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第57讲　基因工程的应用、蛋白质工程及生物技术的安全性与伦理问题
　1．举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。　2．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。　3．概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。　4．转基因产品的安全性引发社会的广泛关注。　5．世界范围内应全面禁止生物武器。　6．中国禁止生殖性克隆人。
考点1　基因工程的应用
一、基因工程在农牧业方面的应用
1．(人教版选择性必修3 P88正文)野外种植转基因抗A害虫植物的同时，还种植一定量的同种不抗虫植物，可降低抗性害虫在整个害虫种群中所占比例的增加速率。其原因是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：种植一定量的同种不抗虫植物，对抗性害虫的选择作用减弱
二、基因工程在医药卫生领域的应用
1．
2．(人教版选择性必修3 P90正文)利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是_____________________________________________________________。
提示：药用蛋白基因没有转录或翻译
2．器官移植：在器官供体的基因组中导入调控基因表达的DNA序列，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官。
三、基因工程在食品工业方面的应用
1．转基因抗病农作物不需要使用农药。 (×)
提示：转基因抗病农作物减少了农药的使用。
2．若仅种植转基因抗虫大豆，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。 (√)
3．用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实。 (√)
4．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵作为受体。 (×)
提示：受体细胞也可以是植物的体细胞。
5．乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。 (×)
提示：应将药用蛋白基因导入动物的受精卵中。
甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。
(1)利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是基因表达载体的构建，该过程需要选择______________限制酶切割甜蛋白基因。
提示：XbaⅠ和HindⅢ
(2)为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为____________________________________。
提示：番茄细胞中能表达的基因的启动子
(3)若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交，若子代表型及比例为________________________，说明2个甜蛋白基因插入了两对同源染色体上(含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相同)。
提示：超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
(4)若在被农杆菌感染成功的玉米细胞中检测到了甜蛋白基因，但没有检测到甜蛋白，分析其原因可能是_______________________________________________。
提示：该基因没有转录或转录后没有翻译成功
基因工程的应用
1．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P88图文信息)为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是(　　)
A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D．提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生根
BD　[将目的基因(基因G)插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因(基因G)整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确；农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误；据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生芽，D错误。]
2．(链接人教版选择性必修3 P91正文及相关信息)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的______________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________________，理由是_________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为___________________________________________________
____________________________________________________________(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：___________________________________________________________
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_____________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2)由题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与pMag-T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。(4)由(2)分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)由(2)分析可知，最终BC膜被染成黑色，若希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶。
[答案]　(1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达　(3)抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株　(4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素　(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶
考点2　蛋白质工程
一、蛋白质工程的概念
1．基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
2．手段：改造或合成基因。
3．结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
二、蛋白质工程的基本流程
　
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B．翻译，C．分子设计，D．多肽链，E．预期功能。
三、蛋白质工程与基因工程的异同
1．区别
项目 蛋白质工程 基因工程
基本思路或过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已存在的蛋白质
2．联系
(1)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
(人教版选择性必修3 P94图3-17)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？_______________。
