资源简介

提升点1　PCR技术及应用
1．PCR循环图示及规律
2．PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物1(或2) 的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物1、2的DNA 分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物 数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2
3．利用RT-PCR技术进行RNA病毒的核酸检测
(1)RT-PCR技术(逆转录荧光PCR技术)
①先从样本中提取RNA，RNA中可能有某病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。
②先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。因为病毒中的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止检测的物质在检测过程中降解，把它转换为更稳定的DNA。
③检测扩增出的PCR产物，即DNA片段。扩增的病毒DNA片段能够发出荧光而被仪器检测到。这些扩增出的供检测的产物的多少，很大程度上取决于样本中目标RNA量的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。
(2)荧光探针法(TaqMan技术)是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5′端标记一个荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记一个淬灭基团(Quencher，Q)。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。如图所示：
荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。Ct>40或无Ct值判定为阴性。
4．CRISPR/Cas9结合PCR
CRISPR/Cas9系统是一种革命性的基因组编辑技术，其原理是由一条单链向导RNA(SgRNA)引导限制性内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
通过扩增特定的基因片段，并将其插入目标基因中，可以实现对基因的敲除或敲入，为研究基因功能提供有力手段。将CRISPR/Cas9系统与PCR技术结合，可以实现对特定基因的高效编辑和检测。
1．(2024·河北部分高中模拟)现如今随着技术的不断发展，人们发明了多种PCR技术的衍生版本，如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述正确的是(　　)
A．已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来，因此可用于较长DNA分子的人工合成
B．已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，因此可用于病毒的检测与分析
C．已知热不对称性PCR可通过调节退火温度产生多种产物，因此操作时对温度的要求低于常规PCR
D．已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，因此可用于亲子鉴定
A　[重叠延伸PCR可将两个或多个短DNA连接成一个长DNA，可以将人工合成的短DNA合成为目标长DNA，A正确；等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，可用于亲子鉴定以及遗传病的筛查，无法检测是否存在某种病毒，B错误；热不对称性PCR需对温度进行精细控制，对温度的要求高于常规PCR，C错误；荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，可用于某些病毒的检测，无法判断两份DNA间的细微差别，因此无法用于亲子鉴定，D错误。]
2．(不定项)(2024·湖南岳阳模拟)实时荧光RT-PCR用于RNA病毒的核酸检测，其原理是在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光，如图所示。下列有关叙述正确的有(　　)
A．与细胞内DNA复制相比，该技术用的DNA聚合酶最适温度较高
B．通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量
C．该过程中消耗引物的量与发出的荧光强度之间呈负相关
D．与抗体检测相比，核酸检测能更早发现患者并及时治疗
AD　[实时荧光RT-PCR过程温度要高于体温，A正确；温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量，B错误；复性过程中探针和引物一起与模板结合，故消耗引物的量与发出的荧光强度之间呈正相关，C错误；从感染病毒到抗体产生，需要一定的免疫时间，所以与抗体检测相比，核酸检测能更早发现患者并及时治疗，D正确。]
3．(2024·全国新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是____________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_____________________________________________________________________
(答出2点即可)。
[解析]　(1)限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常表达。(2)RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组DNA；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P4不能与菌株B2的基因组单链结合，所以实验结果是不能扩增出DNA片段。(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
[答案]　(1)磷酸二酯键　不破坏N基因，且能保证N基因正常表达　(2)C—G、A—T、U—A
(3)菌株B2的基因组DNA　不能扩增出DNA片段　(4)不污染环境、增加土壤养分
提升点2　电泳技术及应用
1．核酸凝胶电泳
一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率与核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等有关。
在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同核苷酸数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。
2．电泳在遗传中的应用
遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同的切割位点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同的切割位点，每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。
1．(不定项)(2024·山东枣庄期末)某环状DNA分别用限制酶1和限制酶2完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示(注：kb表示千碱基对数，M代表标准对照)。下列叙述正确的是(　　)
A．该DNA总长度不可能为14 kb
B．该DNA上至少有2个酶1的切割位点
C．该DNA上至少有1个酶2的切割位点
D．同时用酶1和酶2切割该DNA，电泳结果至少呈现2个条带
BCD　[限制酶2切割后有7 kb这一种条带，若限制酶2切割后有两条7 kb条带，则DNA总长度可能为14 kb，A错误；限制酶1切割后产生了两个条带，说明至少有两个切割位点，B正确；若环状DNA总长度为最少7 kb，限制酶2切割后只有7 kb这一种条带，则该DNA上至少有1个酶2的切割位点，C正确；限制酶1切割后产生了6 kb和1 kb两个条带，若限制酶2切割限制酶1产生的6 kb片段，产生1 kb和5 kb的片段，则切割产物电泳后出现两个条带，D正确。]
