗜热脂肪杆菌菌片的紫色培养液属于选择培养基
C．湿热灭菌可利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌
D．若培养液颜色没有变化而阳性对照组颜色为黄色，说明达到灭菌目的
B　[芽孢是细菌的休眠体，芽孢壁厚，含水量极低，代谢缓慢，抗逆性强，嗜热脂肪杆菌的芽孢耐热性较普通杂菌强，若嗜热脂肪杆菌的芽孢死亡可说明其他杂菌也已死亡，可用作指示菌来测定灭菌的效果，A正确；灭菌后含有嗜热脂肪杆菌菌片的紫色培养液用于鉴别嗜热脂肪杆菌是否存活，因此属于鉴别培养基，B错误；湿热灭菌是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，C正确；阳性对照组颜色为黄色，说明存在有活性芽孢，灭菌后培养液颜色没有变化说明芽孢不能生长，即说明达到灭菌目的，D正确。]
微生物的纯培养
2．(链接人教版选择性必修3 P12探究·实践)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是(　　)
A．①②⑤⑥　　　　　 B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
D　[由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。]
　　平板划线操作中几次灼烧接种环的目的
项目 第一次划线前灼烧 每次划线前灼烧 划线结束后灼烧
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
(教师用书独具)
(不定项)(链接人教版选择性必修3 P14拓展应用T2)为研究酵母菌种群数量的变化，某兴趣小组将酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，转速分别为210 r/min、230 r/min、250 r/min，培养时间与酵母菌种群密度的关系如图所示。下列有关分析正确的是(　　)
A．接种酵母菌前，需对培养基进行湿热灭菌
B．可以采用抽样检测的方法对锥形瓶中酵母菌数量进行计数
C．8 d后，250 r/min组酵母菌的数量开始下降，可能与代谢物积累及培养液的pH下降有关
D．该实验可说明溶氧量和空间是限制酵母菌种群数量持续增长的影响因素
ABC　[对培养基可进行湿热灭菌，对一些需要保持干燥的器皿则常用干热灭菌，故接种酵母菌前，需对培养基进行湿热灭菌，A正确；可以采用抽样检测的方法对锥形瓶中酵母菌数量进行计数，B正确；酵母菌在有氧条件下呼吸产生二氧化碳和水，在无氧条件下呼吸产生酒精和二氧化碳，二氧化碳溶于水，会使培养液的pH下降，故8 d后250 r/min组酵母菌的数量开始下降，可能与代谢物积累及培养液的pH降低有关，C正确；转速会影响锥形瓶中的溶氧量、营养物质与酵母菌的接触，但没有明确信息表明空间限制了酵母菌种群数量的增长，D错误。]
考点2　微生物的选择培养和计数
一、选择培养基
二、微生物的选择培养
1．土壤取样
铲取土样，将样品装入纸袋中。
2．等比稀释
将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3．涂布平板
4．培养观察
(1)待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
(2)在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
1．(人教版选择性必修3 P18探究·实践)统计菌落种类和数目时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定。若培养时间不足或培养时间太长，分别会导致的结果是________________________、_____________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：遗漏菌落的种类和数目　菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败，菌落特征不易观察
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
(3)计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计结果一般用菌落数表示。
2．显微镜直接计数法
(1)计数原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)统计结果：一般是活菌数和死菌数的总和。
(3)优点：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
2．(人教版选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板常用于____________的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于____________的细菌等的计数。
提示：相对较大　相对较小
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
[深化拓展]
