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第三章 第2节 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取、基因表达
载体的构建
第1课时
培育转基因抗虫棉的四个步骤
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
过渡
从社会中来
目的基因的筛选与获取
一
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这里的“杀虫基因”就是目的基因
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
导入
抗虫棉
培育
棉花细胞
目的基因
核DNA
情境一
阅读P76，思考并回答以下问题：
【任务1】
什么是目的基因
如何筛选适合的目的基因
目的基因
1
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)实例：
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(1)概念：
(抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因)
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
筛选适合的目的基因
2
(1)明确目的基因的方法：
①从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
①通过构建基因文库来获取目的基因
前提：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
③利用PCR特异性地快速扩增目的基因
②人工合成目的基因
方法：
筛选适合的目的基因
2
(2)获取目的基因的方法
蛋白质的
氨基酸序列
mRNA的
核苷酸序列
基因的
核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
PCR的概念和原理
利用PCR获取和扩增目的基因需要哪些条件？
PCR反应的基本过程是怎样的 ？
阅读教材P77-79，结合图3—5，回答以下问题：
3
利用PCR获取和扩增目的基因
【任务2】
提取
？
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
3
(1)PCR——聚合酶链式反应的概念、原理
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
①概念：
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
DNA半保留复制
②原理：
3
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA模板
引物(2种)
四种脱氧核苷酸
(2)基本条件
3
利用PCR获取和扩增目的基因
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
(dNTP)
提供DNA复制的模板
合成子链DNA的原料
脱氧核糖
磷酸基团
含N碱基
Taq DNA聚合酶
稳定的缓冲溶液
(2)基本条件
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
3
利用PCR获取和扩增目的基因
使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
一般添加Mg2+
耐高温的DNA聚合酶
催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链
(3) PCR反应过程
3
利用PCR获取和扩增目的基因
5'
3'
5'
3'
变性
复性
延伸
90℃以上，双链DNA解聚为单链
50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
5'
3'
5'
3'
待扩增的DNA片段（模板）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
Taq酶
引物1
引物2
5'
3'
3'
5'
(4)PCR的结果：
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）
指数
2n
(5)PCR产物的鉴定：
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
3
利用PCR获取和扩增目的基因
图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
1.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。
不是完整的模板DNA分子；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
分析PCR扩增技术：
【任务3】
2. 图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
第3轮；1/4。
分析PCR扩增技术：
【任务3】
4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。
第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效
3.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
分析PCR扩增技术：
【任务3】
5.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
6.如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
共需消耗2n－1对引物。
分析PCR扩增技术：
【任务3】
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
第1次
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
第2次
3’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
第3次
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
第4次
1个
3个
4个
1个
3个
4个
分析PCR扩增技术：
【任务3】
1.下列有关获取目的基因的叙述，错误的是（ ）
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
课堂检测
A
2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是（ ）
A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧
核苷酸连接到3′端
B.在第三轮循环产物中开始出现两条
脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，
则不能有效扩增目的基因
D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
课堂检测
D
基因表达载体的构建
二
游离的“杀虫(基因)”直接进入棉花细胞，一般会被分解，就算能表达，也不能随细胞分裂进行增殖，导致子代无该基因，若游离DNA能整合到染色体DNA上，或者能在细胞内独立稳定存在，能自我复制，则该游离DNA会随着细胞分裂传给子代
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
直接导入
抗虫棉
培育
棉花细胞
核DNA
情境二
×
基因表达载体
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
将Bt基因送人受体细胞的载体需要具备什么条件
要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达 和发挥作用，载体还需要哪些结构？
阅读教材P80，思考讨论以下问题：
【任务4】
不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。
1
基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
将Bt基因送人受体细胞的载体需要具备什么条件
2
基因表达载体的组成
位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
位于基因的下游；终止转录
作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而筛选出含有目的基因的受体细胞
抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。
如
Bt基因在受体细胞中稳定存在，并表达和发挥作用，载体需要哪些结构？
标记基因
启动子
插入目的基因
终止子
复制原点
限制酶切割位点
能控制表达所需要的特殊性状
DNA复制的起始位点
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
3
基因表达载体的构建
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
1.使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况
分析基因表达载体的构建
【任务5】
启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达
2.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
标记基因
启动子
插入目的基因
终止子
复制原点
限制酶切割位点
分析基因表达载体的构建
【任务5】
3. 限制酶的选择原则
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(1)不破坏目的基因原则：
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
分析基因表达载体的构建
【任务5】
(3)确保出现相同黏性末端原则：
3. 限制酶的选择原则
与只使用PstⅠ相比较，使用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
分析基因表达载体的构建
【任务5】
1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ）
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核
苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因
等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因
的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
课堂检测
B
A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
2.某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是（ ）
课堂检测
C
3.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示，请回答下列问题：
课堂检测
(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于___________。
基因重组
(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能_______，也不能____________
____________________。
复制
表达(或合成
抗盐基因的mRNA)
(3)在构建重组质粒时，应选用________________两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
SalⅠ和HindⅢ
(4)如图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。
氨苄青霉素
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有____________、______________________________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是_______ (填图2中的数字)菌落中的细菌。
四环素(或氨苄青霉素和四环素)
4和6
本节小结
目的基因的筛选与获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选
利用PCR获取和扩增目的基因
基因表达载体的构建
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点

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