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密 ○ 封 ○ 装 ○ 订 ○ 线 密 ○ 封 ○ 装 ○ 订 ○ 线
密 封 线 内 不 要 答 题
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姓名 班级 考号
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第十二单元　基因工程（一）
满分45分,限时25分钟
考点1 DNA的粗提取与鉴定 考点2 基因工程的基本工具及基本操作程序
一、选择题(本题共5小题,共20分。每题只有一项符合题目要求,每题4分。)
1.限制酶、DNA连接酶等的发现为DNA分子的切割、连接及基因表达载体的构建创造了条件。下列叙述正确的是(　　)
A.限制酶在原核细胞内的主要作用是切割修剪自身的DNA
B.噬菌体、动植物病毒均可作为载体将外源基因导入受体细胞
C.用作载体的质粒DNA分子上可以不含有限制酶切割位点
D.DNA连接酶可连接DNA分子两条链中碱基对之间的氢键
2.下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是(　　)
A.PCR反应中,复性阶段需要DNA连接酶连接磷酸二酯键
B.PCR反应中,延伸阶段需要反应体系中的ATP提供能量
C.电泳时,DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA的大小和构象等有关
D.电泳时,将PCR产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔
3.下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是(　　)
A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B.DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于2 mol/L的NaCl溶液
C.在研磨植物细胞时加入研磨液是为了溶解细胞壁
D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后立即呈蓝色
4.在青霉素的生产过程中人们发现青霉素发酵过程是高耗氧过程,为了保证在发酵过程中给微生物持续高效供氧,科学家们将人的血红蛋白基因转入产黄青霉中制备了用于生产青霉素的工程菌,下列相关叙述错误的是(　　)
A.可以利用PCR技术从人的基因组中扩增出血红蛋白基因,在PCR反应体系中至少需要3次扩增才能获得所需基因
B.用于构建基因表达载体所用的质粒往往取自细菌或病毒体内
C.构建基因表达载体时需要用到限制酶和DNA连接酶
D.为检测转基因的产黄青霉是否培育成功需要进行分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定
5.科研人员为了培育出能分泌人白细胞介素-2(IL-2,一种糖蛋白)的酵母菌,先利用图示IL-2基因和质粒pPIC9K构建重组质粒,然后将重组质粒导入酵母菌GS115(组氨酸缺陷型菌株)中,最终在特定的选择培养基中筛选获得了目的菌株。下列相关叙述错误的是(　　)
A.构建重组质粒时,不能使用限制酶SacⅠ、AvrⅡ和SnaBⅠ
B.筛选时,能在不含组氨酸的培养基上生长繁殖的酵母菌都含目的基因
C.质粒pPIC9K上存在可以被RNA聚合酶识别并结合的DNA片段
D.若将重组质粒导入大肠杆菌,获得的工程菌不能产生有活性的IL-2
二、选择题(本题共2小题,共12分。每题有一项或多项符合题目要求,全部选对的得6分,选对但不全的得2分,有选错的得0分。)
6.抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
7.研究人员通过PCR扩增质粒pDNR-LIB中的sacB基因,该基因的产物对蔗糖敏感,是一种常见的反选择标记基因。TetA是四环素抗性基因,利用基因工程将sacB基因插入质粒pAH162上,构建含有TetA-sacB双重选择系统的重组质粒,即pAH162-sacB,具体过程如图所示。将pAH162-sacB导入大肠杆菌验证其双重选择作用。下列分析错误的是(　　)
A.将sacB基因插入pAH162上需要的限制酶是BamHⅠ、EcoRⅠ
B.需用Ca2+处理大肠杆菌细胞使其能主动吸收周围环境中的DNA分子
C.为保证正向连接,PCR时应在sacB基因上游引物的5'端添加BamHⅠ识别序列
D.大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功
三、非选择题(本题共1小题,共13分。)
8.(13分)红景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运蛋白,科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树,以实现栾树的定向改良,使其增强对Cd的富集能力,从而更有效治理Cd污染。主要技术流程如下图,请回答:
(1)重组质粒的构建、扩增、保存。为构建Cd转运蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白,需确保目的基因与质粒正确连接。构建重组质粒时用　　　　　　　酶切PCR纯化产物(已添加相应酶切位点)及Ti质粒,然后通过DNA连接酶进行连接制备重组质粒,并依次转入大肠杆菌和农杆菌。
(2)栾树愈伤组织的诱导。切割无菌苗将其茎段插入愈伤组织培养基,培养基应添加　　　　　　　　　　等植物激素,放入培养箱,经过21 d的黑暗诱导,茎段经　　　　　形成愈伤组织。
(3)农杆菌介导转化体系的建立。用农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化,并用添加　　　　的培养基筛选出转化成功的愈伤组织,将愈伤组织继续培养成完整植株。
(4)原生质体制备及目的基因的检测和鉴定。取愈伤组织用　　　　　　　　　处理一段时间获得原生质体,在激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光。据此可知,在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。若要从个体生物学水平上进行目的基因的检测与鉴定,则可以检测比较转基因栾树与野生型栾树　　　　　　。
答案全解全析
1.B　限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,其在原核细胞中的主要作用是切割外源DNA使之失效,从而达到保护自身的目的,A错误;将外源基因导入受体细胞,常需要将目的基因与载体结合构建基因表达载体,常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒,B正确;作为载体的质粒DNA分子上要有一个至多个限制酶的切割位点,这是质粒可作为载体的条件之一,C错误;DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成,D错误。
