资源简介 课时分层作业(五十五) 重组DNA技术的基本工具(建议用时：40分钟；本套共9小题，共30分。第1～6小题，每小题2分；第7～8小题，每小题4分；第9小题10分。)1．(2024·山东模拟)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是( )A．该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系C．用T4 DNA连接酶或E．coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子2．(2024·重庆高三联考)Cre酶是一种重组酶，LoxP 是能被 Cre酶识别的特异DNA 序列。Cre/LoxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。一般而言，当一条 DNA 链上存在两个相同的 LoxP 序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的 DNA 序列，如图所示。下列说法正确的是( )A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开B．无 Cre酶存在的细胞因 STOP 的作用而无法发出荧光C．当有两个相同的 LoxP 序列时 Cre酶就能有效切除一个D．启动子能启动绿色荧光基因翻译荧光蛋白的过程3．(2024·湖北武汉期末)某植物的野生型和突变型植株杂交，F1均为野生型，F1自交所得F2中绝大部分植株与野生型相似(包括野生型、介于野生型与突变型之间的“过渡类型”)，以＋表示，少部分植株与突变型相似，以P表示。研究发现，两表型相关基因的碱基序列一致，长度均为2.4 kb，将此片段用限制酶PstⅠ完全酶切结果如下图。下列叙述错误的是( )A．据题意推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感B．2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物C．图2中P的①②位点可能均发生了甲基化D．该植株的表观遗传现象是可以稳定遗传的4．(2024·辽宁部分学校模拟)为了提高构建基因表达载体的效率，通常会运用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，图1、图2表示含有目的基因的DNA片段和质粒上限制酶的识别位点，表中为各种限制酶的识别序列和切割位点。同尾酶是指它们切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制酶。下列叙述错误的是( )限制酶种类 BamHⅠ BclⅠ HindⅢ EcoRⅠ识别序列及切割位点A．对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和HindⅢ进行切割以获取目的基因B．BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位点不同C．图中启动子的作用是作为DNA 聚合酶识别和结合部位D．将该重组质粒导入动物细胞常用显微注射法5．(2024·山东淄博一模)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验， 下列说法错误的是( )A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止 DNA降解B．DNA 既溶于2 mol/L NaCl 溶液也溶于蒸馏水C．粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质D．将粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂DNA被染成蓝色6．(不定项)(2024·黑龙江齐齐哈尔二模)图甲为某种棉花的酶D基因及拟南芥叶绿体膜上的转运肽基因，图乙为Ti质粒。为增加油菜种子的含油量，可将酶D基因与转运肽基因相连，导入油菜叶片细胞并获得高产转基因油菜品种。下列叙述正确的是( )A．用限制酶ClaⅠ和DNA连接酶处理图甲两种基因后，可使A、D端相连B．图乙的Ti质粒被限制酶切割一次后，会产生4个游离的磷酸基团C．将目的基因插入图乙T-DNA中构建重组质粒，其可能在农杆菌中表达D．将农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到的即为高产转基因油菜7．(2024·北京模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是( )A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功8．(不定项)(2024·吉林长春模拟)“DNA粗提取与鉴定”的操作步骤为研磨→去杂→析出→鉴定。某研究组欲探究不同去杂方法对实验结果的影响(如下表)。下列叙述正确的是( )去杂质 方式 沉淀质 量(g) DNA浓度 (ng·μL-1) OD260/ OD280 二苯胺 鉴定离心 0.0680 81.50 1.53 蓝色4 ℃冰箱静置 0.1028 336.4 1.41 蓝色注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度；纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。A．猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA的材料B．对研磨液进行离心的目的是加速DNA的沉淀C．离心法可以获得更高纯度的DNAD．析出时的离心转速明显高于去杂质时1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ＋0.59．(10分)(2024·黑龙江模拟)蓝色妖姬属于最名贵的玫瑰，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家通过图1从链霉菌中获取激活基因(sfp)，其中①、②、③、④为引物，获取的sfp基因经限制酶PmeⅠ、BamHⅠ切割后能与Ti质粒形成重组质粒；通过图2在限制酶SpeⅠ、SacⅠ、BcLⅠ、BamHⅠ的切割下获取靛蓝合成酶基因(idgS)、并能与Ti质粒形成重组质粒；通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。(提示：基因sfp和idgS表达的方向如图)结合相关知识回答下列问题：(1)通过图1获取目的基因(sfp)的方法是__________，选用的引物是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)基因sfp和基因idgS应分别导入Ti质粒的________和________位置，并说明原因：____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)通过图1获取的目的基因能被限制酶SacⅠ、BeLⅠ、BamHⅠ识别和切割，结合图3应选用______________限制酶切割，并说明选用的原因：______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)通过图2和图3构建基因表达载体时应选用_______________限制酶切割，并说明选用的原因：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(5)将目的基因导入受体白玫瑰细胞，待细胞再生成植株，开出的花朵却不变蓝，可能的原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。