2．(2024·全国新课标卷)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同　
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
D　[由题干信息可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A/a为上部两条带的等位基因，B/b为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1为AAbb，P2为aaBB，F1为AaBb，F2中①AaBB和②Aabb都为杂合子，③AABb占F2的比例为1/8，⑤AABB占F2的比例为1/16，A正确；电泳图中的F2的基因型依次为①AaBB、②Aabb、③AABb、④aaBB、⑤AABB、⑥AAbb、⑦aabb、⑧AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有3条带，B正确；③AABb和⑦aabb杂交后代为Aabb、 AaBb，其PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同，C正确；①AaBB自交子代为AABB(1/4)、AaBB(1/2)、aaBB(1/4)，其PCR产物电泳结果与④aaBB电泳结果相同的占1/4，D错误。]
8 / 8提升点1　PCR技术及应用
1．PCR循环图示及规律
2．PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物1(或2) 的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物1、2的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2
3．利用RT-PCR技术进行RNA病毒的核酸检测
(1)RT-PCR技术(逆转录荧光PCR技术)
①先从样本中提取RNA，RNA中可能有某病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。
②先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。因为病毒中的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止检测的物质在检测过程中降解，把它转换为更稳定的DNA。
③检测扩增出的PCR产物，即DNA片段。扩增的病毒DNA片段能够发出荧光而被仪器检测到。这些扩增出的供检测的产物的多少，很大程度上取决于样本中目标RNA量的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。
(2)荧光探针法(TaqMan技术)是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5′端标记一个荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记一个淬灭基团(Quencher，Q)。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。如图所示：
荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)，与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。Ct>40或无Ct值判定为阴性。
4．CRISPR/Cas9结合PCR
CRISPR/Cas9系统是一种革命性的基因组编辑技术，其原理是由一条单链向导RNA(SgRNA)引导限制性内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
通过扩增特定的基因片段，并将其插入目标基因中，可以实现对基因的敲除或敲入，为研究基因功能提供有力手段。将CRISPR/Cas9系统与PCR技术结合，可以实现对特定基因的高效编辑和检测。
1．(2024·河北部分高中模拟)现如今随着技术的不断发展，人们发明了多种PCR技术的衍生版本，如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述正确的是(　　)
A．已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来，因此可用于较长DNA分子的人工合成
B．已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，因此可用于病毒的检测与分析
C．已知热不对称性PCR可通过调节退火温度产生多种产物，因此操作时对温度的要求低于常规PCR
D．已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，因此可用于亲子鉴定
2．(不定项)(2024·湖南岳阳模拟)实时荧光RT-PCR用于RNA病毒的核酸检测，其原理是在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光，如图所示。下列有关叙述正确的有(　　)
A．与细胞内DNA复制相比，该技术用的DNA聚合酶最适温度较高
B．通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量
C．该过程中消耗引物的量与发出的荧光强度之间呈负相关
D．与抗体检测相比，核酸检测能更早发现患者并及时治疗
3．(2024·全国新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和_____________________________________________________________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是_____________________________________________________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是__________________________________________________(答出2点即可)。
提升点2　电泳技术及应用
1．核酸凝胶电泳
一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率与核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等有关。
在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同核苷酸数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。
2．电泳在遗传中的应用
遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同的切割位点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同的切割位点，每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。
1．(不定项)(2024·山东枣庄期末)某环状DNA分别用限制酶1和限制酶2完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示(注：kb表示千碱基对数，M代表标准对照)。下列叙述正确的是(　　)
A．该DNA总长度不可能为14 kb
B．该DNA上至少有2个酶1的切割位点
C．该DNA上至少有1个酶2的切割位点
D．同时用酶1和酶2切割该DNA，电泳结果至少呈现2个条带
2．(2024·全国新课标卷)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是(　　)
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同　
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
6 / 6

展开更多......

收起↑