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课时分层作业(五十六)
1．A　2．D　3．D　4．B　5．D　
6．C　[将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀，A正确。根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质，B正确。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C错误。PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，D正确。]
7．ABC　[如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时会破坏LUC基因，A错误；表达载体中GUS基因和LUC基因转录时双向启动子的转录方向不同，使用T-DNA的模板链也不同，B错误；壮观霉素抗性基因位于T-DNA序列之外，可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。]
8．(除标注外，每空2分，共12分)(1)需要能量、需要载体蛋白
(2)逆转录(1分)　47(1分)　Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ　Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ
(3)将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况　(4)水稻细胞内SOS3和SOS2的含量并未增加，转运蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1数量并未明显增多，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并转运的量没有明显增加
1 / 1第56讲　基因工程的基本操作程序
　1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。　2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点1　基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变______________或获得________________等的基因。主要是指______________的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知______________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件
①一定的缓冲液、DNA模板、____________、4种脱氧核苷酸和________________。
②通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(3)过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用__________________来鉴定。
1．(人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中____________，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够________和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
2．(人教版选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有____________________、_____________________。
[深化拓展]
筛选含有重组质粒的受体细胞的方法
1．用“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞
(1)将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落。
(2)再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。
(3)最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2．用“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色，即在筛选平板上含有重组质粒的菌落呈白色。
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (　　)
2．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (　　)
3．Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 (　　)
4．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (　　)
1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。
(1)第1组：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)第2组：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A．利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B．不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C．dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D．杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
基因工程的操作程序
2．(链接人教版选择性必修3 P77正文)随着科学技术的发展，获取目的基因的方法越来越多。下列不属于获取目的基因的方法的是(　　)
A．通过PCR技术扩增
B．从基因文库中获取
C．利用DNA连接酶复制
D．利用DNA合成仪通过化学方法人工合成
3．(链接人教版选择性必修3 P80正文及图3-6)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．推测In-Fusion酶的作用仅为识别同源序列、连接磷酸二酯键
B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基不容易互补配对
D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列
4．(链接人教版选择性必修3 P81资料卡)铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。某科研团队研究发现，铝胁迫可诱导铝耐受型大豆根尖SGF14a基因的表达。为了验证SGF14a基因在植物应答铝胁迫中的作用，研究人员构建含SGF14a基因的表达载体，将其转化到烟草细胞进而获得转基因烟草，并对转基因烟草进行铝耐受性的研究，具体操作流程如图1所示。回答下列问题：
(1)提取铝耐受型大豆根尖细胞中的RNA，在____________的催化下合成cDNA，最终获得SGF14a基因。根据SGF14a基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，设计引物时，常在两条引物中加入不同的限制酶酶切位点，其主要目的是______________________________________________________________。已知图1中大豆SGF14a基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的位置，选用的引物组合应为__________________。
(2)将表达载体导入经处理的农杆菌后，筛选出含SGF14a基因的农杆菌，然后将其与烟草细胞共培养，携带SGF14a基因的____________整合到烟草细胞的染色体DNA上，进而获得转基因烟草细胞。
(3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含____________(填抗生素)的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株，生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)为了探究转基因烟草对铝胁迫的耐受性，用50 μmol/L AlCl3处理含有SGF14a基因的两个转基因烟草株系(S1和S2)和野生型烟草(WT)的无菌苗的根，24 h后分析烟草根相对生长量，结果显示转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，请结合图2分析其原因可能是_______________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)为验证转基因烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株强，实验小组设计实验进行个体生物学水平的鉴定：将_____________________________________栽培到酸性土壤中，其他条件均相同且适宜，一段时间后，观察___________。
考点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．PCR原理：利用了________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的______________等有关。
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用______________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在__________或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的____________混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入__________内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶________为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用____________________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
2．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9 mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析正确的是(　　)