1．选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
2．两种纯化细菌的方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
平板示意图
能否用于计数 不能计数 可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 (×)
提示：选择培养基可以筛选分离出某种微生物。
2．血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。 (×)
提示：血细胞计数板适用于真菌的计数，细菌计数板用于细菌的数量测定等。
3．若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和无机盐、淀粉。 (√)
4．某同学进行分离高产脲酶菌的实验设计时，认为可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌。 (×)
提示：产脲酶菌不能分解酚红指示剂。
5．为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落。 (×)
提示：土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落。
为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行下图A所示的实验。
(1)步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是____________________________
_____________________________________________________________________。
提示：③的培养基中石油是唯一碳源
(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示，推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是_______________。
提示：接种时涂布不均匀
(3)在进行实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是什么？(答出一项即可)
_____________________________________________________________________。
提示：培养基被杂菌污染
(4)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是_______________。
提示：筛选出分解石油能力最好的细菌
微生物的选择培养
1．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P17图1-7)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是(　　)
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
CD　[据题干信息可知，某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；据题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；据题图可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。]
微生物的分离和计数
2．(链接人教版选择性必修3 P20拓展应用T2)刚果红是一种染料，可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。从落叶较多的腐质土取10 g土壤，用无菌水稀释106倍后，取0.1 mL涂布到三个平板中(培养基配方：纤维素钠盐5～10 g、酵母膏1 g、土豆汁100 mL、KH2PO4 0.25 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL)培养，菌落数目稳定后加入刚果红染色，洗去浮色后对纤维素分解菌进行分离与计数，三个平板菌落数无显著差异，平均值为200个，出现透明圈的菌落数平均值为30。下列叙述正确的是(　　)
A．上述实验中使用的培养基为选择培养基
B．该培养基pH需要调为中性或者弱酸性
C．涂布的0.1 mL培养液中活菌数可能高于200个
D．10 g土样中纤维素分解菌的数目约为3.0×108个
C　[要从土壤中将纤维素分解菌分离出来，应该将它们接种在以纤维素为唯一碳源的选择培养基上，根据题述实验中培养基的成分可知，该培养基不属于选择培养基，应该属于鉴别培养基，A错误；该培养基pH需要调为中性或者弱碱性，用以培养细菌，B错误；涂布的0.1 mL培养液中活菌数可能高于200个，因为记数的菌落中可能含有由聚集在一起的两个或两个以上的细胞长成的菌落，C正确；三个平板菌落的平均值为200个，其中出现透明圈的菌落数平均值为30，即有30个纤维素分解菌，则10 g土样中纤维素分解菌的数目约为30÷0.1×106×10＝3.0×109个，D错误。]
