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第2节 微生物的选择培养和技术
（第2课时）
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
科学家们应用______________________解决了这一难题。
选择性培养基
1.筛选菌株--科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园的热泉
美国黄石公园
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
一、选择培养基
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2.筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
3.实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
3.选择培养基：
4.选择培养基配方的设计（以筛选分解尿素的细菌的培养基为例）
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
（1）设计原理：
能合成脲酶的细菌才能分解尿素，配制以尿素为唯一氮源的选择培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
（2）鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高使指示剂变红，说明该细菌能分解尿素
1.如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基，该培养基用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
讨论：
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
该培养基与普通培养基相比较，区别只是该培养基用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
稀释涂布平板法
1.原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
二、微生物的选择培养
2.实验具体操作
（1）配制培养基：以尿素为唯一氮源的选择培养基
（2）土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中（取土样小铲和盛土样信封使用前要灭菌）
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
（3）样品梯度稀释：
微量 移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
① 在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
③ 分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
② 取6支试管，分别加入9ml无菌水。
滴
1、取0.1ml稀释液 ，滴加到培养基表面
灼
3、将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
涂
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
（4）取样涂布平板：
2、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
浸
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入37℃恒温箱中培养1～2d
（5）培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目
三、微生物的数量测定
（一）间接计数法——稀释涂布平板法
1.原理：在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
2.计数原则
（1）选择菌落数为_________的平板计数；
（2）____稀释度下，应______对___个平板进行重复计数， 然后求出________；
30-300
同一
至少
3
平均数
3.结果分析
（1）统计的菌落数往往比活菌实际数目____；
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
（2）统计结果一般用_________而不是用活菌数来表示
少
菌落数
4.计算
每g样品中的细菌数=______________
C:某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；
V:涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；
M:稀释倍数；
现学现用：
某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109
C. 234 D. 23.4
B
（C÷V）×M
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
实例分析：
2.计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数x400x104x稀释
倍数。
统计结果一般是______ ____________ ，
（二）直接计数法——显微镜直接计数
1.原理
利用特定的____ ______或_______ _____在___ __ _下观察、计数，然后再计算___ _____的样品中微生物的数量；
*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
快速直观
活菌数和死菌数的总和
3.优点：
4.缺点：
造成统计值比实际值
偏大
即不能区分死菌与活菌
1.实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_______的细菌
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤生长
②取样过程：铲去表土（一般3cm左右）
*细菌绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌
操作完成后，一定要洗手
（2）制备培养基
①选择培养基
*以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基
*作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
（3）样品的稀释与涂布平板
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
另外，整个实验还要设置2个平板，是哪两个？目的？
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基；
以验证培养基中是否含有杂菌；
（3）样品的稀释与涂布平板
②不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
*测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养
思考：
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30-300的平板进行计算。
（3）样品的稀释与涂布平板
③注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
*细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
操作提示
2）无菌操作
3）做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记
4）制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊
1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
（5）结果分析
①说出下列各组培养基的目的：
接种的选择培养基：
____________________________________________
接种的牛肉膏蛋白胨培养基：
____________________________________________
不接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基：
____________________________________________
对土壤中分解尿素的细菌分离和计数
判断选择培养基是否具有选择作用
验证培养基中是否含有杂菌
（5）结果分析
②说出以下现象对应的结果分析
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
③样品稀释操作成功的标志是什么？
得到2个或2个以上菌落数在30-300的平板
不一定，还需要进一步的鉴定
④得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定
1.原理
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌；
2.方法
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
*液体培养基可以直接看液体的变色情况；
*固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带；
*红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种
②都是在固体培养基上进行的
五 平板划线法与稀释涂布平板法比较

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