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第一章 第2节 微生物的培养技术及应用
第2课时：微生物的选择培养和计数
选择培养基
一
情境一
尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。怎样才能从土壤中众多的微生物中分离出能分解尿素的细菌呢？1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，并从中提取到了耐高温的DNA 聚合酶，这一过程给我们提供了很好的思路
筛选水生栖热菌的条件是什么？为什么该条件能让其“ 脱颖而出”
因为热泉温度为70～80℃，淘汰了绝大多数微生物，只有水生栖热菌被筛选出来。
在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
情境一
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
尿素分子模型
情境一
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外,该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)或完全培养基作为对照,若对照培养基中生长的菌落数多于该选择培养基,则该选择培养基具有选择性。
情境一
选择培养基概述
无氧环境下培养
(1)选择培养基：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
(2)方法：
①在培养基中加入某种化学物质。
②改变培养基中的营养成分。
③改变微生物的培养条件。
厌氧型微生物兼性厌氧型
分离得到酵母菌、霉菌等
加高浓度食盐的培养基
分离得到金黄色葡萄球菌
加入青霉素的培养基
分离固氮菌
分离自养型微生物
不加含碳有机物的无碳培养基
不加氮源的无氮培养基
【任务1】
A.在配制步骤②③的培养
基时，应先调pH后湿热
灭菌
B.步骤③纯化分解尿素的
细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的能力
1.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是（ ）
课堂检测
C
2.如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是（ ）

A.图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
B.图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数
C.图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
D.图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
课堂检测
B
3.某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3供植物吸收和利用。以下说法错误的是（ ）
A.土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶
B.能分解尿素的细菌也能以尿素的分解产物CO2作为碳源
C.为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时应选择尿素作为唯一氮源
D.筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4的作用是提供无机盐和维持pH
课堂检测
B
微生物的选择培养
二
某兴趣小组在从土壤中分离能分解尿素的细菌时，发现土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。相关流程如图所示。回答下列问题：
情境二
单菌落
梯度稀释
涂布平板
接种
②火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀,制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9mL无菌水
90mL无菌水
10g
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
(1)梯度稀释
简述稀释凃布平板法的操作步骤
【任务2】
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照
(2)涂布平板
简述稀释凃布平板法的操作步骤
【任务2】
将平板倒置
30～37℃恒温培养1～2d后进行计数
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
设置空白对照组的目的是什么？
检测培养基灭菌是否彻底，保证实验结果的准确性。
(3)培养与观察
思考:
简述稀释凃布平板法的操作步骤
【任务2】
平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
比较平板划线法与稀释涂布平板法
(1)图A是利用____________(填方法名称)进行微生物接种，图示方法不能用于微生物的计数，原因是
(2)示意图B表示的是 接种培养后得到的结果。用该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目___,原因是？
平板划线法
稀释涂布平板法
少
当两个或多个细胞连在一起时,培养基 上观察到的往往只是一个菌落
A
B
【任务2】
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作
注意事项
菌体获取
优点
缺点
(3)列表比较
接种环在固体平板培
养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保试验成功可以增加稀释度的范围
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
比较平板划线法与稀释涂布平板法
【任务2】
1.平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列叙述正确的是（ ）
A.采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往多于实际的活菌数
B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面
C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养
D.与平板划线法相比，稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好
课堂检测
D
2.原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是（ ）
A.应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B.配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C.将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D.在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
课堂检测
C
微生物的数量测定
三
情境三
三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中尿素分解菌数量。在对应稀释倍数为106的培养基中，取0.2ml稀释液涂布，得到以下统计结果：
甲同学:涂布了1个平板，统计的菌落数是260；
乙同学:涂布了三个平板，统计的菌落数是220、240和230，取平均值230；
丙同学:涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
(2)计数原则：
(1)原理：
活菌
活菌
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
阐明稀释涂布平板法的原理、原则、公式
【任务3】
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
(3)计算公式:
乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是220、240和230，取平均值230；
每克样品中的菌落数=平板上菌落数的平均值÷体积×稀释倍数=230÷0.2×106=1.15×109；
阐明稀释涂布平板法的原理、原则、公式
【任务3】
在对培养液中的尿素分解菌数量进行计数时，另一兴趣小组采用了血细胞计数板直接计数法。若某同学吸
取培养液制成装片后，在显微镜下
进行计数。图1是一块规格为1mm
×1mm×0.1 mm的血细胞计数板
正面示意图，观察到如图2所示
(1)图1这块血细胞计数板上有______个计数室，计数室长和宽各为 ，
深度为 ，其容积为 ,即0.1μL。
(2)图2表示显微镜下看到的大方格中含有中方格的情况，若计数得每一中方格里酵母菌平均数为20个,则1mL该培养液中共含有尿素分解菌约________个。
情境四
2
5×106
1mm
0.1mm
0.1mm3