A．敲除2、3、4片段引起的变异属于基因重组
B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNA
C．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子
D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD-1
1． (不定项)(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
2．(2023·重庆卷)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
3．(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是______________。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________；
若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
1 / 12第56讲　基因工程的基本操作程序
　1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。　2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点1　基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件
①一定的缓冲液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
②通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(3)过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
1．(人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
2．(人教版选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有__________________、________________________。
提示：抗原—抗体杂交　采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
[深化拓展]
筛选含有重组质粒的受体细胞的方法
1．用“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞
(1)将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落。
(2)再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。
(3)最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2．用“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色，即在筛选平板上含有重组质粒的菌落呈白色。
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (√)
2．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (×)
提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
3．Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 (√)
4．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (√)
1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。
(1)第1组：___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)第2组：___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：(1)不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　(2)不合理，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组载体，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况
PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A．利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B．不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C．dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D．杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
C　[利用PCR 技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，A正确；引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增，B正确；dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。]
基因工程的操作程序
2．(链接人教版选择性必修3 P77正文)随着科学技术的发展，获取目的基因的方法越来越多。下列不属于获取目的基因的方法的是(　　)
A．通过PCR技术扩增
B．从基因文库中获取
C．利用DNA连接酶复制
D．利用DNA合成仪通过化学方法人工合成
C　[目的基因序列已知的情况下，利用PCR技术可扩增目的基因，也可以通过建立基因文库，从基因文库中获取目的基因，也可以利用DNA合成仪通过化学方法人工合成，A、B、D正确；利用DNA连接酶无法复制目的基因，C错误。]
3．(链接人教版选择性必修3 P80正文及图3-6)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．推测In-Fusion酶的作用仅为识别同源序列、连接磷酸二酯键
B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基不容易互补配对
D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列
A　[分析题意可知，In-Fusion酶的作用是识别同源序列、连接磷酸二酯键，形成黏性末端，A错误；若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；据图可知，重组质粒形成时需要加入In-Fusion酶连接磷酸二酯键，且如果温度远高于50 ℃，黏性末端的碱基不容易互补配对，C正确；分析题意，传统方法常受限于限制酶识别序列，故科研人员研发了新的DNA重组方法： In-Fusion技术，结合图示可知，该技术无需识别特定切割位点，但用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，故需识别目的基因与线性质粒任意同源序列，D正确。]
4．(链接人教版选择性必修3 P81资料卡)铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。某科研团队研究发现，铝胁迫可诱导铝耐受型大豆根尖SGF14a基因的表达。为了验证SGF14a基因在植物应答铝胁迫中的作用，研究人员构建含SGF14a基因的表达载体，将其转化到烟草细胞进而获得转基因烟草，并对转基因烟草进行铝耐受性的研究，具体操作流程如图1所示。回答下列问题：
(1)提取铝耐受型大豆根尖细胞中的RNA，在____________的催化下合成cDNA，最终获得SGF14a基因。根据SGF14a基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，设计引物时，常在两条引物中加入不同的限制酶酶切位点，其主要目的是______________________________________________________________。已知图1中大豆SGF14a基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的位置，选用的引物组合应为__________________。
(2)将表达载体导入经处理的农杆菌后，筛选出含SGF14a基因的农杆菌，然后将其与烟草细胞共培养，携带SGF14a基因的____________整合到烟草细胞的染色体DNA上，进而获得转基因烟草细胞。
(3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含____________(填抗生素)的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株，生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)为了探究转基因烟草对铝胁迫的耐受性，用50 μmol/L AlCl3处理含有SGF14a基因的两个转基因烟草株系(S1和S2)和野生型烟草(WT)的无菌苗的根，24 h后分析烟草根相对生长量，结果显示转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，请结合图2分析其原因可能是________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)为验证转基因烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株强，实验小组设计实验进行个体生物学水平的鉴定：将________________________________________栽培到酸性土壤中，其他条件均相同且适宜，一段时间后，观察__________________。
