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第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术。
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
1.原理：
2.操作对象：
3.操作水平：
4.结果：
5.意义：
重组DNA技术
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
过渡
DNA
DNA切割
DNA拼接
害虫死亡
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微
小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
DNA导入
基因工程的工具酶
一
图中①表示 ，该过程需要的操作工具是____________。
1997 年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到 2015 年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100 多个，减少农药用量 40 万吨，增收节支社会经济效益 450 亿元。抗虫棉培育过程如下图所示：
情境一
目的基因
限制酶
阅读P71，图3-3结合思考以下问题：
【任务1】
限制酶的作用特点有哪些
两种限制酶切割DNA片段后产生的末端有什么不同
主要是从原核生物中分离纯化来的
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(1)来源：
(2)作用：
1.限制性内切核酸酶—分子手术刀
磷酸二酯键
EcoR I
识别序列为 GAATTC
切割部位为 GA之间
黏性末端
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
①产生黏性末端
G
C
A
A
T
T
T
A
T
A
C
G
5'
3'
3'
5'
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
1.限制性内切核酸酶—分子手术刀
(3)限制酶的作用结果：
Sma I
识别序列为 CCCGGG
切割部位为 CG之间
平末端
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
②产生平末端
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
5'
3'
3'
5'
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
1.限制性内切核酸酶—分子手术刀
(3)限制酶的作用结果：
(1)限制酶 (填“能”或“不能”)切
割原核细胞自身的DNA，试推测其理由是 。
1.BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。探究下列问题：
限制酶 BamHⅠ BclⅠ
识别序列及切割位点
分析限制酶的作用特点
【任务2】
不能
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了
(2)若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成 个片段，共断裂 个磷酸二酯键。
(3)请画出BclⅠ切割后产生的末端 。
(4)BamHⅠ和BclⅠ切割后产生的黏性末端能否被DNA连接酶连接 ？说明你的理由 。
能
二者切割后产生的黏性末端相同，可被DNA连接酶连接
1.BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。探究下列问题：
限制酶 BamHⅠ BclⅠ
识别序列及切割位点
分析限制酶的作用特点
【任务2】
3
4
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
旁栏思考题
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制酶名字的由来
资料卡
图中②表示 ,该过程需要限制酶和 。
1997 年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到 2015 年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100 多个，减少农药用量 40 万吨，增收节支社会经济效益 450 亿元。抗虫棉培育过程如下图所示：
情境一
基因表达载体的构建
阅读P72，图3-3结合思考以下问题：
【任务3】
DNA连接酶的作用 DNA连接酶的种类？
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
2. DNA连接酶
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
2. DNA连接酶
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
比较与DNA相关的几种酶
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位
作用对象
作用结果
模板
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
DNA
单个的脱氧核苷酸
将两个DNA片段连接成重组DNA分子
切割DNA分子形成黏性末端或平末端
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
不需要
需要
1.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（ ）

A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
课堂检测
D
2.DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是（ ）
A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B.DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D.有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
课堂检测
A
3.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是（ ）
A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
课堂检测
B
4.下列关于如图所示黏性末端的说法，错误的是（ ）

A.DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
B.甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的
C.切割甲的限制酶也能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
D.甲、乙黏性末端可形成重组DNA分子
课堂检测
C
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制
(1)作用：
动植物病毒
噬菌体
(2)种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
3.基因进入受体细胞的载体
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
3.基因进入受体细胞的载体
条件 原因 图示
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
可携带多个或多种外源基因
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因
无毒害作用
(3)载体需具备的条件：
重组DNA分子
思考 讨论
【动手实践】
请利用两张纸，按照P73页，思考讨论”重组DNA”的要求完成操作，并完成讨论题：
剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
重组DNA分子
思考 讨论
剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
1.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是（ ）
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随
后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
课堂检测
D
2.下列有关基因工程中载体的说法,正确的是（ ）
A.基因工程中使用的载体只有质粒
B.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C.噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D.天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
课堂检测
B
DNA的粗提取与鉴定
二
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、提取的基本思路
二、实验原理：
1.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，
能溶于2mol/L NaCl溶液。
3.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现
蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
注意：
1.选材：
三、材料用具
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
2.试剂：
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
试剂 作用
研磨液
体积分数为95%的酒精
2mol/L 的NaCl溶液
二苯胺试剂
蒸馏水
三、材料用具
称取30g洋葱,切碎,然后放入研钵中,倒入10mL研磨液,充分研磨
四、方法步骤：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
纱布
酒精
取材研磨
过滤
分离
鉴定
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。(或离心后，取上清液)
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
研磨葱
四、方法步骤：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
取材研磨
过滤
分离
鉴定
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分(或用离心法取沉淀物)
搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
酒精预冷的作用：
低温抑制核酸水解酶活性，抑制DNA降解；
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
组别 试剂 处理 结果
对照组
实验组
四、方法步骤：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
取材研磨
过滤
分离
鉴定
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。
2mol/L的NaCl溶液5mL
2mol/L的NaCl溶液5mL
4mL的二苯胺试剂
4mL的二苯胺试剂
丝状物或沉淀物
1.以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止__________。
2.加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧_______________，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
血液凝固
DNA分子的断裂
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
五、操作提示
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
1.利用动物细胞提取DNA时，破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接使其_________。
2.不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
3.提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精__________更佳。
4.实验中进行了2次静置或离心，目的是将_______和__________分开，第1次操作后，DNA存在于_____________中；第2次操作后DNA存在于_________________或______________中。
吸水涨破
提纯效果
DNA
杂质分子
上清液
析出的白色丝状物
离心管沉淀
六、关键点拨
视频：DNA的粗提取与鉴定
1.如图为DNA的粗提取与鉴定实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A.将图1中的研磨液过滤后保留沉淀
B.图2过程中，用玻璃棒进行交叉搅拌会使DNA析出更快
C.图2析出得到的白色丝状物只能溶于2 mol/L的NaCl溶液中
D.图3对提取后的DNA进行鉴定，两支试管中均要加入二苯胺试剂
课堂检测
D
2.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
课堂检测
B
3.下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B.DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
C.新鲜的洋葱和猪肝可作为实验材料提取DNA，而菠菜不能用于提取
DNA
D.鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴
课堂检测
B
本节小结
分子手术刀:限制性内切核酸酶
重组DNA技术的基本工具
分子缝合针:DNA连接酶
分子运输车:基因进入受体细胞的载体
作用部位
磷酸二酯键
质粒
动植物病毒
噬菌体

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