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第二章 第2节 动物细胞工程
第2课时：动物细胞融合技术与单克隆抗体
去壁
去壁
融
合
再生
新壁
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合技术
植物组织培养技术
A细胞
A原生质体
B细胞
B原生质体
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
愈伤组织
杂种植株
细胞膜的流动性
植物细胞的全能性
知识回顾
动物细胞融合技术
一
情境一
人乳头状瘤病毒（HPV）与宫颈癌的发生密切相关,抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV,从而及时监控宫颈癌的发生。如图是以HPV衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程
单克隆抗体制备运用动物细胞融合技术，阅读教材48页，回答以下问题
A
小鼠
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交髓瘤细胞Ⅰ
融合
筛选①
筛选②
杂交髓瘤细胞Ⅱ
扩大培养
单克隆抗体
(1)概念：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
(2)结果：
形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
(3)原理：
细胞膜具有一定的流动性
(4)诱导融合的常用方法：
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
动物细胞融合
细胞膜的流动性
细胞增殖
动物细胞培养
从以下方面阐明动物细胞融合技术
【任务1】
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
1.什么是病毒的灭活？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
诱导融合的常用方法
相关信息
病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
2.灭活病毒诱导细胞融合的原理
诱导融合的常用方法
相关信息
(5)意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
(6)应用：
①细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
②利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
从以下方面阐明动物细胞融合技术
【任务1】
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
动物细胞融合技术与植物体细胞杂交的比较
【任务2】
1.与植物体细胞杂交相比，动物细胞融合的原理及其特有的诱导方法分别是( )
A.细胞膜的流动性、离心
B.细胞膜的流动性、灭活病毒诱导法
C.细胞的全能性、电融合法
D.细胞的全能性、灭活病毒诱导法
课堂检测
B
2.下列关于动物细胞融合技术的叙述，错误的是( )
A.细胞融合技术能应用于细胞遗传、细胞免疫等研究
B.动物细胞融合的成功是细胞膜具有流动性的有力证据
C.动物细胞融合的基本原理与植物原生质体融合的基本原理不同
D.除了化学法和物理法外，动物细胞融合还可以由灭活病毒诱导
课堂检测
C
3.如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是( )
A.若a细胞和b细胞是植物细胞，需先脱分化再诱导融合
B.a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现
C.c细胞的形成与a、b细胞的全能性有关
D.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因
课堂检测
B
单克隆抗体的制备
二
图中向小鼠注射的A是____________,为产生 ,传统产生抗体的方法是反复给小鼠注射A，然后从血清中分离所需抗体，用这种方法生产抗体的缺点是________________________。要获得大量单一抗体,不能通过直接培养B淋巴细胞,原因是_________________________________。也不能直接培养骨髓瘤细胞，因为 。
情境二
人乳头状瘤病毒（HPV）与宫颈癌的发生密切相关，抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV，从而及时监控宫颈癌的发生。如图是以HPV衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程，请据图回答：
A
小鼠
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交髓瘤细胞Ⅰ
融合
筛选①
筛选②
杂交髓瘤细胞Ⅱ
扩大培养
单克隆抗体
HPV衣壳蛋白
产量低、纯度低、特异性差
能无限增殖，但不能分泌抗体。
浆细胞能分泌抗体，但不能大量增殖
特定抗体的B淋巴细胞
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
情境二
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒，利用经抗原免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生的细胞制备出了单克隆抗体。他们因为这一贡献，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？
会有几种细胞融合方式？
有几次筛选过程？目的是什么？
如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
结合图2-16: 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图，尝试构建制备单克隆抗体的模型，并思考以下问题：
构建制备单克隆抗体的模型
【任务3】
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的淋巴B细胞
构建制备单克隆抗体的模型
【任务3】
022杂交瘤细胞(多种)13置于特定的选择性培养基上培养第一次筛选融合的细胞：BBBB1瘤瘤瘤瘤B2瘤B3瘤第一次筛选：用特定的选择培养基在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长共有5种细胞。其中融合的细胞有3种。构建制备单克隆抗体的模型【任务3】
02
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
(抗原-抗体杂交技术)
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞(多种)
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
02
构建制备单克隆抗体的模型
【任务3】
02体外培养单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔02构建制备单克隆抗体的模型【任务3】