[解析]　(1)提取铝耐受型大豆根尖细胞中的RNA，在逆转录酶的催化下合成cDNA，最终获得SGF14a基因。根据SGF14a基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，设计引物时常在两条引物中加入不同的限制酶酶切位点，主要目的是使SGF14a基因能定向插入表达载体，防止反向连接和自身环化。图1中大豆SGF14a基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的位置，PCR扩增时要扩增A位点和B位点之间的片段，所以选用的引物组合应为引物1和引物4。(2)将含SGF14a基因的农杆菌与烟草细胞共培养，农杆菌将携带SGF14a基因的T-DNA整合到烟草细胞的染色体DNA上，获得转基因烟草细胞。(3)卡那霉素抗性基因在T-DNA片段上，要筛选出含目的基因的植物细胞，应用卡那霉素进行筛选。培养过程中用到了生芽培养基和生根培养基，细胞分裂素与生长素的比值低时促进根的发生，细胞分裂素与生长素的比值高时有利于芽的形成。(4)转基因烟草根相对生长量比野生型烟草的高，结合图2分析其原因可能是烟草细胞中SGF14a基因的表达能够增加可溶性蛋白含量，提高烟草对铝胁迫的耐受性。(5)验证转基因烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株强，若进行个体生物学水平的鉴定，可将等量的转基因烟草植株和野生型烟草植株栽培到酸性土壤中，其他条件均相同且适宜，培养适宜时间后，观察植株的生长情况。
[答案]　(1)逆转录酶　使SGF14a基因能定向插入到表达载体中，防止反向连接和自身环化　引物1和引物4　(2)T-DNA　(3)卡那霉素　生芽培养基中细胞分裂素与生长素的比值较高，生根培养基中细胞分裂素与生长素的比值较低　(4)烟草细胞中SGF14a基因的表达能够增加可溶性蛋白含量，提高烟草对铝胁迫的耐受性　(5)等量的转基因烟草植株和野生型烟草植株　植株的生长情况
考点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1_mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
A　[琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。]
2．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9 mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析正确的是(　　)
A．敲除2、3、4片段引起的变异属于基因重组
B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNA
C．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子
D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD-1
CD　[据图分析，通过删除编码PD-1蛋白功能区的2、3、4片段造成蛋白的功能性缺失，指的是将野生型基因内部的部分碱基对剪切，改变的是基因内部的碱基序列，属于可遗传变异中的基因突变，A错误；分析图1可知，需要将基因的2、3、4共3个片段切除，需要设计片段2和片段4的2个sgRNA，B错误；基因敲除后，其核苷酸数量减少，电泳时移动速度快，距离点样孔远，4和12个体均为敲除纯合子，因此4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子，C正确；3个体的基因未敲除，5个体和9个体为基因敲除杂合子，体内均能检测到PD-1，D正确。]
1．(不定项)(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
AC　[利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A，另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，若对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C，因此对照个体的测序结果为5′—CTACCCGTGAT—3′，患者的测序结果为5′—CTACCTGTGAT—3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。]
2．(2023·重庆卷)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
B　[由于引物只能引导子链从5′端到3′端，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右侧的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割，两种酶识别序列不同，载体一般为环状，且载体中至少含有两种限制酶识别序列各一个，因此切割之后至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都可以连接黏性末端，D正确。]
3．(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是______________。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________________________________________________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
[解析]　(1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。(2)构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，T4 DNA连接酶连接平末端效率较高，需用T4 DNA连接酶连接。(3)用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒。(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸。
[答案]　(1)变性　氢键　(2)避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶　(3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒　(4)甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸
(教师用书独具)
(2024·浙江6月卷)疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　)
A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
D　[根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，说明其能够用于特异性扩增目的片段，A正确；F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；F1-R1能扩增目的条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。]
课时分层作业(五十六)　基因工程的基本操作程序
1．(2024·辽宁模拟)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是(　　)
A．克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子
B．可将克隆载体导入Ca2+处理过的大肠杆菌中进行复制
C．表达载体的元件中必须含有标记基因，也一定有复制原点
D．质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体和表达载体
A　[克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，克隆载体必须具备的元件是复制原点、标记基因，而启动子和终止子是参与转录过程的元件，A错误；Ca2+可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA的生理状态，因此可将克隆载体导入Ca2+处理过的大肠杆菌中来进行复制，B正确；表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达，包括转录和翻译，因此表达载体的元件中必须含有标记基因，用来筛选表达载体，也需要复制原点，保证表达载体能在受体细胞中自我复制，C正确；质粒、动植物病毒、噬菌体都能将外源基因导入受体细胞，故质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体和表达载体，D正确。]
2．(2024·河北衡水模拟)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，是一个高度保守且和细胞生长、死亡等功能有关的蛋白。现从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，插入表达质粒pGEX-4T-2上构建基因表达载体，最终表达有活性的dTCTP融合蛋白。关于该基因表达载体的构建，下列叙述错误的是(　　)
A．表达质粒pGEX-4T-2需要用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切
B． dTCTP基因是该项研究中的目的基因
C．除了目的基因和标记基因外，该基因表达载体还必须有启动子和终止子
D．将dTCTP基因插入表达质粒pGEX-4T-2上时，需要用到DNA聚合酶
D　[dTCTP基因经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，因此需要相同的限制酶切割载体，产生相同的黏性末端，A正确；由题意可知，从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，最终获得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是该项研究中的目的基因，B正确；基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，C正确；利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，构建基因表达载体，D错误。]
3．(2024·广东深圳期末)研究者欲将X基因导入到大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落为白色)，其结构如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．电泳时，X基因和重组质粒在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同
B．导入重组质粒前通常需用适宜浓度的Ca2+溶液处理大肠杆菌
C．应在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选大肠杆菌
D．成功导入X基因的细菌在含X-gal的培养基上的菌落呈蓝色
D　[在琼脂糖凝胶中的迁移速率最终取决于分子的大小，X基因和重组质粒分子大小不同，所以迁移速率不同，A正确；将重组质粒导入大肠杆菌前，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)和LacZ基因，所以导入并表达成功后的大肠杆菌会对氨苄青霉素有抗性、菌落中出现特定颜色，所以在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选大肠杆菌，C正确；导入X基因会使LacZ基因被破坏，使其不能产生正常的表达产物，所以在含X-gal的培养基上的菌落呈白色，D错误。]