提示：通过对基因的操作来实现。基因能控制蛋白质的合成，基因能遗传给下一代
四、蛋白质工程的应用
1．医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
2．其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
3．农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加粮食的产量；通过改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
1．蛋白质工程实施的前提是获取基因与目标蛋白质的结构数据。 (√)
2．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质。 (×)
提示：蛋白质工程通过改变基因的碱基排列顺序从而改变氨基酸的种类、数量、排列顺序以及蛋白质的空间结构而制造出新的蛋白质。
3．蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。 (√)
4．蛋白质工程常借助计算机建立蛋白质的三维结构模型。 (√)
研究人员通过解析Bt抗虫蛋白晶体的结构发现，第5号螺旋处的第168位氨基酸是孔道结构稳定性的关键，将该位点氨基酸替换为疏水性更强的精氨酸后，就有可能提高孔道结构的稳定性。根据这一研究结果，请写出后续利用蛋白质工程培育出抗虫能力更强的转基因棉花的基本思路。
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提示：把Bt抗虫蛋白第5号螺旋处的第168位氨基酸替换成精氨酸，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因) 或合成新的基因，再把该基因与载体构建成基因表达载体，导入受体细胞获得所需要的蛋白质
蛋白质工程的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P94图3-17)科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素(一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质)第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。已知天冬酰胺对应的密码子为AAU、AAC，赖氨酸对应的密码子为AAA、GUA等。下列叙述错误的是(　　)
A．上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B．在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C．上图中大分子物质a和b的单体序列均是唯一的
D．用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
C　[据图分析，通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构，进而明确氨基酸序列，最终确定基因中碱基对的排列顺序，A正确；蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成的基因，B正确；由于密码子的简并，图中大分子物质a和b的单体序列不是唯一的，C错误；蛋白质工程通过改造基因从而获得原本没有的蛋白质，因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质，D正确。]
2．(链接人教版选择性必修3 P95正文)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关
B．酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露
C．要获得水蛭素的基因，可以从水蛭细胞中提取mRNA，经逆转录获得目的基因
D．上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构
A　[两种酶水解水蛭蛋白后，肽含量的两条曲线比较接近，说明抗凝血的活性与其肽含量关联不大，A错误；酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性先上升后相对稳定，由此推测酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露，B正确；为了获得水蛭素基因，可以从细胞中提取水蛭素基因转录的mRNA，经逆转录获取目的基因，C正确；对水蛭素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程，上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构，D正确。]
考点3　生物技术的安全性与伦理问题
一、转基因成果
领域 成果
微生物方面 ①减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期 ②构建高产、优质的基因工程菌来生产氨基酸 ③用基因工程菌生产药物
转基因动物方面 ①培育生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜 ②培育抵抗相应病毒的动物新品种 ③建立某些人类疾病的转基因动物模型
转基因植物方面 培育具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物
1．(人教版选择性必修3 P102相关信息)将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以防止转基因花粉传播的原因是_______________________
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提示：由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播
二、对转基因产品安全性的争论
三、理性看待转基因技术
1．理性看待转基因技术的前提
(1)清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
(2)看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
(3)要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
2．我国对转基因技术的态度
(1)研究上要大胆，坚持自主创新。
(2)推广上要慎重，做到确保安全。
(3)管理上要严格，坚持依法监管。
3．我国相关部门制定了一系列的政策、法规并成立相关机构
(1)维护了消费者对转基因产品的知情权和选择权。
(2)最大程度地保证了转基因技术和已经上市的转基因产品的安全性。
(3)为保障农业转基因生物安全提供重要的技术支撑。
四、关注生殖性克隆人
1．生殖性克隆：指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
2．治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
3．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
4．比较试管婴儿和设计试管婴儿
(1)试管婴儿和设计试管婴儿过程(如图所示)
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
项目 试管婴儿 设计试管婴儿
不同点 技术手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断
应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、贫血症等遗传疾病的预防及治疗
相同点 二者都是体外受精、体外进行早期胚胎培养，再经过胚胎移植，从生殖方式上来看都为有性生殖
2．(人教版选择性必修3 P108正文)我国科学家用4种小分子化合物诱导小鼠的成纤维细胞转变成了iPS细胞，这种诱导方法与转入转录因子诱导产生iPS细胞相比，其优点是_____________________________________________________
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提示：避免了用特定的转录因子诱导iPS细胞可能带来的致癌风险