1 / 6第55讲 重组DNA技术的基本工具 1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2．实验：DNA的粗提取与鉴定。考点1 重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念二、基因工程的诞生和发展1．肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。2．DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。3．中心法则的确立。4．遗传密码的破译。5．基因转移载体的发现。限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。6．DNA体外重组的实现。7．重组DNA表达实验的成功。8．DNA测序和合成技术的发明。9．PCR技术的发明。10．基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。三、重组DNA技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)1．(人教版选择性必修3 P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。提示：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害2．(人教版选择性必修3 P71正文)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接2．DNA连接酶3．载体3．(人教版选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于__________________________________________________________________________________________________________________________。提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上4．(人教版选择性必修3 P73正文)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害[深化拓展]限制酶的选择要求1．位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。2．酶切要求(1)单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。(2)双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。3．数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。4．特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。1．基因工程的原理是基因重组，此变异是不定向的。 (×)提示：此变异是定向的。2．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 (×)提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。3．限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000。 (√)4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 (√)5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (√)我国科学家将蓝细菌ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA，然后将重组DNA与Ti质粒构建成表达载体，再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中，最终成功获得了转ictB基因水稻，提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图所示。(1)为使重组DNA分子能定向插入Ti质粒的相应区段中，可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端、N端添加的限制酶识别序列分别是_______。提示：BglⅠ、EcoRⅤ(2)经过酶切的重组DNA分子和 Ti质粒进行连接时，可选用_________________(填“E．coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。提示：T4 DNA连接酶(3)在ictB基因表达载体的构建中不宜选用Ti质粒作为载体，原因是________________________________________________________________________________。提示：质粒大，难以进行插入外源基因的构建，以及酶切位点受限基因工程工具酶的应用1．(链接人教版选择性必修3 P71图3-3)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5′-G↓GATCC-3′、5′↓GATC-3′、5′-CCC↓GGG-3′。下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是( )A．若用SmaⅠ完全切割该DNA，则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bpB．若虚线方框内的碱基对被T－A替换，则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段C．若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA，可形成相同的黏性末端D．用SmaⅠ切割DNA产生的片段，不能用E．coli DNA连接酶重新将其连接C [限制酶SmaⅠ的酶切位点是5′-CCC↓GGG-3′，在图中有两个限制酶SmaⅠ的酶切位点，DNA将被切割成三个片段，结合图解，三个片段的长度分别是637 bp、890 bp、761 bp，A错误；发生碱基对替换后，基因中只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点，用SmaⅠ完全切割后出现长度分别是634＋896－3＝1 527 bp、761 bp的两种片段，B错误；由题可知，MboⅠ和BamHⅠ识别序列的中间序列相同，因此若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA，可形成相同的黏性末端，C正确；用SmaⅠ切割DNA产生的是平末端，E．