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第2节 微生物的基本培养技术
（第1课时）
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
酸奶
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
一、微生物概述
1.微生物的概念：
_________________________的统称。
包括_______________________________等
2._____________，_______________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
3.实验室培养微生物的条件：
①要为人们需要的微生物提供合适的___________条件；
②要确保__________________，并将需要的微生物分离出来。
营养和环境
其他微生物无法混入
难以用肉眼观察的微小生物
细菌、真菌、病毒及一些原生生物
人们按照__________________________，配制出供其生长繁殖的营养基质，即培养基。
二、培养基的配制
1.培养基的概念
微生物对营养物质的不同需求
2.培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3.培养基类型：
液体培养基
固体培养基
菌落
不含凝固剂（如琼脂）
在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一
呈液态状态
微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长形成肉眼可见的菌落
补充资料：培养基的类型及用途
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
4、培养基的营养构成:
（1）基本成分：
水、碳源、氮源、无机盐。
碳源
无机碳源：
有机碳源：
氮源
NH4＋、NO3-、NH3等。
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。
CO2、CO32-、HCO3-。
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。
无机氮源：
有机氮源：
来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质
无机盐
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
大量元素：
微量元素：
Ca、K 、Mg等
牛肉膏、蛋白胨：
自养微生物
异养微生物
注意：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。如氨基酸等。
为什么培养基需要氮源？培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。（2）特殊需求：
满足微生物对 ______________________的需求
④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；
②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；
③培养细菌时，需要将培养基调至_____________；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
例：某种细菌培养基的营养构成
pH、特殊营养物质、氧气
三、无菌技术
2.手段：
主要包括____和____，主要包括两个方面：
（1）对实验操作的____、操作者的________，进行清洁和消毒。
（2）将用于微生物培养的____、________和______等进行灭菌。
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
消毒
灭菌
空间
衣着和手
器皿
接种用具
培养基
1.获得纯净的微生物培养物的关键是 。
防止杂菌污染
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
3.消毒
（1）概念：
指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
（2）常用的消毒方法
①煮沸消毒法：
100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：
62～65℃下消毒30 min或80～90℃处理30s～1min
适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
③化学药剂消毒法:
④紫外线消毒法：
接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
4.灭菌
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
（2）常用的灭菌方法
①湿热灭菌：
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。
高压蒸汽灭菌效果最好，100 kPa、121℃下维持15～30min，
工具为高压蒸汽灭菌锅，常用于培养基、无菌水等的灭菌。
②干热灭菌：
将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160～170℃的热空气中维持2～3h。常用于耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）、金属用具等。
③灼烧灭菌：
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧，可以迅速彻底地灭菌。适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位
③灼烧灭菌：
四、微生物的纯培养
1.概念：
（1）培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
（2）纯培养物：
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
（3）纯培养：
获得纯培养物的过程
微生物的纯培养包括_____ ______、__ __、
____、__ __
①配制培养基
②灭菌
③接种
④分离和培养
2.步骤：
探究·实践·酵母菌的纯培养1.培养原理菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。微生物群分散或稀释单个细胞单个菌落繁殖2.获得单菌落的方法：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。（1）制备培养基：
①配制培养基：
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
②灭菌：
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。
培养基灭菌：
高压蒸汽灭菌锅
探究·实践·酵母菌的纯培养
3.方法步骤
将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
培养皿灭菌：
①拔出锥形瓶的棉塞
②将瓶口迅速通过火焰
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
倒平板的具体操作步骤
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
③倒平板
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
问题讨论
（2）接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作(平板划线法)，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线
注意：不要将最后一次的划线与第一次的划线相连
平板划线法的具体划法
注意：
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前接种环进行灭菌；
④划线后,培养皿倒置培养。
1
2
3
4
5
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上原有微生物杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者（3）培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。
4.结果分析与评价
（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
（2）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
（3）你是如何记录实验结果的？
提示：可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等
评估论点的可信程度
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
1.下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量2.下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是(　　)A.灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子B.灭菌和消毒实质上是相同的C.接种环用灼烧法灭菌D.常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等D课堂练习B编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 。
自养型微生物
含碳有机物
3：右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
固氮微生物

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