五、禁止生物武器
1．种类：致病菌类、病毒类、生化毒剂类等。
2．中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．转基因技术已被用于减少啤酒酵母双乙酰的生成。 (√)
2．理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 (√)
3．可以运用重组DNA技术进行生殖性克隆人研究。 (×)
提示：我国不允许任何人进行生殖性克隆人研究。
4．生物武器仅包括病毒类。 (×)
提示：生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
科学家运用基因组编辑技术在人类的早期胚胎中修正了与肥厚型心肌病发生相关的基因MYBPC3的突变，使胚胎携带正常MYBPC3基因的概率提高了20%左右。你认为该不该允许对人类胚胎进行基因组编辑的相关研究？请说明理由。
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提示：不允许。因为目前该技术存在一系列安全风险和伦理问题。如可能会出现“设计婴儿”“基因脱靶”问题，导入基因与细胞内原有基因相互作用的问题，病毒基因植入问题，因此应禁止对人类胚胎进行基因组编辑的相关研究
生物技术的安全问题
1．(链接人教版选择性必修3 P103－104正文)依据《中华人民共和国生物安全法》，生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。下列叙述错误的是(　　)
A．高致病性微生物必须在高等级生物安全实验室中开展实验活动
B．生物技术可广泛应用在人类自身基因组改造和新物种创造中
C．外来入侵物种可能增加本土食物来源却给自然生态造成破坏
D．动物饲料中的抗生素会通过食物链使人体微生物耐药性增强
B　[高致病性微生物必须在高等级生物安全实验室中开展实验活动，防止造成致病性微生物外泄，造成污染，危害生物健康，A正确；生物技术可应用在新物种创造中，但对人类自身基因组改造到目前还存在相应的问题，难以实现，B错误；外来入侵物种可能增加本土食物来源，但如果缺乏天敌会造成自然生态破坏，C正确；长期使用抗生素，必然产生残留，而残留在动物饲料中的抗生素，会随着食物链进入人体使微生物的耐药性增强，D正确。]
生物技术的伦理问题
2．(2023·浙江1月卷)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是(　　)
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
D　[试管婴儿技术是为了解决不孕夫妇的生育问题，不应该被全面禁止，A错误，我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，B错误，D正确；生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误。]
1．(2024·浙江1月卷)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是(　　)
A．试管动物的培育　　 B．转基因食品的生产
C．治疗性克隆的研究 D．生物武器的发展和生产
D　[试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A错误；我国目前不反对转基因食品的生产，B错误；中国政府禁止生殖性克隆，支持治疗性克隆，C错误；生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D正确。]
2．(2024·黑、吉、辽卷) 将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题：
注：F1—F3，R1—R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是__________________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是________________和____________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是____________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用__________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1 362合成基因序列和1 363-1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
[解析]　(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性。(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
[答案]　(1)水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离　溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA　(2)PCR技术扩增　人工合成　(3)RNA聚合酶识别并结合的部位　同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性
(4)HygBR　 (5)F3　R2　(6)D
3．(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有____________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-__________-3′和5′-__________-3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素____________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是__________，其中纯合的突变植株是______(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为__________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
[解析]　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。结合BsaⅠ识别序列可知，BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基，故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4＝256种。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-GTTT-3′和5′-CAAT-3′。(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图乙可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙所展示的电泳结果及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯合突变的植株。(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株自交子代，可知该植株配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
[答案]　(1)低　256　GTTT　CAAT　(2)卡那霉素　Sac Ⅰ　④　(3)1/4
课时分层作业(五十七)　基因工程的应用、蛋白质工程及生物技术的安全性与伦理问题
1．(2024·湖北一模)人乳铁蛋白(hLF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白(hLF)基因转入到山羊体内，从山羊的乳液中获得hLF，可以解决天然人乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是(　　)
A．可用PCR直接扩增乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