coli DNA连接酶能连接平末端，只是连接效率远低于T4 DNA连接酶，D错误。]2．(链接人教版选择性必修3 P75拓展应用T2)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是( )A．可以避免质粒或者目的基因自身环化B．可以避免目的基因与质粒反向连接C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因D．可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来D [两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免质粒或者目的基因自身环化，也不能避免目的基因与质粒反向连接，A、B错误；两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因，C错误；若质粒EcoRⅠ酶切位点处与目的基因MfeⅠ酶切处连接，质粒MfeⅠ酶切位点处与目的基因EcoRⅠ酶切处连接，则正好将目的基因正向连接，这样的重组质粒，既无EcoRⅠ识别位点，又无MfeⅠ识别位点，相当于将基因“焊死”在质粒上，故可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来，D正确。]基因工程载体的应用3．(链接人教版选择性必修3 P72图3-4、正文)如图为外源DNA、大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是________________(写中文名称)，________________________________________，构成人类的胰岛素基因和质粒的基本骨架。(2)将人的胰岛素基因导入质粒构建基因表达载体时，所需的酶是______________________________________________________________；基因表达载体应具有的基本条件有__________________________________(答2点)。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为____________，其作用是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)将剪切后的人胰岛素基因和剪切后的质粒混合进行连接反应，得到重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用________处理，使其能吸收周围的DNA。[解析] (1)a表示大肠杆菌拟核中的大型环状DNA，质粒是大肠杆菌细胞中的小型环状DNA，二者都是脱氧核糖核酸。人类的胰岛素基因和质粒都是DNA，磷酸和脱氧核糖交替连接，排列在外侧，构成DNA的基本骨架。(2)构建基因表达载体时，需要将目的基因和质粒进行切割，需要用到限制性内切核酸酶，同时需要将二者进行连接，需要用到DNA连接酶；基因表达载体应具备的基本条件有能自我复制、具有标记基因、具有启动子和终止子等。(3)氨苄青霉素抗性基因是质粒DNA上的标记基因，用于鉴定目的基因(或重组质粒)是否导入受体细胞。(4)将目的基因导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用Ca2+处理，使得大肠杆菌细胞处于感受态，便于周围DNA进入细胞。[答案] (1)脱氧核糖核酸 磷酸和脱氧核糖交替连接，排列在外侧 (2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶 能自我复制、具有标记基因、具有启动子和终止子等 (3)标记基因 用于鉴定目的基因(或重组质粒)是否导入受体细胞 (4)Ca2+考点2 DNA的粗提取与鉴定一、实验原理二、实验步骤1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。1．(链接人教版选择性必修3 P75图示信息)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是( )A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNAD．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化D [动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。]2．(链接人教版选择性必修3 P74－75探究·实践)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰A [在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。]1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )A．限制酶失活，更换新的限制酶B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，需更换正常质粒DNAD．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]2．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质D [研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，无法检测蛋白质，D错误。]3．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建基因表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列基因表达载体构建方案合理且效率最高的是( )A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E．coli DNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coli DNA连接酶连接C [酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此基因表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]4．(2023·广东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色D [裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水中加热五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。]课时分层作业(五十五) 重组DNA技术的基本工具1．(2024·山东模拟)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是( )A．该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系C．用T4 DNA连接酶或E．coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子D [该DNA分子经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了三个DNA片段且两个切口形成的黏性末端不同，说明该DNA分子含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点；质粒为环状DNA，其经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了两个DNA片段，观察两个切口形成的黏性末端，可推出质粒含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点，A正确。根据图中黏性末端可知，酶M和酶N识别的序列可能是或，但无法确定其对应关系，B正确。片段乙和片段丁黏性末端互补，用T4 DNA连接酶或E．coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来，C正确。片段乙、片段丁、片段戊三个片段不能连接成环状DNA分子，D错误。]2．(2024·重庆高三联考)Cre酶是一种重组酶，LoxP 是能被 Cre酶识别的特异DNA 序列。Cre/LoxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。一般而言，当一条 DNA 链上存在两个相同的 LoxP 序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的 DNA 序列，如图所示。下列说法正确的是( )A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开B．无 Cre酶存在的细胞因 STOP 的作用而无法发出荧光C．当有两个相同的 LoxP 序列时 Cre酶就能有效切除一个D．启动子能启动绿色荧光基因翻译荧光蛋白的过程B [结合题意可知，Cre酶能将特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A错误；题意显示，当一条 DNA 链上存在两个相同的 LoxP 序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的 DNA 序列，包括其中的一个LoxP，图中的STOP会被切除，若无 Cre酶存在，则图中STOP 的作用会导致荧光蛋白基因不能表达，进而无法发出荧光，B正确，C错误；启动子能启动绿色荧光基因的转录过程，D错误。]3．(2024·湖北武汉期末)某植物的野生型和突变型植株杂交，F1均为野生型，F1自交所得F2中绝大部分植株与野生型相似(包括野生型、介于野生型与突变型之间的“过渡类型”)，以＋表示，少部分植株与突变型相似，以P表示。研究发现，两表型相关基因的碱基序列一致，长度均为2.4 kb，将此片段用限制酶PstⅠ完全酶切结果如下图。下列叙述错误的是( )A．据题意推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感B．2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物C．图2中P的①②位点可能均发生了甲基化D．该植株的表观遗传现象是可以稳定遗传的D [据题意可知突变型基因序列不能被限制酶PstⅠ酶切，由此推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感，A正确；据题图可知，野生型基因序列酶切产物是1.5 kb和0.7 kb，因此2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物，B正确；突变型基因序列不能够被限制酶PstⅠ酶切，图2中P的①②位点可能均发生了甲基化，C正确；根据题意无法判断该植株的表观遗传现象是可以稳定遗传的，D错误。]4．(2024·辽宁部分学校模拟)为了提高构建基因表达载体的效率，通常会运用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，图1、图2表示含有目的基因的DNA片段和质粒上限制酶的识别位点，表中为各种限制酶的识别序列和切割位点。同尾酶是指它们切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制酶。下列叙述错误的是( )A．对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和HindⅢ进行切割以获取目的基因B．BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位点不同C．图中启动子的作用是作为DNA 聚合酶识别和结合部位D．将该重组质粒导入动物细胞常用显微注射法C [由图1可知，目的基因的内部有BclⅠ和EcoRⅠ这两种限制酶的切割位点，对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和HindⅢ进行切割以获取目的基因，A正确；由表格可知，BamHⅠ和BclⅠ切割形成的黏性末端相同，BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位点不同，BamHⅠ识别的序列为-GGATCC-，切割位点在GG之间，BclⅠ识别的序列为-TGATCA-，切割位点在TG之间，B正确；启动子的作用是作为RNA 聚合酶识别和结合部位，是转录的起点，C错误；将重组质粒导入动物细胞常用的方法为显微注射法，D正确。]5．(2024·山东淄博一模)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验， 下列说法错误的是( )A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止 DNA降解B．DNA 既溶于2 mol/L NaCl 溶液也溶于蒸馏水C．粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质D．将粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂DNA被染成蓝色D [低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水，且溶解度较高，B正确；粗提取的DNA中含有核蛋白、多糖等杂质，因此为了获得纯度较高的DNA需要进一步提纯，C正确；将粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂后经过水浴加热可发现DNA被染成蓝色，D错误。]6．(不定项)(2024·黑龙江齐齐哈尔二模)图甲为某种棉花的酶D基因及拟南芥叶绿体膜上的转运肽基因，图乙为Ti质粒。为增加油菜种子的含油量，可将酶D基因与转运肽基因相连，导入油菜叶片细胞并获得高产转基因油菜品种。下列叙述正确的是( )A．用限制酶ClaⅠ和DNA连接酶处理图甲两种基因后，可使A、D端相连B．图乙的Ti质粒被限制酶切割一次后，会产生4个游离的磷酸基团C．将目的基因插入图乙T-DNA中构建重组质粒，其可能在农杆菌中表达D．将农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到的即为高产转基因油菜AC [用限制酶ClaⅠ切割图甲两种基因后，会使A、D端产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶可使A、D端相连，A正确；图乙的Ti质粒被限制酶切割一次后，会产生2个游离的磷酸基团，B错误；将目的基因插入图乙T-DNA中构建重组质粒，其可能在农杆菌中表达，C正确；将农杆菌接种在含四环素的固体平板上可得到单菌落，D错误。]