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第二章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
-动物细胞融合与单克隆抗体
本节聚焦:
什么是动物细胞融合技术？
单克隆抗体是如何制备的？
在临床上有哪些应用？
荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图
温故而知新：
意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。　　　　　
必修一P43
植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？
形成杂交细胞融合后形成的杂交细胞就有原来两个或多个细胞的遗传信息。
一、动物细胞融合技术
任务探究
【任务一】阅读课本48页，阐明动物细胞融合技术的概念、方法和意义，重点分析生物方法的原理和方法。
（一）概念
动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
（二）方法
物理方法：电融合法、离心法
化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法
生物方法：灭活病毒诱导法
与植物原生质体融合的方法相同
原理：
细胞膜的流动性
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片
一、动物细胞融合技术
【任务一】阅读课本48页，阐明动物细胞融合技术的概念、方法和意义，重点分析生物方法的原理和方法。
（二）方法
思考
生物方法：灭活病毒诱导法
灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
一、动物细胞融合技术
【任务一】阅读课本48页，阐明动物细胞融合技术的概念、方法和意义，重点分析生物方法的原理和方法。
（二）方法
动物细胞融合实质及完成的标志：细胞核的融合
（三）意义
①突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
②研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
③利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
一、动物细胞融合技术
【任务一】阅读课本48页，阐明动物细胞融合技术的概念、方法和意义，重点分析生物方法的原理和方法。
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
基本原理
融合前处理
诱导方法
用 途
意 义
细胞膜的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
用纤维素酶、果胶酶去壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散
培育新品种
制备单克隆抗体
物理法：电融合法、离心法
化学法：PEG，高Ca2+ —高PH融合法
电融合法，PEG融合法，灭活的病毒
植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
二、单克隆抗体技术
【任务二】1.阅读课本49页第一段，明确抗体的概念、分布、产生途径和传统抗体生产方法。
1.抗体定义
机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
2.抗体的分布
血清（主要）组织液及外分泌液（如乳汁中，为新生儿提供抗体）
3.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
体液免疫
1.传统抗体的制备方法及缺陷
缺点：产量低、纯度低、特异性差
向动物体内反复
注射某种抗原
使动物
产生抗体
从动物血清中分离所需抗体
有什么方法解决这个问题？
1个B淋巴细胞
B淋巴细胞群
大量单一抗体
克隆
产生
（产量高、纯度高、特异性强）
在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的！
体内产生的特异性抗体多达百万种
1抗原
传统抗血清
（所有抗体混合）
免疫
1
1
2
3
4
☆抗体
(1)每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体
动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上
二、单克隆抗体技术
米尔斯坦
【英国】
科勒
【德国】
解决
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：
抗体
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
（分泌特异性抗体）
（能在体外大量增殖）
（既能迅速大量增殖，又能产生特异性抗体）
(单克隆抗体)
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
动物细胞融合
动物细胞培养
二、单克隆抗体技术
二
(1)单克隆抗体的概念:
单个细胞
无性繁殖
化学性质单一，特异性强
单：
克隆：
抗体：
由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。
单克隆抗体制备的过程是怎么样的呢
二、单克隆抗体技术
二、单克隆抗体技术
【任务二】2.阅读课本49页第二段和图2-15和2-16，明确米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体的方法，为什么要进行两次筛选？比较两种培养杂交瘤细胞方法的优缺点？
诱导其融合的方法有哪些？
注射抗原的目的是什么？
大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法
两次筛选的目的
获得能产生相应抗体的B淋巴细胞
物理:电融合法化学:聚乙二醇
生物：灭活的病毒
第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。
第2次筛选得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
多种B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择性培养基 筛选1
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原-抗体
杂交法
筛选2
克隆化
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
思考：
不能产生抗体，但能大量增殖
能产生抗体，但不能大量增殖
单克隆抗体制备中包括几个阶段？
动物细胞融合、动物细胞培养
原理
细胞膜的流动性、细胞增殖
知识拓展：第一次筛选获得杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人活化的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
培养基中加入氨基嘌呤
☆单克隆抗体制备过程
多种杂交细胞
B-瘤
瘤-瘤、
B-B、
第一次筛选：
用特定的选择培养基