4．(2024·山东临沂模拟)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示，下列叙述错误的是(　　)
A．过程①中，插入特定SgRNA编码序列的DNA时需要用到DNA连接酶
B．过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法
C．过程④中，SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，遵循了碱基互补配对的原则
D．过程⑤中，Cas9蛋白可切割目标DNA特定核苷酸序列
B　[为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶，即过程①中，插入特定SgRNA编码序列的DNA时需要用到DNA连接酶，A正确；过程②指的是将目的基因导入到受体细胞，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是感受态细胞法，B错误；过程④中，SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，该过程中遵循了碱基互补配对原则，C正确；过程⑤中，Cas9蛋白可在SgRNA的引导下切割SgRNA识别的目标DNA特定核苷酸序列，D正确。]
5．(2024·江苏盐城模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切割位点等序列。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
D　[耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，B正确；经过5次循环后会产生25＝32个DNA分子，其中只有2个DNA分子含有最初的模板链，另仅含有第一次复制产生的单链参与形成的DNA分子有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段有32－10＝22个，C正确；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。]
6．(2024·山东济宁二模)关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀
B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质
C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷
D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压蒸汽灭菌处理
C　[将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀，A正确。根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质，B正确。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C错误。PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，D正确。]
7．(不定项)(2024·江苏扬州模拟)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是(　　)
A．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
B．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板
C．可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞，在培养基中添加壮观霉素进行筛选
D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用
ABC　[如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时会破坏LUC基因，A错误；表达载体中GUS基因和LUC基因转录时双向启动子的转录方向不同，使用T-DNA的模板链也不同，B错误；壮观霉素抗性基因位于T-DNA序列之外，可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。]
8．(12分)(2024·吉林、黑龙江适应性测试)植物在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于细胞膜上的转运蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。回答下列问题：
(1)植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外，这种运输方式的特点是__________________________。
(2)通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过______________获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
②测序表明，SOS1基因编码序列含有3 444个核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板链中C含量为26%，那么SOS1基因双链序列中G＋C的含量为______%。
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加________________两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用________________两种限制酶对载体酶切。
(3)重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)若发现水稻中过量表达SOS1基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是_______________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)由题干信息“在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并将其排出细胞外”可知，植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外是逆浓度梯度的运输，因此运输方式为主动运输，特点是需要载体蛋白，需要能量。(2)①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过逆转录获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。②SOS1基因编码序列中A＋T含量占53%，则G＋C含量为47%。③由图可知，荧光蛋白基因内部存在SpeⅠ和BamHⅠ两种限制酶识别序列，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，并且不能选择限制酶SmaⅠ，否则会导致载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因不能正确表达，故选择XbaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶对载体酶切，由于SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，故不能选择限制酶XbaⅠ对目的基因酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，故可在SOS1基因两端分别添加SpeⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列。(3)鉴定水稻抗盐能力是否增强，采取的操作是将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况。(4)水稻细胞内SOS3和SOS2的含量并未增加，转运蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1数量并未明显增多，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并转运的量没有明显增加。
[答案]　(除标注外，每空2分，共12分)(1)需要能量、需要载体蛋白　(2)逆转录(1分)　47(1分)　Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ　Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ　(3)将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况　(4)水稻细胞内SOS3和SOS2的含量并未增加，转运蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1数量并未明显增多，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并转运的量没有明显增加
(教师用书独具)
1．(2024·湖南衡阳模拟)当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是(　　)
A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入pBI121质粒的植株作对照
B　[褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物生成黄色物质所致，故要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确；步骤①是目的基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确；为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。]
2．(不定项)(2024·江西南昌模拟)大丽轮枝菌(一种丝状真菌)是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员用绿色荧光蛋白基因(sGFP)转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图中启动子能被DNA聚合酶识别并结合，驱动sGFP基因的持续转录
B．被相关限制酶处理后，图中b链上黏性末端的碱基序列(5′→3′)为AGCT
C．若①是利用PCR扩增出的含有限制酶切割位点的sGFP，则5轮循环后消耗引物数为32个
D．③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP
AC　[启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录，A错误；图中质粒大片段的右端的限制酶是HindⅢ，根据HindⅢ识别的碱基序列可知，图中b链上黏性末端的碱基序列(5′→3′)为AGCT，B正确；若①是利用PCR扩增出的含有限制酶切割位点的sGFP，则5轮循环后消耗引物数为25×2－2＝62个，C错误；③过程用含潮霉素的培养基筛选农杆菌，得到多个菌落的质粒DNA中可能不含sGFP，因为导入原始质粒也可能具有抗性，D正确。]
3．(2024·广东湛江二模)研究发现，若将第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)，则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为(　　)
A．引物1和引物4　　　 B．引物2和引物6
C．引物2和引物4 D．引物3和引物5
B　[利用重叠延伸PCR技术对 DNA 分子进行定点突变的过程中，通过 PCR2 获得产物 CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3′端结合，因此引物 d 的序列为5′GTCACGTG，引物 2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将 mRNA上的第 154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为A。因此引物c的碱基序列为5′CCTGTTAT，引物6符合该序列。]
4．(不定项)(2024·湖南岳阳模拟)东南景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对 Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述错误的是(　　)
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
ABD　[由于引物接在了目的基因的两侧，因此经过两轮PCR后，可获得与HMA3基因等长的DNA单链，故若要获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；质粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含空质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。]
5．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是________________________________。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是__________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是______________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有____________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是____________。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)启动子是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏。根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自身环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因。(4)根据(4)题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
[答案]　(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自身环化；不能保证目标片段与载体定向连接(反向连接)　(3)酶切后的空载体片段、“启动子D＋基因S”片段　PCR技术　(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL的强，使得基因S表达量更高，种子更大
1 / 28课时分层作业(五十六)　基因工程的基本操作程序
(建议用时：30分钟；本套共8小题，共30分。第1～5小题，每小题2分；第6～7小题，每小题4分；第8小题12分。)
1．(2024·辽宁模拟)根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是(　　)
A．克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子
B．可将克隆载体导入Ca2+处理过的大肠杆菌中进行复制
C．表达载体的元件中必须含有标记基因，也一定有复制原点
D．质粒、动植物病毒、噬菌体均可作为克隆载体和表达载体
2．(2024·河北衡水模拟)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，是一个高度保守且和细胞生长、死亡等功能有关的蛋白。现从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，插入表达质粒pGEX-4T-2上构建基因表达载体，最终表达有活性的dTCTP融合蛋白。关于该基因表达载体的构建，下列叙述错误的是(　　)
A．表达质粒pGEX-4T-2需要用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切
B． dTCTP基因是该项研究中的目的基因
C．除了目的基因和标记基因外，该基因表达载体还必须有启动子和终止子
D．将dTCTP基因插入表达质粒pGEX-4T-2上时，需要用到DNA聚合酶
3．(2024·广东深圳期末)研究者欲将X基因导入到大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落为白色)，其结构如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．电泳时，X基因和重组质粒在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同
B．导入重组质粒前通常需用适宜浓度的Ca2+溶液处理大肠杆菌
C．应在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选大肠杆菌
D．成功导入X基因的细菌在含X-gal的培养基上的菌落呈蓝色
4．(2024·山东临沂模拟)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示，下列叙述错误的是(　　)
A．过程①中，插入特定SgRNA编码序列的DNA时需要用到DNA连接酶
B．过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法
C．过程④中，SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，遵循了碱基互补配对的原则
D．过程⑤中，Cas9蛋白可切割目标DNA特定核苷酸序列
5．(2024·江苏盐城模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切割位点等序列。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
6．(2024·山东济宁二模)关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀
B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质
C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷
D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压蒸汽灭菌处理
7．(不定项)(2024·江苏扬州模拟)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是(　　)
A．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
B．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板
C．可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞，在培养基中添加壮观霉素进行筛选
D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用
1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ＋0.5
8．(12分)(2024·吉林、黑龙江适应性测试)植物在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于细胞膜上的转运蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。回答下列问题：
(1)植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外，这种运输方式的特点是_____________________________________________________________________。
(2)通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过______________获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
②测序表明，SOS1基因编码序列含有3 444个核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板链中C含量为26%，那么SOS1基因双链序列中G＋C的含量为______%。
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加________________两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用________________两种限制酶对载体酶切。
(3)重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是_________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)若发现水稻中过量表达SOS1基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
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