A　[不可以直接用PCR扩增mRNA，需将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，A错误；为保证在山羊的乳液中提取到人乳铁蛋白，需要将人乳铁蛋白基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；一般用显微注射法将目的基因导入山羊受精卵中，C正确；为检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现相应现象，则表明目的基因成功翻译形成蛋白质，D正确。]
2．(2024·湖北武汉模拟)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是(　　)
A．根据题意可知斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B．用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度
C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
B　[将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体 E 物质，推测斑马鱼的某些细胞存在 E 物质的受体，A正确；结合题图，ERE诱导Gal4转录，其翻译产物Gal4蛋白与UAS结合驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B错误；用于监测 E 物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C正确；基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，D正确。]
3．(2024·江西部分重点中学联考)草甘膦是一种广谱、非选择性的系统性除草剂，通过抑制植物中EPSPS酶的活性，使植物细胞内某些氨基酸不能合成，从而达到除草的目的。为提高小麦对草甘膦的耐受性，科学家将细菌的EPSPS基因转入小麦叶绿体中，得到抗草甘膦转基因小麦。下列相关叙述错误的是(　　)
A．将EPSPS基因导入小麦的叶绿体可避免基因污染
B．EPSPS基因在细菌和小麦中转录形成的mRNA相同
C．可通过喷洒草甘膦来检验转基因小麦是否培育成功
D．转基因小麦中EPSPS酶参与合成的氨基酸数量下降
D　[将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中能防止基因污染，因为叶绿体基因组不会进入花粉，A正确；由于EPSPS基因相同，其在细菌和小麦中转录形成的mRNA相同，这也是基因工程得以实现的基础之一，B正确；转基因小麦如果培育成功，则会产生EPSPS酶，能抵抗草甘膦，因此可以通过喷洒草甘膦来检验转基因小麦是否培育成功，C正确；转基因小麦中导入了EPSPS基因，细胞内EPSPS酶数量增加，促进了相关氨基酸的合成，D错误。]
4．(2024·广东广州二模)科学家将外源抗虫基因(Bt抗虫蛋白基因)转入某茄科植物细胞中，并整合到该植物的线粒体DNA上，获得了具有抗虫性状的转基因植物。下列叙述错误的是(　　)
A．Bt抗虫蛋白在线粒体中的成功合成与密码子的通用性有关
B．叶肉细胞内有多个线粒体，这有利于增加该转基因植物的抗虫性
C．将该转基因植物与同种非转基因植物进行正、反交，所得子代均有抗虫性
D．该技术能有效避免或减少外源基因通过花粉向其他植物的转移
C　[相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质利用了密码子的通用性的原理，A正确；叶肉细胞中有多个线粒体，则线粒体转化获得的抗虫基因数量多，其表达量远高于核转化的水平，有利于增加外源抗虫蛋白的含量，增加抗虫性，B正确；外源抗虫基因转入线粒体，只能通过母本卵细胞遗传给后代，若转基因作物作为父本则不可遗传，C错误；植物受精卵的质基因几乎全来自卵细胞，将外源基因转入线粒体中，可以防止外源基因通过花粉向其他植物扩散，D正确。]
5．(2024·黑龙江哈尔滨二模)人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟，产生巨大生产力的同时，也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述，正确的是(　　)
A．如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用
B．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，其原因之一是人体不会对它们产生免疫反应
C．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造
D．科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉传播造成基因污染
D　[如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止该产品的使用，不应该禁止转基因技术的应用，A错误；转基因技术制造的新型致病菌，致病能力和传染能力以及抗药能力等大幅度增加，因而导致具有极大的危害性，B错误；试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断，不涉及基因改造，C错误；科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，不参与受精作用，从而防止转基因花粉传播造成基因污染，D正确。]
6．(2024·湖南师大附中模拟)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是(　　)
A．引物2的3′端序列应包含XbaⅠ的识别序列
B．重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C．PCR反应时，缓冲液中一般要添加Ca2+来激活相关酶
D．引物1的5′端序列应考虑将GTG改为ATG
D　[根据题意可知，含GTG的一端为LDH基因的起始，为保证通过双酶切以正确方向插入质粒，设计引物1的5′端序列需要包含BamHⅠ的识别序列，引物2的5′端序列应包含XbaⅠ的识别序列，A错误；结合题意可知，本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用，B错误；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，C错误；设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达，D正确。]
7．(不定项)(2024·江西南昌模拟)通过基因工程获取的致病模型动物有助于研究目的基因的特性，在生命科学领域得到广泛应用。利用正常大鼠制备致病转基因模型大鼠的流程如图所示。下列说法中错误的是(　　)
A．构建表达载体时，应选用PstⅠ和SmaⅠ两种限制酶对含致病基因的DNA和质粒进行切割
B．将表达载体导入细胞A中时常用Ca2+处理，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态
C．可通过检测早期胚胎中荧光蛋白的表达情况，对转基因胚胎进行筛选
D．胚胎能在代孕母鼠子宫中存活的生理学基础是早期胚胎细胞保持着细胞全能性
ABD　[构建表达载体时，应选用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶对含致病基因的DNA和质粒进行切割，因为SmaⅠ会切割目的基因，A错误；将表达载体导入微生物时常用Ca2+处理，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，进而提高转化效率，B错误；图中基因表达载体中带有的标记基因是荧光蛋白基因，因而可通过检测早期胚胎中荧光蛋白的表达情况，对转基因胚胎进行筛选，C正确；胚胎能在代孕母鼠子宫中存活的生理学基础是受体子宫对移入的早期胚胎不会发生免疫排斥，D错误。]
8．(12分)(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为_____________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶__________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用______________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测__________________________，通过__________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为________。选择纯合子进行后续研究的原因是________________。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是_____________________________________________________________________