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测(经多次筛选)
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
未融合的细胞
克隆化培养
（可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞）
②诱导融合后的细胞有几种类型？
仅考虑两两融合有几种？
5种
3种
B—瘤
瘤
B
BB
瘤瘤
杂交瘤细胞：
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长）
③杂交瘤细胞是如
何筛选出来的？
④是否所有的杂交瘤细胞都能产生所需的抗体？
二、单克隆抗体技术
☆单克隆抗体制备过程
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
（体内培养）
单克隆抗体的优点：
（1）能准确识别抗原的微小差异（2）与特定抗原发生特异性结合（3）可大量制备
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）
（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）
⑤如何扩大培养得到大量的单克隆抗体？
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
二、单克隆抗体技术
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
方法
筛选结果
诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等
用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。
筛选出融合的杂种细胞
选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。
用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞
二、单克隆抗体技术
【任务二】2.阅读课本49页第二段和图2-15和2-16，明确米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体的方法，为什么要进行两次筛选？比较两种培养杂交瘤细胞方法的优缺点？
（1）作为诊断试剂——最广泛的应用
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
艾滋病检测试剂
单克隆抗体+同位素（荧光标记）
在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
三、单克隆抗体技术的应用
(2)、运载药物
抗体：靶向运输药物，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，
将连接的药物输送到靶细胞。
药物：发挥治疗效应，如杀伤肿瘤细胞
ADC
资料2
思考：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
如ADC（抗体—药物偶联物）
实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤
(主要用于癌症治疗)如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
优点：位置准确、疗效高、副作用小
三、单克隆抗体技术的应用
除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长。
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
思考与讨论
临床上主要用来治疗淋巴瘤的一种单克隆抗体药物
(3)、用于治疗疾病：主要用于癌症治疗,如PD-1抗体或PD-L1抗体。
单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病
疑问1：为什么用骨髓瘤细胞，不用别的癌细胞？
疑问2：产生抗体的是浆细胞，为什么用来细胞融合的是B淋巴细胞而不是浆细胞？
骨髓瘤又称浆细胞瘤，起源于骨髓中浆细胞的恶性肿瘤，骨髓瘤细胞是基因缺陷细胞，无法在特定选择培养基上生长，只有融合成功的杂交瘤细胞（含有B淋巴细胞的基因，弥补缺陷）才能在特定选择培养基上生长，便于筛选杂交瘤细胞。
哺乳动物B细胞的发育过程:祖B细胞→前B细胞→未成熟B细胞→成熟B细胞→活化B细胞→浆细胞。
用于单抗制备的是成熟B细胞还是浆细胞呢 两者都不是。
成熟B细胞未接受抗原刺激,不能产生抗体,但是浆细胞也不适用于细胞融合。有研究证实,小鼠注射抗原后7~8d抗体达到高峰,也就是7~8d后浆细胞达到高峰,但是取此时的细胞和骨髓瘤细胞融合效率很低。若取免疫后3d的细胞,则融合的效率最高。而此时的B细胞正处于从成熟B细胞向浆细胞分化的时期,也就是活化B细胞时期。所以用于细胞融合的是接受过抗原刺激的活化B细胞。
选讲
课堂练习
1.(2023·山东卷)如图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT-），在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述不正确的是（ ）
A. 可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合
B. 两两融合的细胞不一定能在HAT培养液中生长
C. 体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体
D. 细胞膜流动性是细胞融合的基础
体细胞杂交技术是植物细胞工程的手段
C
课堂练习
2、(2023·安徽卷)机体发生炎症反应时，血浆中CD14水平会升高。利用小鼠制备抗CD14单克隆抗体，能够用于CD14的检测。下列相关叙述正确的是（　　）
A. 反复将CD14注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体
B. 灭活的病毒是唯一能诱导骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合的因素
C. 利用杂交瘤技术获得的杂交瘤细胞都可以产生抗CD14抗体
D. 杂交瘤细胞体外培养过程中需要提供CO2以维持培养液中pH
单克隆抗体是细胞融合的手段产生的
诱导细胞融合方法有：物理方法、化学方法和生物方法。
杂交细胞有：3种，只有骨髓瘤细胞-B淋巴细胞杂交的细胞才能产生抗体，
D
3、(2023·天津卷)下列技术或方法与原理相符的是（ ）
A. 人参细胞的大量培养和动物细胞培养——细胞增殖
B. 植物组织培养和单克隆抗体的制备——细胞的全能性
C. 早期胚胎培养和人鼠细胞融合——细胞膜的流动性
D. 转基因抗虫棉和克隆羊多利的培育——基因重组
单克隆抗体制备原理是细胞增殖
早期胚胎培养进行的是有丝分裂，体现了细胞的增殖能力
克隆羊多利的培育是核移植，胚胎移植，无基因重组
A
课堂练习
4、 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
5、科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。

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