1．(2024·浙江6月卷)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是(　　)
A．镍是组成脲酶的重要元素
B．镍能提高尿素水解反应的活化能
C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
B　[根据题意可知，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，B错误；产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长繁殖，C正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。]
2．(2023·山东卷)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
D　[不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。]
3．(2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题：
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是_____________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
__________________，冷却的目的是________________________。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是______，判断依据是_____________________________________________________________________
______________________________________________________(答出两点即可)。
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈__________色。
[解析]　(1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1 mL细菌原液中细菌浓度＝菌落数÷菌液体积×稀释倍数＝100÷0.2×10＝5 000个/mL。(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。(4)A消毒液活细菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。(5)大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈(紫)黑色。
[答案]　(1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌　(2)5 000　(3)杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染　防止温度过高杀死菌种　(4)A　A消毒液活细菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高
(5)(紫)黑
课时分层作业(五十一)　微生物的培养技术及应用
1．(2024·广东名校联盟模拟)固氮微生物可将空气中的氮气(N2)还原为氨，并转化为细胞中的含氮物质，是土壤中氮素的主要来源。表格是一个用于分离培养固氮微生物的培养基配方，其中甘露醇的分子式为C6H14O6，下列叙述中错误的是(　　)
A．甘露醇在培养基中的作用是调节渗透压
B．固氮微生物合成的氨属于初生代谢物
C．对该培养基先调节pH再进行湿热灭菌
D．该培养基为选择培养基，不含凝固剂
A　[甘露醇主要为该培养基提供碳源，A错误；固氮微生物合成的氨是固氮微生物生长所必需的，属于初生代谢物，B正确；为了防止调节pH过程中的杂菌污染，一般先调pH再进行湿热灭菌，C正确；分析培养基成分可知，培养基中没有氮源，不能够固氮的微生物在该培养基上不能生长，因此该培养基为选择培养基，没有加入琼脂，不含凝固剂，D正确。]
2．(2024·广东深圳一模)在“酵母菌纯培养”的实验课中，学生进行平板划线的实践操作。下列叙述错误的是(　　)
A．开始接种前和划线完毕后都要将接种环进行灼烧
B．棉塞拔出后和塞上前装有培养液的试管口都要通过火焰
C．在酒精灯火焰附近用接种环蘸取一环菌液
D．将皿盖完全打开后用接种环在培养基表面连续划线
D　[接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧灭菌，并需要在酒精灯火焰旁冷却才能接种，划线完毕后要将接种环进行灼烧，以防止杂菌污染，A正确；棉塞拔出后和塞上前装有培养液的试管口都要通过火焰，B正确；酒精灯火焰旁存在无菌区域，在酒精灯火焰附近用接种环蘸取一环菌液，C正确；划线操作时，为了防止杂菌污染，培养皿皿盖不能完全打开，只能打开一条缝隙，操作时需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯火焰旁存在无菌区域，D错误。]