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
【第一次筛选】获得杂交瘤细胞
知识拓展
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞(A)
合成DNA
D途径
S途径
D途径
氨基喋呤
A、B、AA、BB、
AB1、AB2、AB3
请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？
培养基中加入氨基蝶呤。


AB1、AB2、AB3 ……
专一抗体检验阳性：有限稀释法、抗原-抗体杂交法
将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板,如果稀释度足够高,多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞,克隆化培养后,用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体(抗原抗体能结合即为阳性孔),这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选,就能选出需要的那种杂交瘤细胞。
【第二次筛选】能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
知识拓展
克隆化培养
有限稀释法
阳性孔
抗体检测板
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞（免疫）
骨髓瘤细胞
杂交细胞
杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
诱导融合
选择培养基
克隆化培养，专一抗体检验
体外培养或小鼠腹腔内增殖
特异性强
灵敏度高
可大量制备
既能大量繁殖又能产生专一抗体
02
构建制备单克隆抗体的模型
【任务3】
单克隆抗体的制备过程
1.如图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。下列叙述错误的是( )
A.反复给小鼠注射甲的目的是让小鼠体内产生更多的抗体
B.人工诱导细胞融合获得乙的常用方法是用灭活病毒诱导法
C.丁细胞既能无限增殖又能产生抗甲抗原的抗体
D.制备的单克隆抗体可以早期诊断人体胃癌的发生情况
课堂检测
A
A.以提纯的病毒A作为抗原对小鼠甲进行免疫
B.单细胞悬液可由小鼠甲的脾脏用解离液分散成单个细胞制得
C.制备过程中筛选1和筛选2的原理和目的均不相同
D.制备成功的单克隆抗体可用于检测田间西瓜是否感染病毒A
2.病毒A常导致多种瓜类发病或减产，如图为制备抗病毒A单克隆抗体的部分过程，下列有关叙述错误的是( )
课堂检测
B
单克隆抗体的应用
三
为降低人类乳腺癌治疗药物的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体一药物偶联物（ADC），过程如下图所示。
情境三
【任务4】
ADC的抗体和药物各具有什么作用？
除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
阅读教材“思考 讨论” ，思考讨论并回答前3题。
单克隆抗体的应用
思考 讨论
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
提示：
2. 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗
提示：
单克隆抗体的应用
思考 讨论
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
提示：
单克隆抗体的应用
思考 讨论
4. 单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题,出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识
单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
提示：
1.单克隆抗体的优点
(1)能准确地识别抗原的细微差异；
(2)与特定抗原发生特异性结合；
(3)可以大量制备。
抗原-抗体杂交法
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
在妊娠第8天就可以作出诊断，比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
(1)诊断试剂——最广泛应用
2.单克隆抗体的应用
(2)运载药物
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC（抗体-药物偶联物）
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
2.单克隆抗体的应用
单克隆抗体+同位素（荧光标记）
在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
(2)运载药物
结合荧光标记的单克隆抗体药物
结合同位素的单克隆抗体药物
(3)直接用于治疗疾病。
2.单克隆抗体的应用
1.使用高效的细胞毒素药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时
还会对健康细胞造成伤害。这
限制了它在临床上的应用。抗
体一药物偶联物（ADC）通过
将细胞毒素与能特异性识别肿
瘤抗原的单克隆抗体结合，实
现了对肿瘤细胞的选择性杀伤
ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如图所示。下列叙述正确的是（　　）
A．单克隆抗体制备过程中需要使用Taq酶
B．ADC进入肿瘤细胞的运输方式为协助扩散
C．溶酶体破裂导致其中的水解酶释放，加速了肿瘤细胞死亡
D．细胞毒素具有与肿瘤细胞膜上的糖蛋白发生特异性结合的能力
课堂检测
C
2 . 单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等优点，被广泛用作诊断试剂。下图是医学上常用的定量检测抗原含量的“双抗体夹心法”示意图。将过量的固相抗体固定在某种固相载体表面上，加入抗原，再加入酶标抗体，洗脱未结合的酶标抗体，最后加入无色底物，该底物在酶标抗体上酶的催化作用下形成产物，通过产物（有色）量反映抗原量。下列说法正确的是（ ）
课堂检测
A．固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合，这是由于两者结构相同
B．实验过程所加入的抗原、酶标抗体、底物均应过量
C．反应体系最终呈现的颜色深浅与抗原量呈负相关
D．加入酶标抗体的目的是通过测定酶促反应产物量来判断待测抗原量
D
本节小结
动物细胞融合技术与单克隆抗体
原理
方法
动物细胞融合技术
细胞膜具有流动性
物理法、化学法、生物法
单克隆抗体
获取已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞→融合、筛选→杂交瘤细胞→动物细胞培养→提取单克隆抗体
制备
应用
诊断试剂;治疗疾病;运载药物

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