______________________________________________________(答出两点即可)。
[解析]　(1)利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，水稻胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnⅠ破坏了启动子序列不能选用，SacⅠ位于终止子序列之外不能选用，为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测r2HN基因是否转录出mRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合子自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合子进行后续研究。(4)据图可知，实验组的抗体水平和CD8＋T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。
[答案]　(每空1分，共12分)(1)水稻胚乳细胞特异性表达的基因的　终止转录过程　HindⅢ　EcoRⅠ　(2)农杆菌转化　r2HN是否转录出了mRNA　抗原—抗体杂交　(3)1/4　遗传性状稳定　(4)体液　细胞　(5)成本低、生物安全性高、不受性别限制、可大量种植等(答出两点即可)
(教师用书独具)
1．(2024·北京石景山一模)蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是(　　)
A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶
B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌
C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达
D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性
D　[构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误；将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中，B错误；基因表达载体上的启动子可调控蛛丝蛋白基因的表达，C错误；若需对蛛丝蛋白进行设计和改造以增强其韧性，可通过蛋白质工程来实现，D正确。]
2．(2024·安徽合肥模拟)AK、DHDPS是玉米中合成赖氨酸的两种关键酶，赖氨酸达到一定浓度就会与两种酶结合抑制它们的活性，如图所示，因此玉米中赖氨酸含量比较低。将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米叶片和种子内游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。下列有关分析错误的是(　　)
A．玉米中赖氨酸含量比较低与负反馈调节密切相关
B．要替换AK、DHDPS中的氨基酸需要通过改造相应基因来实现
C．改造后的AK和DHDPS 与底物结合能力加强，导致玉米合成赖氨酸的能力增强
D．改造后的AK和DHDPS空间结构改变，与赖氨酸结合的能力降低
C　[由题意可知，赖氨酸与AK、DHDPS结合，抑制它们的活性从而使反应速率下降，属于负反馈调节，A正确；据题干信息“将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸”可知，上述操作为蛋白质工程，蛋白质工程需要通过改造相应基因来实现，B正确；将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，会导致改造后的AK和DHDPS的空间结构改变，与赖氨酸结合的能力降低，但改造后的AK和DHDPS的活性基本不变，C错误，D正确。]
3．(不定项)(2024·江西模拟)普通棉花中β-甘露糖苷酶(GhMnaA2)基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接)，获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是(　　)
A．正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A
B．①过程所得到的表达载体均为反义表达载体
C．反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度
D．用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为46 kb和62 kb
CD　[由图可知，反义表达载体的B端靠近启动子，GhMnaA2基因的转录方向是A→B，A错误；①过程得到的表达载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；用SmaⅠ和NotⅠ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段，故用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18 kb＋28 kb＝46 kb和3 kb＋59 kb＝62 kb，D正确。]
4．(不定项)(2024·山东青岛二模)TaIBH1-2D是小麦中一个调控千粒重的关键基因。为验证TaIBH1-2D的功能，研究人员构建了过表达株系，可利用酶切法检验TaIBH1-2D与载体是否连接，图1三个泳道分别是用不同的限制酶完全酶切后(只考虑图示酶切位点)，产物经琼脂糖凝胶电泳的结果；同时构建了敲除TaIBH1-2D基因的突变体。图2统计了不同植株的千粒重。下列说法正确的是(　　)
A．电泳的缓冲液中含指示剂，可在紫外灯下被检测出来
B．泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体
C．泳道3为双酶切的重组载体，且目的基因与载体正确连接
D．由图2分析，TaIBH1-2D负调控小麦千粒重
BD　[缓冲液中不含指示剂，核酸染料应加在凝胶中，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，A错误；泳道1的质粒长度小于泳道2，则泳道1为单酶切空载体，泳道2为单酶切的重组载体，B正确；泳道3有一个条带的大小与泳道1相同，且还有两个较小的条带，则为限制酶A和限制酶B双酶切的重组载体，但是无法判断目的基因与载体是否正确连接，C错误；由图2分析，TaIBH1-2D基因过表达的植株千粒重小于野生型植株和敲除突变体，则说明TaIBH1-2D负调控小麦千粒重，D正确。]
5．(2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-(GTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是____________________。
(2)步骤②转化时，科研人员常用__________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有____________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是____________。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与__________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是______(从图2的“A～D”中选填)。
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
(ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是____________________________________