3．(2024·山东青岛模拟)稀释涂布平板法和稀释倒平板法是分离微生物的两种方法。稀释倒平板法是指将稀释的菌液和琼脂混合，然后将其倒入无菌培养皿中进行培养。下列说法正确的是(　　)
A．培养过程中所用的培养基采用湿热灭菌法灭菌
B．两种方法均可通过统计菌落数实现对活菌的准确计数
C．稀释倒平板法对好氧菌、热敏感菌的分离效果优于稀释涂布平板法
D．为了防止培养基温度过高杀死微生物，应将琼脂冷却至室温后再倒平板
A　[为了防止杂菌污染，培养过程中所用的培养基采用湿热灭菌法灭菌，A正确；稀释涂布平板法和稀释倒平板法都不能通过统计菌落数实现对活菌的准确计数，B错误；稀释倒平板法是指将稀释的菌液和琼脂混合，然后将其倒入无菌培养皿中进行培养，琼脂可以隔绝空气，但不能及时散热，因此稀释涂布平板法对好氧菌、热敏感菌的分离效果优于稀释倒平板法，C错误；倒平板操作中需要将培养基冷却到50 ℃左右时进行，D错误。]
4．(2024·湖南株洲一模)L-天冬酰胺酶由细菌和真菌合成，可分解天冬酰胺释放出氨，然后与奈斯勒试剂反应呈棕色。为筛选获得L-天冬酰胺酶高产菌株，设计了如下固体培养基。固体培养基的主要成分有牛肉膏、蛋白胨、水、NaCl、琼脂、奈斯勒试剂。实验结果如下图。下列叙述错误的是(　　)
A．根据实验结果可知，接种时采用的是稀释涂布平板法
B．应选择菌落C作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养
C．该培养基从功能来看属于选择培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏
D．无菌技术还可以避免操作者被有害微生物感染，实验结束后的培养基不能直接丢弃
C　[从接种结果来看，菌落分布较为均匀，应该采用的是稀释涂布平板法，A正确；菌落B和菌落C周围棕色圈的直径相同，但C的菌落直径更小，因此菌落C的单个细胞产生的L-天冬酰胺酶更多，应选择菌落C作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养，B正确；培养基中有奈斯勒试剂，若微生物能产生L-天冬酰胺酶则菌落周围会出现棕色圈，因此该培养基从功能来看属于鉴别培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏和蛋白胨，C错误；实验结束后为避免环境污染，培养基在丢弃前要进行灭菌处理，D正确。]
5．(2024·江苏扬州模拟)橄榄油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄榄油平板透明圈法”筛选获得两株产脂肪酶的菌株X 和Y, 检测结果如表。下列相关叙述错误的是(　　)
酶活性(U·mL-1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A．培养基中的橄榄油可为微生物生长提供碳源
B．以上两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外
C．两菌株中，Y所产脂肪酶活性高，应首选为理想菌株
D．改变温度或pH，菌株X的透明圈可能会小于菌株Y的透明圈
C　[橄榄油的主要成分是甘油三酯，培养基中的橄榄油可以提供微生物生长所需要的碳源，A正确；两株菌株均可将脂肪酶分泌至细胞外，对培养基中的橄榄油进行分解，B正确；图中透明圈大小不仅与酶活性的大小成正比，也和产酶量相关，两菌株中，Y所产脂肪酶活性高，但X的透明圈更大，说明其酶产量更多，故Y不应首选为理想菌株，还应进行多次筛选，C错误；温度或pH会改变酶的活性，若改变温度或pH，菌株X的透明圈可能会小于菌株Y的透明圈，D正确。]
6．(不定项)(2024·山东济南模拟)研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中分离筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的拮抗细菌。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用甲培养基进行筛选纯化后，将获得的不同菌株分别接种至乙培养基扩大培养，48 h后进行“平板对峙实验”：在丙培养基的空白平板一侧放置一直径为5 mm的番茄枯萎病菌的菌块，在平行另一侧放置相同大小的滤纸片，实验流程如下图。下列说法正确的是(　　)
A．Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法，Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作
B．对照组滤纸片用无菌水处理，实验组滤纸片用拮抗细菌菌液处理
C．应培养至对照组病菌菌落长满丙培养基时开始测量并计算抑制率
D．选择丙培养基上直径大的病菌菌落对应的拮抗细菌作为目的菌
ABC　[据图可知，甲培养基中是各种线的分布，故步骤Ⅰ使用的接种方法是平板划线法；微生物分离和培养的关键就是防止杂菌污染，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都需要进行无菌操作，A正确。本实验的目的是探究拮抗细菌是否对番茄枯萎病有良好的抑制效果，故实验组滤纸片用拮抗菌菌液处理，对照组滤纸片用无菌水处理，B正确。由于对照组没有用拮抗菌菌液处理，故培养至对照组枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加拮抗细菌菌液处理组的统计后，开始测量并计算抑制率，C正确。“平板对峙实验”培养后番茄枯萎病菌菌落直径小的细菌为目的菌，因为番茄枯萎病菌菌落直径越小，说明抑制效果越好，D错误。]