归纳总结
与DNA有关的酶
酶 作用 作用相关“键”
限制酶 切割DNA片段,产生两个(具有相同黏性末端或平末端的)DNA片段 破坏磷酸二酯键
DNA连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,从而连接起来 形成磷酸二酯键
解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链 破坏氢键(非化学键)
DNA聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3'端上 形成磷酸二酯键
DNA(水解)酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键
2.C　PCR反应中,延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶连接形成磷酸二酯键,A错误;PCR反应中需要以dATP、dTTP、dCTP、dGTP为原料合成新的DNA链,这些原料水解会放出能量,B错误;PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,C正确;核酸染料在制备凝胶时加入,将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内,留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物,D错误。
3.B　猪是哺乳动物,其成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器,不含DNA,因此新鲜猪血不能用于提取DNA,A错误;DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精,但能溶于2 mol/L的NaCl溶液中,因此可用酒精进一步纯化DNA,B正确;在研磨植物细胞时加入研磨液是为了溶解细胞膜,C错误;溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂,沸水浴加热后,颜色呈蓝色,D错误。
4.B　以人的DNA为模板,通过血红蛋白基因两端的核苷酸序列设计两种引物可以扩增出人的血红蛋白基因,第3次扩增的产物中才含有所需的基因,A正确;用于构建基因表达载体所用的质粒往往取自细菌或真菌体内,病毒不含质粒,B错误;构建基因表达载体时需要先用限制酶切割目的基因和质粒让两者产生相同的末端,再用DNA连接酶将两者连接形成基因表达载体,C正确;为检测转基因的产黄青霉是否培育成功,需要从分子水平检测产黄青霉的染色体DNA上是否插入了血红蛋白基因、血红蛋白基因是否转录出了mRNA、血红蛋白基因是否翻译成了血红蛋白等,还需要从个体生物学水平鉴定转基因的产黄青霉是否能够高效利用氧气,D正确。
5.B　SacⅠ会破坏质粒pPIC9K上的端没有SnaBⅠ识别的序列,AvrⅡ会破坏,故构建重组质粒时,不能使用限制酶SacⅠ、AvrⅡ和SnaBⅠ,A正确;能在不含组氨酸的培养基上生长繁殖的酵母菌可能是含重组质粒的酵母菌或含质粒pPIC9K的酵母菌,而质粒pPIC9K上没有IL-2基因,B错误;质粒pPIC9K上含有启动子,启动子是RNA聚合酶识别并结合、启动转录的DNA片段,C正确;IL-2是一种糖蛋白,需要先后经过内质网和高尔基体的加工和修饰才能成为有活性的IL-2,而大肠杆菌为原核生物,故将重组质粒导入大肠杆菌,获得的工程菌不能产生有活性的IL-2,D正确。
归纳总结
对限制酶切割位点的三点要求
(1)位置要求:限制酶切割位点所处的位置必须在标记基因外,只有这样才能保证标记基因的完整性。
(2)数量要求:选择限制酶切割目的基因时,被选择的限制酶在目的基因的两侧都要有识别序列,这样才能切割出完整的目的基因。
(3)对象要求
①在获取目的基因和切割载体时可用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶分别切割目的基因和载体后两者形成的黏性末端相同时,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体(要确保质粒上也有这两种酶的切点),使目的基因两侧及载体上具有两个不同的末端。
③所选择的限制酶不能破坏标记基因,如质粒上有两个或两个以上标记基因,则要求至少保留一种能用于筛选。
6.ACD　94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于耐高温的DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防止基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
7.D　由图中pAH162-sacB可知,将sacB基因插入pAH162上需要的限制酶是BamHⅠ、EcoRⅠ,A正确;导入重组质粒前,需用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B正确;为保证正向连接,PCR时应在sacB基因上游引物的5'端添加BamHⅠ识别序列,在sacB基因下游引物的5'端添加EcoRⅠ识别序列,C正确;具有双重选择系统的大肠杆菌在含四环素的培养基中生长,在含蔗糖的培养基中不生长,说明双重选择系统的重组质粒构建成功,D错误。
8.答案　(除标注外,每空2分)(1)BglⅡ和SpeⅠ
(2)细胞分裂素和生长素　脱分化(1分)
(3)潮霉素
(4)纤维素酶和果胶酶(1分)　通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所(3分)　Cd的富集能力
解析　(1)限制酶BlpⅠ会破坏质粒的卡那霉素抗性基因,根据题意,重组质粒需保留GFP基因且同时为了确保目的基因与质粒正确连接,可以用BglⅡ和SpeⅠ对目的基因与质粒进行酶切。
(2)植物组织培养过程中,培养基中应添加生长素和细胞分裂素等植物激素;茎段形成愈伤组织的过程是脱分化过程。
(3)用农杆菌单克隆菌株对栾树愈伤组织进行侵染转化,若转化成功,重组质粒中的 T-DNA会整合到栾树细胞染色体DNA上,结合图示可知,重组质粒的T-DNA区域只有潮霉素抗性基因,故需要用添加潮霉素的培养基筛选转化成功的愈伤组织。
(4)由于植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶,故可用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织,以获得原生质体;根据题干信息“激光共聚焦下观测到细胞膜发出绿色荧光”可知,在本研究中选择GFP与Cd转运蛋白构建融合蛋白的目的是通过观察绿色荧光来确定Cd转运蛋白是否表达以及分布场所;由题意可知,科研人员将红景天中的HMA3基因转入栾树,以实现栾树的定向改良,使其增强对Cd的富集能力,从而更有效治理Cd污染,故要从个体生物学水平进行鉴定,需要检测比较转基因栾树与野生型栾树Cd的富集能力。

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