_____________________________________________________________________。
(ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是_____________________________________________________________________。
(ⅲ)据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有_________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图1可知，选引物S-F和E-R可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462＋750＝1 212 bp，编码1 212÷3＝404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11 kDa＝44.44 kDa，电泳后应该为条带C。(4)(ⅰ)由图可知，20 ℃时，与不加NaCl相比，加入NaCl后SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃，加入NaCl时，较SOD组，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD-ELP50蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
[答案]　(1)EcoRⅠ、HindⅢ　(2)CaCl2　卡那霉素　S-F和E-R　(3)启动子　C　(4)(ⅰ)SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多　(ⅱ)高温使蛋白变性　(ⅲ)低温下添加NaCl有利于SOD-ELP50蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
7 / 31第57讲　基因工程的应用、蛋白质工程及生物技术的安全性与伦理问题
　1．举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。　2．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。　3．概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。　4．转基因产品的安全性引发社会的广泛关注。　5．世界范围内应全面禁止生物武器。　6．中国禁止生殖性克隆人。
考点1　基因工程的应用
一、基因工程在农牧业方面的应用
1．(人教版选择性必修3 P88正文)野外种植转基因抗A害虫植物的同时，还种植一定量的同种不抗虫植物，可降低抗性害虫在整个害虫种群中所占比例的增加速率。其原因是____________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
二、基因工程在医药卫生领域的应用
1．
2．(人教版选择性必修3 P90正文)利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
2．器官移植：在器官供体的基因组中导入______________________________，以抑制__________________的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合________技术，培育出不会引起____________反应的转基因克隆器官。
三、基因工程在食品工业方面的应用
1．转基因抗病农作物不需要使用农药。 (　　)
2．若仅种植转基因抗虫大豆，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。 (　　)
3．用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实。 (　　)
4．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵作为受体。 (　　)
5．乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。 (　　)
　甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。
(1)利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是基因表达载体的构建，该过程需要选择　　　　　　　　　　限制酶切割甜蛋白基因。
(2)为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交，若子代表型及比例为　　　　　　　　　　　　　，说明2个甜蛋白基因插入了两对同源染色体上(含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相同)。
(4)若在被农杆菌感染成功的玉米细胞中检测到了甜蛋白基因，但没有检测到甜蛋白，分析其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
基因工程的应用
1．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P88图文信息)为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是(　　)
A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D．提高培养基中细胞分裂素和生长素的比值，有利于诱导生根
2．(链接人教版选择性必修3 P91正文及相关信息)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的______________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________________，理由是___________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_______________________________________(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：____________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
考点2　蛋白质工程
一、蛋白质工程的概念
1．基础：蛋白质分子的____________及其与____________的关系。
2．手段：改造或合成基因。
3．结果：对现有蛋白质进行改造或制造出______________。
二、蛋白质工程的基本流程
　
写出流程图中字母代表的含义：
A．________，B．________，C．____________，D．__________，E．____________。
三、蛋白质工程与基因工程的异同
1．区别
项目 蛋白质工程 基因工程
基本思路 或过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果 可生产________________________ 只能生产________________________
2．联系
(1)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
　(人教版选择性必修3 P94图3-17)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
四、蛋白质工程的应用
1．医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
2．其他工业方面：改进______的性能或开发新的____________。
3．农业方面：通过改造某些________________________，以提高植物光合作用效率，增加粮食的产量；通过改造微生物__________________，设计优良微生物农药，防治病虫害。
1．蛋白质工程实施的前提是获取基因与目标蛋白质的结构数据。 (　　)
2．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质。 (　　)
3．蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。 (　　)