7．(2024·湖北黄冈模拟)测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红—亚甲蓝的固体培养基上长出的菌落呈紫黑色。滤膜法测定大肠杆菌数目的流程如下：用滤膜过滤待测水样或其稀释液→水样或稀释液中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红—亚甲蓝琼脂平板上培养→统计滤膜上菌落数目。下图为将待测水样稀释10倍后取100 mL稀释液时的测定结果。下列相关叙述正确的是(　　)
A．伊红—亚甲蓝琼脂培养基属于选择培养基
B．图中1 L待测水样中含大肠杆菌约1 700个
C．为减小误差，应对所有实验组平板进行计数并取平均值
D．为防止杂菌污染，过滤装置和培养基使用前需干热灭菌
B　[伊红—亚甲蓝琼脂培养基属于鉴别培养基，A错误；图中滤膜上菌落数目为17个，该图为将待测水样稀释10倍后取100 mL稀释液时的测定结果，因此1 L待测水样中含大肠杆菌约17÷0.1×10＝1 700个，B正确；为减小误差，一般需对实验组菌落数为30～300的平板进行计数并取平均值，C错误；培养基应湿热灭菌，常采用高压蒸汽灭菌法，D错误。]
8．(不定项)(2024·山东实验中学模拟)白地霉侵染是导致柑橘酸腐病的主要原因，实验证明桔梅奇酵母对白地霉具有生物防治能力。已知铁是真菌生长的必需元素，是胞内重要酶活性中心的组成部分。普切明酸是桔梅奇酵母产生的一种水溶性铁螯合剂，能快速在培养基中扩散并与其中的Fe3+形成稳定红色复合物。研究配制的含有不同浓度FeCl3的培养基如下表所示。实验结果为桔梅奇酵母菌落周围出现红色抑菌圈，随FeCl3浓度增大，抑菌圈红色加深但变窄，如下图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
成分 MgSO4 NaH2PO4 蛋白胨 FeCl3溶液 水 琼脂
用量 5 g 7 g 15 g 500 mL 7 g 20 g
A．实验中使用的培养基pH呈弱碱性，其中琼脂不是营养物质
B．白地霉采用了平板划线法，桔梅奇酵母采用了涂布平板法
C．白地霉不能利用与普切明酸结合后的铁是出现红色抑菌圈的原因
D．补足Fe3+可以使桔梅奇酵母对白地霉的抑制效果逐渐减弱
CD　[白地霉属于霉菌，实验中使用的培养基pH呈弱酸性，其中琼脂是凝固剂的一种，不是营养物质，A错误；白地霉的接种采用了涂布平板法，桔梅奇酵母应采用了平板划线法，B错误；由题意可知，随培养基中FeCl3浓度的增加，普切明酸与Fe3+的结合增强，抑菌圈的红色加深，说明白地霉不能利用与普切明酸结合后的铁是出现红色抑菌圈的原因，C正确；普切明酸与Fe3+形成红色复合物，随培养基中FeCl3浓度的增加，抑菌圈变窄，是由于白地霉从培养基中获得了较多的Fe3+，FeCl3能降低桔梅奇酵母对白地霉的防治效果，D正确。]
9．(10分)(2024·北京房山期末)大丽轮枝菌侵染棉花导致其减产。科学家欲用芽孢杆菌对其进行生物防治。请回答下列问题：
(1)培养基中的蛋白胨可为菌体生长提供______________________和维生素等。将现有的芽孢杆菌ZY-17、ZY-109置于________(填“液体”或“固体”)培养基中进行扩大培养。
(2)在培养基平板中央分别放置大丽轮枝菌的菌丝块，然后在菌丝块对应三角点分别滴加ZY-17和ZY-109的菌液，以接种____________________的培养基为空白对照，进行“平板对峙实验”，结果如图1。
①若在一个平板中完成图1中三组平板对峙实验，请在图2中画出实验方案。
②分析实验结果可知ZY-17的抑菌效果较好，依据是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)为探究ZY-17抑制大丽轮枝菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证：
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主要实验材料和设备：ZY-17、大丽轮枝菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
[解析]　(1)蛋白胨可为菌体生长提供氮源、碳源、维生素等营养；菌体扩大培养一般用液体培养基，有利于菌体与培养基充分接触。(2)ZY-17和ZY-109的菌液中除菌体外为培养基，应以接种不含菌体的培养基为空白对照。①若在一个平板中完成图1中三组平板对峙实验，则可在培养基平板中央放置大丽轮枝菌的菌丝块，然后分别在对应三角点分别滴加ZY-17和ZY-109的菌液以及不含菌体的培养基，其接种图示见答案所示。②由图可知，ZY-17处理后大丽轮枝菌的菌丝块明显小于ZY-109处理组，说明ZY-17的抑菌效果较好。(3)为探究ZY-17抑制大丽轮枝菌的方式，可假设ZY-17通过分泌相关物质抑制大丽轮枝菌。先用培养基分别培养ZY-17和大丽轮枝菌，一段时间后，将ZY-17及其培养基离心后取其上清液(含有ZY-17的分泌物)，用圆形滤纸小片浸入其中，随后将浸有ZY-17的分泌物的圆形滤纸小片接种到含大丽轮枝菌的培养基上，同时以只接种大丽轮枝菌的平板作为对照，置于细菌培养箱，一段时间后观察，若含有圆形滤纸小片的平板上，大丽轮枝菌菌落明显小于对照组，则说明假设成立。