7．(2024·北京模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是( )A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功C [若用HindⅢ酶切，由于形成的黏性末端相同，因此目的基因可正向连接到质粒中，也可反向连接到质粒中，即通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒，A正确；若用PvuⅠ酶切，目的基因的插入会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因，B正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，而导入空质粒的含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，故若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得含有正确的重组质粒的菌体，而非获得正确的重组质粒，C错误；若用ScaⅠ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，D正确。]8．(不定项)(2024·吉林长春模拟)“DNA粗提取与鉴定”的操作步骤为研磨→去杂→析出→鉴定。某研究组欲探究不同去杂方法对实验结果的影响(如下表)。下列叙述正确的是( )去杂质方式 沉淀质量(g) DNA浓度(ng·μL-1) OD260/OD280 二苯胺鉴定离心 0.0680 81.50 1.53 蓝色4 ℃冰箱静置 0.1028 336.4 1.41 蓝色注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度；纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。A．猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA的材料B．对研磨液进行离心的目的是加速DNA的沉淀C．离心法可以获得更高纯度的DNAD．析出时的离心转速明显高于去杂质时ACD [DNA粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；据表可知，离心时DNA浓度是81.5 ng·μL-1，4 ℃冰箱静置时是336.4 ng·μL-1，说明静置时蛋白质含量较多，沉淀质量离心时是0.068 g，4 ℃冰箱静置时是0.1028 g，比较可知DNA的沉淀质量小，故析出时的离心转速明显高于去杂质时，D正确。]9．(10分)(2024·黑龙江模拟)蓝色妖姬属于最名贵的玫瑰，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中的花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家通过图1从链霉菌中获取激活基因(sfp)，其中①、②、③、④为引物，获取的sfp基因经限制酶PmeⅠ、BamHⅠ切割后能与Ti质粒形成重组质粒；通过图2在限制酶SpeⅠ、SacⅠ、BcLⅠ、BamHⅠ的切割下获取靛蓝合成酶基因(idgS)、并能与Ti质粒形成重组质粒；通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。(提示：基因sfp和idgS表达的方向如图)结合相关知识回答下列问题：(1)通过图1获取目的基因(sfp)的方法是______________，选用的引物是_____________________________________________________________________。(2)基因sfp和基因idgS应分别导入Ti质粒的________和________位置，并说明原因：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)通过图1获取的目的基因能被限制酶SacⅠ、BeLⅠ、BamHⅠ识别和切割，结合图3应选用______________限制酶切割，并说明选用的原因：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)通过图2和图3构建基因表达载体时应选用______________限制酶切割，并说明选用的原因：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(5)将目的基因导入受体白玫瑰细胞，待细胞再生成植株，开出的花朵却不变蓝，可能的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。[解析] (1)由图1可知，获取目的基因(sfp)的方法是PCR技术，DNA复制延伸的方向是从5′→3′，目的基因(sfp)上面的一条链复制的方向是由右向左，下面的一条链复制的方向是由左向右，所以选引物②和引物③。(2)由图可知，基因sfp表达的方向由右向左，基因idgS表达的方向由左向右，基因表达的方向需要经过启动子到终止子，因此基因表达的方向应与Ti质粒表达的方向一致。(3)通过图1获取目的基因后再选用BamHⅠ限制酶切割，因为BamHⅠ酶切位点位于启动子和终止子之间。(4)由图2和图3可知，构建基因表达载体时应选用限制酶BcLⅠ和SacⅠ，这样获取的目的基因避免环化，同时保证目的基因与质粒连接的方向一致。(5)将目的基因导入受体白玫瑰细胞后，待细胞再生成植株，开出的花朵却不变蓝，可能原因是sfp和idgS基因未成功导入细胞或导入后没有表达。[答案] (每空1分，共10分)(1)PCR技术 引物②和引物③ (2)左侧 右侧 基因sfp表达的方向由右向左，基因idgS表达的方向由左向右，确保基因的表达方向与Ti质粒表达的方向一致(3)BamHⅠ BamHⅠ酶切位点位于启动子和终止子之间 (4)BcLⅠ和SacⅠ 避免获取的目的基因环化，同时保证目的基因与质粒连接的方向一致(5)sfp和idgS基因未成功导入细胞或导入后没有表达(教师用书独具)1．(2024·辽宁辽阳模拟)2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是( )A．sgRNA通过与目标DNA碱基互补配对引导Cas9蛋白到位B．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低C．Cas9蛋白作用于磷酸二酯键D．经过改造的转基因猪，可以利用无性繁殖的方法，如核移植、胚胎分割得到更多的可移植器官供体B [由于DNA和RNA之间可进行碱基互补配对，因而sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键进而可以将目标基因剪切下来，A、C正确；sgRNA序列越短，DNA分子上与其互补的特定序列会越多，错误结合概率越高，B错误；经过改造的转基因猪，可以利用无性繁殖的方法，如核移植、胚胎分割得到更多的可移植器官供体，D正确。]2．