4．蛋白质工程常借助计算机建立蛋白质的三维结构模型。 (　　)
　研究人员通过解析Bt抗虫蛋白晶体的结构发现，第5号螺旋处的第168位氨基酸是孔道结构稳定性的关键，将该位点氨基酸替换为疏水性更强的精氨酸后，就有可能提高孔道结构的稳定性。根据这一研究结果，请写出后续利用蛋白质工程培育出抗虫能力更强的转基因棉花的基本思路。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
蛋白质工程的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P94图3-17)科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素(一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质)第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。已知天冬酰胺对应的密码子为AAU、AAC，赖氨酸对应的密码子为AAA、GUA等。下列叙述错误的是(　　)
A．上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B．在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C．上图中大分子物质a和b的单体序列均是唯一的
D．用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
2．(链接人教版选择性必修3 P95正文)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关
B．酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露
C．要获得水蛭素的基因，可以从水蛭细胞中提取mRNA，经逆转录获得目的基因
D．上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构
考点3　生物技术的安全性与伦理问题
一、转基因成果
领域 成果
微生物方面 ①减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的____________ ②构建高产、优质的基因工程菌来生产氨基酸 ③用基因工程菌生产药物
转基因动物方面 ①培育____________、________________的转基因家禽、家畜 ②培育抵抗相应病毒的动物新品种 ③建立某些人类疾病的转基因动物模型
转基因植物方面 培育具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物
1．(人教版选择性必修3 P102相关信息)将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以防止转基因花粉传播的原因是_______________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
二、对转基因产品安全性的争论
三、理性看待转基因技术
1．理性看待转基因技术的前提
(1)清晰地了解转基因技术的________和________规程。
(2)看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和________等因素的影响。
(3)要靠________的证据和________的逻辑进行思考和辩论。
2．我国对转基因技术的态度
(1)研究上要________，坚持自主创新。
(2)推广上要________，做到确保安全。
(3)管理上要________，坚持依法监管。
3．我国相关部门制定了一系列的政策、法规并成立相关机构
(1)维护了消费者对转基因产品的__________和__________。
(2)最大程度地保证了转基因技术和已经上市的转基因产品的__________。
(3)为保障农业转基因生物安全提供重要的技术支撑。
四、关注生殖性克隆人
1．生殖性克隆：指通过________技术产生独立生存的新个体。
2．治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
3．我国__________、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
4．比较试管婴儿和设计试管婴儿
(1)试管婴儿和设计试管婴儿过程(如图所示)
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
项目 试管婴儿 设计试管婴儿
不同点 技术手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断
应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、贫血症等遗传疾病的预防及治疗
相同点 二者都是____________、体外进行早期胚胎培养，再经过______________，从生殖方式上来看都为____________
2．(人教版选择性必修3 P108正文)我国科学家用4种小分子化合物诱导小鼠的成纤维细胞转变成了iPS细胞，这种诱导方法与转入转录因子诱导产生iPS细胞相比，其优点是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
五、禁止生物武器
1．种类：致病菌类、________________、生化毒剂类等。
2．中国政府的态度：在任何情况下____________、__________、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．转基因技术已被用于减少啤酒酵母双乙酰的生成。 (　　)
2．理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 (　　)
3．可以运用重组DNA技术进行生殖性克隆人研究。 (　　)
4．生物武器仅包括病毒类。 (　　)
　科学家运用基因组编辑技术在人类的早期胚胎中修正了与肥厚型心肌病发生相关的基因MYBPC3的突变，使胚胎携带正常MYBPC3基因的概率提高了20%左右。你认为该不该允许对人类胚胎进行基因组编辑的相关研究？请说明理由。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
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生物技术的安全问题
1．(链接人教版选择性必修3 P103－104正文)依据《中华人民共和国生物安全法》，生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。下列叙述错误的是(　　)
A．高致病性微生物必须在高等级生物安全实验室中开展实验活动
B．生物技术可广泛应用在人类自身基因组改造和新物种创造中
C．外来入侵物种可能增加本土食物来源却给自然生态造成破坏
D．动物饲料中的抗生素会通过食物链使人体微生物耐药性增强
生物技术的伦理问题
2．(2023·浙江1月卷)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是(　　)
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
1．(2024·浙江1月卷)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是(　　)
A．试管动物的培育
B．转基因食品的生产
C．治疗性克隆的研究
D．生物武器的发展和生产
2．(2024·黑、吉、辽卷) 将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题：
注：F1—F3，R1—R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是____________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是________________和____________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是____________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是_____________________