[答案]　(除标注外，每空2分，共10分)(1)氮源、碳源(1分)　液体(1分)　(2)不含菌体
ZY-17处理后大丽轮枝菌的菌丝块明显小于ZY-109处理组　(3)假设ZY-17通过分泌相关物质抑制大丽轮枝菌。先用培养基分别培养ZY-17和大丽轮枝菌，一段时间后，将ZY-17及其培养基离心后取其上清液(含有ZY-17的分泌物)，用圆形滤纸小片浸入其中，随后将浸有ZY-17的分泌物的圆形滤纸小片接种到含大丽轮枝菌的培养基上，同时以只接种大丽轮枝菌的平板作为对照，置于细菌培养箱，一段时间后观察，若含有圆形滤纸小片的平板上，大丽轮枝菌菌落明显小于对照组，则说明假设成立
(教师用书独具)
1．(2024·湖北模拟)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型菌株由于发生基因突变而无法合成某种氨基酸只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，数字代表培养基，A、B、C表示操作步骤。下列有关说法正确的是(　　)
A．①②为完全培养基，③④为基本培养基
B．A操作的目的是提高突变菌株的浓度
C．B操作可用涂布器蘸取菌液均匀地涂布在②表面
D．经C过程影印及培养后，可从④培养基中挑取E菌落进行纯化培养
B　[由图可知，①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；紫外线可用于诱导突变，提高突变的频率，A操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；B操作是先将菌液滴加到培养基的表面，再用涂布器均匀地涂布在②表面，C错误；D菌落在基本培养基中无法生长，而在完全培养基上能够生长，这说明D菌落是氨基酸营养缺陷型菌株，故经C过程影印及培养后，可从④培养基中挑取D菌落进行纯化培养，D错误。]
2．(2024·江苏泰州一模)某种物质A(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个。相关叙述正确的是(　　)
A．实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
B．乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照
C．③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂布于平板上
D．若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105
D　[实验时，要从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株，则①为淤泥取样进行稀释，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，淤泥中有菌种，因此不能进行灭菌处理，A错误；乙为固体培养基，需要加琼脂和物质A等，为了提高准确度，实验需设平行重复实验，且需要另外设置空白对照，检测培养基配制是否合格，B错误；③接种方法为稀释涂布平板法，接种工具是涂布器，但是不能用涂布器蘸取菌液，应该将菌液用微量移液管加入培养基中，用涂布器进行均匀涂抹，C错误；若乙平板上长出的菌落数平均为240个，假设稀释倍数为a，根据摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个，在每个平板上涂布0.1 mL稀释后的菌液，则有240×a÷0.1＝2.4×108，则稀释倍数a＝105，D正确。]
3．(不定项)(2024·江苏盐城模拟)农杆菌是植物基因工程中常用到的一种细菌，下表为用来培养农杆菌的LB培养基配方，下图是对培养的农杆菌进行菌落计数。下列相关叙述错误的有(　　)
胰蛋白胨 10.0 g
酵母浸粉 5.0 g
NaCl 10.0 g
蒸馏水 1 L
配制完成后，将pH调至7.0
A．图中培养农杆菌所用的培养基都是固体培养基
B．b、c、d中接种农杆菌的常用工具是涂布器
C．LB培养基中胰蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源
D．若b、c、d中菌落数分别为48、57、60，则在a中农杆菌的密度约为5.5×105个/mL
AD　[图中a培养基为液体培养基，A错误；b、c、d使用的接种方法为稀释涂布平板法，所用的接种工具为涂布器，B正确；微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，该培养基中胰蛋白胨和酵母浸粉可以给农杆菌提供碳源和氮源，C正确；图中细菌稀释了106倍，若b、c、d中菌落数分别为48、57、60，则在a中农杆菌的密度约为(48＋57＋60)÷3÷1×106＝5.5×107个/mL，D错误。]
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