(2024·安徽蚌埠模拟)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是( )A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病番木瓜C [农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确；因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D错误。]3．(不定项)(2024·黑龙江哈尔滨模拟)表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA上最常见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在STC2(癌症相关基因)mRNA的m6A修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现STC2基因的过表达，以研究m6A甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响(其中STC2基因的α链为转录的模板链)。下列说法错误的是( )注：a、b、c、d为四种引物序列；BamHⅠ、HindⅢ、SacⅠ为限制酶。A．PCR反应体系需要加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用B．利用PCR扩增目的基因时，需要在引物b的5′端添加HindⅢ识别序列和强启动子序列C．为确保目的基因正确插入质粒，需要选择限制酶BamHⅠ和SacⅠ切割质粒D．表达载体上潮霉素抗性基因已被破坏，所以不需要用含潮霉素的培养基去鉴定选择BD [PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，A正确；利用PCR扩增目的基因STC2时，引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，且STC2基因的α链为转录的模板链，需要在引物c的5′端添加BamHⅠ识别序列和强启动子序列，在引物b的5′端添加SacⅠ识别序列，B错误；目的基因STC2的两侧有BamHⅠ、SacⅠ的识别位点，二者不会把强启动子切割掉，因此为确保目的基因正确插入质粒，需要选择BamHⅠ、SacⅠ限制酶切割质粒，C正确；由图可知，重组质粒中只有卡那霉素抗性基因，因此依次使用含卡那霉素的培养基和含潮霉素的培养基筛选，能够在含卡那霉素培养基中生长，而不能在含潮霉素培养基中生长的大肠杆菌即为导入重组质粒的大肠杆菌，D错误。]1 / 23第55讲 重组DNA技术的基本工具 1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2．实验：DNA的粗提取与鉴定。考点1 重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念二、基因工程的诞生和发展1．肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间________。2．DNA双螺旋结构的提出和____________的证明。3．中心法则的确立。4．____________的破译。5．基因转移载体的发现。________________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。6．________体外重组的实现。7．重组DNA表达实验的成功。8．DNA测序和合成技术的发明。9．________技术的发明。10．______________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。三、重组DNA技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)1．(人教版选择性必修3 P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。2．(人教版选择性必修3 P71正文)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。2．DNA连接酶3．载体3．(人教版选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于__________________________________________________________________________________________________________________________。4．(人教版选择性必修3 P73正文)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。[深化拓展]限制酶的选择要求1．位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。2．酶切要求(1)单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。(2)双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。3．数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。4．特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。1．基因工程的原理是基因重组，此变异是不定向的。 ( )2．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 ( )3．限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000。 ( )4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 ( )5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ( ) 我国科学家将蓝细菌ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA，然后将重组DNA与Ti质粒构建成表达载体，再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中，最终成功获得了转ictB基因水稻，提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图所示。(1)为使重组DNA分子能定向插入Ti质粒的相应区段中，可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端、N端添加的限制酶识别序列分别是 。(2)经过酶切的重组DNA分子和 Ti质粒进行连接时，可选用 (填“E．coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。(3)在ictB基因表达载体的构建中不宜选用Ti质粒作为载体，原因是 。基因工程工具酶的应用1．(链接人教版选择性必修3 P71图3-3)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5′-G↓GATCC-3′、5′↓GATC-3′、5′-CCC↓GGG-3′。下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是( )A．