_____________________________________________________________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用__________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1 362合成基因序列和1 363-1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
3．(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-______________-3′和5′-______________-3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素____________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是______(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
3 / 15课时分层作业(五十七)　基因工程的应用、蛋白质工程及生物技术的安全性与伦理问题
(建议用时：30分钟；本套共8小题，共30分。第1～5小题，每小题2分；第6～7小题，每小题4分；第8小题12分。)
1．(2024·湖北一模)人乳铁蛋白(hLF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白(hLF)基因转入到山羊体内，从山羊的乳液中获得hLF，可以解决天然人乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是(　　)
A．可用PCR直接扩增乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
2．(2024·湖北武汉模拟)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是(　　)
A．根据题意可知斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B．用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度
C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
3．(2024·江西部分重点中学联考)草甘膦是一种广谱、非选择性的系统性除草剂，通过抑制植物中EPSPS酶的活性，使植物细胞内某些氨基酸不能合成，从而达到除草的目的。为提高小麦对草甘膦的耐受性，科学家将细菌的EPSPS基因转入小麦叶绿体中，得到抗草甘膦转基因小麦。下列相关叙述错误的是(　　)
A．将EPSPS基因导入小麦的叶绿体可避免基因污染
B．EPSPS基因在细菌和小麦中转录形成的mRNA相同
C．可通过喷洒草甘膦来检验转基因小麦是否培育成功
D．转基因小麦中EPSPS酶参与合成的氨基酸数量下降
4．(2024·广东广州二模)科学家将外源抗虫基因(Bt抗虫蛋白基因)转入某茄科植物细胞中，并整合到该植物的线粒体DNA上，获得了具有抗虫性状的转基因植物。下列叙述错误的是(　　)
A．Bt抗虫蛋白在线粒体中的成功合成与密码子的通用性有关
B．叶肉细胞内有多个线粒体，这有利于增加该转基因植物的抗虫性
C．将该转基因植物与同种非转基因植物进行正、反交，所得子代均有抗虫性
D．该技术能有效避免或减少外源基因通过花粉向其他植物的转移
5．(2024·黑龙江哈尔滨二模)人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟，产生巨大生产力的同时，也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述，正确的是(　　)
A．如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用
B．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，其原因之一是人体不会对它们产生免疫反应
C．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造
D．科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉传播造成基因污染
6．(2024·湖南师大附中模拟)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是(　　)
A．引物2的3′端序列应包含XbaⅠ的识别序列
B．重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C．PCR反应时，缓冲液中一般要添加Ca2+来激活相关酶
D．引物1的5′端序列应考虑将GTG改为ATG
7．(不定项)(2024·江西南昌模拟)通过基因工程获取的致病模型动物有助于研究目的基因的特性，在生命科学领域得到广泛应用。利用正常大鼠制备致病转基因模型大鼠的流程如图所示。下列说法中错误的是(　　)
A．构建表达载体时，应选用PstⅠ和SmaⅠ两种限制酶对含致病基因的DNA和质粒进行切割
B．将表达载体导入细胞A中时常用Ca2+处理，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态
C．可通过检测早期胚胎中荧光蛋白的表达情况，对转基因胚胎进行筛选
D．胚胎能在代孕母鼠子宫中存活的生理学基础是早期胚胎细胞保持着细胞全能性
1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ＋0.5
8．(12分)(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶__________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用______________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测__________________________，通过__________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为________。选择纯合子进行后续研究的原因是________________。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是______________________
_________________________________________________(答出两点即可)。
1 / 4课时分层作业(五十七)
1．A　2．B　3．D　4．C　5．D　
6．D　[根据题意可知，含GTG的一端为LDH基因的起始，为保证通过双酶切以正确方向插入质粒，设计引物1的5′端序列需要包含BamHⅠ的识别序列，引物2的5′端序列应包含XbaⅠ的识别序列，A错误；结合题意可知，本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用，B错误；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，C错误；设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达，D正确。]
7．ABD　[构建表达载体时，应选用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶对含致病基因的DNA和质粒进行切割，因为SmaⅠ会切割目的基因，A错误；将表达载体导入微生物时常用Ca2+处理，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的状态，进而提高转化效率，B错误；图中基因表达载体中带有的标记基因是荧光蛋白基因，因而可通过检测早期胚胎中荧光蛋白的表达情况，对转基因胚胎进行筛选，C正确；胚胎能在代孕母鼠子宫中存活的生理学基础是受体子宫对移入的早期胚胎不会发生免疫排斥，D错误。]
8．(每空1分，共12分)(1)水稻胚乳细胞特异性表达的基因的　终止转录过程　HindⅢ　EcoRⅠ　(2)农杆菌转化　r2HN是否转录出了mRNA　抗原—抗体杂交　(3)1/4　遗传性状稳定　(4)体液　细胞　(5)成本低、生物安全性高、不受性别限制、可大量种植等(答出两点即可)
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