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
利用特定的____________或 ____________
在__________下观察、计数，然后再计算
__________的样品中微生物的数量；
(1)原理：
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
(2)优点：
(3)缺点：
快速、直观
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
总结显微镜直接计数法的原理、优缺点及计算公式
【任务4】
=
80
×400×104×稀释倍数
A1+A2+A3+A4+A5
1mL样品中酵母菌数=
A1+A2+A3+A4+A5
80
×400÷0.1mm3×稀释倍数
A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。
25×16型
A1
A2
A3
A4
A5
1mm3=10-3mL
(4)计算公式
总结显微镜直接计数法的原理、优缺点及计算公式
【任务4】
=
100
×400×104×稀释倍数
A1+A2+A3+A4
16×25型
A1
A2
A4
A3
1mL样品中酵母菌数=
A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。
A1+A2+A3+A4
100
×400÷0.1mm3×稀释倍数
1mm3=10-3mL
(4)计算公式
总结显微镜直接计数法的原理、优缺点及计算公式
【任务4】
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板 或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M
　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数
缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
结果 比实际值偏大 比实际值偏小
微生物的计数方法比较
【任务5】
1.养殖池中存在的有毒物质主要是氨及亚硝酸，这两种物质可由硝化细菌吸收利用。在“养殖池底泥中硝化细菌的分离和计数”实验中，下列说法正确的是（ ）
A.需要配制添加一定浓度铵盐的牛肉膏蛋白胨培养基，以筛选硝化细菌
B.对采集底泥使用的工具进行灭菌,全部接种过程均需在酒精灯火焰旁进行
C.采用平板划线法进行分离和计数时,还需与未接种的空白培养基同时培养
D.若空白对照组上长出了菌落，需要在实验组数据的基础上减去空白对照组的菌落数
课堂检测
B
2.下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的叙述，不正确的是( )
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死
菌与活菌
B.两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但产生差异的原
因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进
行计数
课堂检测
C
对点训练
3.某研究小组为了探究覆盖保鲜膜对西瓜表面微生物的种类和数量的影响，他们将覆盖保鲜膜保存了三天的西瓜的瓜瓤制备成浸出液，再将浸出液接种到培养基平板上进行观察。下列说法正确的是( )
A.应用液体培养基接种浸出液进行培养
B.应采用平板划线法对浸出液进行计数
C.每组至少设置三个平板，确保实验结果的准确性
D.只需要设置未接种瓜瓤浸出液的空白平板作对照
课堂检测
C
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
四
上表是分离土壤中分解尿素细菌的两种培养基配方，为达到实验目的，本实验应选择培养基 (填“A”或“B”)，原因是？
培养基 A KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 H2O 1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g 1000mL 培养基 B 纤维素粉 NaNO3 Na HPO4·7H2O KH2PO MgSO4·7H2O KCl 酵母浸膏 H2O
5g 1g 1.2g 0.9g 0.5g 0.5g 0.5g 1000mL
情境五
培养基A以尿素为唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生长繁殖
A
1.提出问题：
(1)土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
(2)每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以分离。
2.做出假设：
3.实验原理：
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
菌落计数
4.实验步骤：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
提供无机盐；调节pH
②制备牛肉膏蛋白胨培养基
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
B
A
C
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
土壤取样
选择培养基（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
土壤取样
判断选择培养基是否具有筛选作用
设置两个空白对照
以验证培养基中是否含有杂菌
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。
若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
①培养：
②观察：
根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。
b．记录菌落的特征：
包括菌落的形状、大小和颜色等。
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
土壤取样
稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
菌落数/平板
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数:
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
土壤取样
5.结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污 染的判断
选择培养基 的筛选作用
样品的稀 释操作
重复组的结果 对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
若选取同一种土样，统计结果应接近
得到的菌落不一定是分解尿素的细菌，还需要进一步的鉴定
过渡
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
6.进一步探究
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
6.进一步探究
鉴别培养基
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理
用途
举例
图示
加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质
加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
培养、分离出目标微生物
鉴别不同的微生物
培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并有金属光泽)
探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【任务6】
1.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，不正确的是（ ）
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不
会使酚红指示剂变红
对点训练
课堂检测
B
2.在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是（ ）
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题
B.将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
可以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，
则可以证明甲同学无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
课堂检测
D
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
本节小结

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