若用SmaⅠ完全切割该DNA，则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bpB．若虚线方框内的碱基对被T－A替换，则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段C．若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA，可形成相同的黏性末端D．用SmaⅠ切割DNA产生的片段，不能用E．coli DNA连接酶重新将其连接2．(链接人教版选择性必修3 P75拓展应用T2)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是( )A．可以避免质粒或者目的基因自身环化B．可以避免目的基因与质粒反向连接C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因D．可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来基因工程载体的应用3．(链接人教版选择性必修3 P72图3-4、正文)如图为外源DNA、大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是________________(写中文名称)，________________________________________，构成人类的胰岛素基因和质粒的基本骨架。(2)将人的胰岛素基因导入质粒构建基因表达载体时，所需的酶是____________________________________；基因表达载体应具有的基本条件有______________________________(答2点)。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为____________，其作用是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)将剪切后的人胰岛素基因和剪切后的质粒混合进行连接反应，得到重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用________处理，使其能吸收周围的DNA。考点2 DNA的粗提取与鉴定一、实验原理二、实验步骤1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。1．(链接人教版选择性必修3 P75图示信息)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是( )A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNAD．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化2．(链接人教版选择性必修3 P74－75探究·实践)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰1． (2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )A．限制酶失活，更换新的限制酶B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，需更换正常质粒DNAD．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶2．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质3．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建基因表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列基因表达载体构建方案合理且效率最高的是( )A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E．coli DNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coli DNA连接酶连接4．(2023·广东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色1 / 10课时分层作业(五十五)1．D 2．B 3．D 4．C 5．D 6．AC [用限制酶ClaⅠ切割图甲两种基因后，会使A、D端产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶可使A、D端相连，A正确；图乙的Ti质粒被限制酶切割一次后，会产生2个游离的磷酸基团，B错误；将目的基因插入图乙T-DNA中构建重组质粒，其可能在农杆菌中表达，C正确；将农杆菌接种在含四环素的固体平板上可得到单菌落，D错误。]7．C [若用HindⅢ酶切，由于形成的黏性末端相同，因此目的基因可正向连接到质粒中，也可反向连接到质粒中，即通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒，A正确；若用PvuⅠ酶切，目的基因的插入会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因，B正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，而导入空质粒的含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，故若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得含有正确的重组质粒的菌体，而非获得正确的重组质粒，C错误；若用ScaⅠ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，D正确。]8．ACD [DNA粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；据表可知，离心时DNA浓度是81.5 ng·μL-1，4 ℃冰箱静置时是336.4 ng·μL-1，说明静置时蛋白质含量较多，沉淀质量离心时是0.068 g，4 ℃冰箱静置时是0.1028 g，比较可知DNA的沉淀质量小，故析出时的离心转速明显高于去杂质时，D正确。]9．(每空1分，共10分)(1)PCR技术 引物②和引物③ (2)左侧 右侧 基因sfp表达的方向由右向左，基因idgS表达的方向由左向右，确保基因的表达方向与Ti质粒表达的方向一致 (3)BamHⅠ BamHⅠ酶切位点位于启动子和终止子之间 (4)BcLⅠ和SacⅠ 避免获取的目的基因环化，同时保证目的基因与质粒连接的方向一致 (5)sfp和idgS基因未成功导入细胞或导入后没有表达1 / 2 展开更多...... 收起↑ 资源列表 78 选择性必修3 第九单元 第55讲 重组DNA技术的基本工具 学案（学生版）.docx 78 选择性必修3 第九单元 第55讲 重组DNA技术的基本工具 学案（教师版）.docx 课时分层作业55 参考答案与精析.docx 课时分层作业55 重组DNA技术的基本工具.docx
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