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(共34张PPT)
3.4 蛋白质工程的原理和应用
“颜料”竟然是含不同颜色的荧光蛋白的细菌
说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。（生命观念）
尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计改造某一蛋白质的设计流程。（科学思维）
学习目标
从社会中来
右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画"的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。
问题1: 科学家利用了什么技术让细菌能发出绿色荧光？
基因工程技术使细菌表达了荧光蛋白。
科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造让细菌能发出黄色荧光？
科学家解析了多管水母绿色荧光蛋白的晶体结构，并利用计算机进行辅助设计，在此基础上再采用定点突变的技术将绿色荧光蛋白发光基团正下方的第203位的苏氨酸替换为酪氨酸，从而获得了一种新的绿色荧光蛋白的衍生物——黄色荧光蛋白。
科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造让细菌能发出黄色荧光？
问题2: 这种对现有蛋白质进行改造的技术与基因工程技术一样吗？
将一种生物的 转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的 ，进而表现出新 。
基因工程的不足：
在原则上只能生产自然界 。
天然蛋白质的不足：
天然蛋白质的 符合特定物种 的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
基因
蛋白质
性状
已存在的蛋白质
生存
结构和功能
（教材P93）
基因工程的实质：
一、蛋白质工程崛起的缘由
对天然蛋白进行改造，产生更符合人类需要的蛋白质
蛋白质工程
实例：提高玉米赖氨酸含量：
赖氨酸合成
调控
达到一定浓度
两种酶的活性
352位的苏氨酸变成异亮氨酸
二氢吡啶二羧酸合成酶
天冬氨酸激酶
+
104位的天冬酰胺变成异亮氨酸
赖氨酸含量
抑制
提高
提高
限制
提高
提高5倍
提高2倍
请据图说出如何提高赖氨酸含量？
蛋白质工程概念：
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
基础
操作方法及对象
结果
目的
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。
一、蛋白质工程崛起的缘由
7
1.目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，由于基因决定蛋白质，因此，对蛋白质的结构进行设计改造，最终通过改造或合成基因来完成。
2.天然蛋白质合成过程：
思考：为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大，基因结构相对简单，容易改造；
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质；
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传；
02
按照中心法则
二.蛋白质工程的基本原理
二.蛋白质工程的基本原理
新蛋白质预期功能
改造或合成
分子设计
转录
翻译
折叠
基因
DNA
新蛋白质新功能
氨基酸序列多肽链
蛋白质
三维结构
mRNA
起点：
目的：
终点：
实质：
前提：
蛋白质的预期功能
了解蛋白质结构和功能的关系
获得大量的改造后的蛋白质
改造基因结构
生产出符合人们生活需要的蛋白质
关键技术：基因工程
又称第二代基因工程
3.蛋白质工程的一般过程
逆中心法则
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
构建蛋白质三维结构图:
制备蛋白质晶体：
碱基的替换：
借助计算机
通过X射线衍射技术
基因的定点突变技术
蛋白质工程基本思路的应用
P94思考.讨论
某多肽链的一段氨基酸序列是：
丙氨酸
苯丙氨酸
色氨酸
谷氨酸
赖氨酸
讨论1: 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。
查密码子表得知：
推知mRNA序列为：
丙氨酸（GCU、GCC、GCA、GCG)、色氨酸(UGG)、赖氨酸(AAA、AAG）、谷氨酸（GAA、GAG）、苯丙氨酸（UUU、UUC）。
GCU（或C或A或G）UGG AAA（或G）GAA（或G）UUU（或C）
共 种可能序列
32
二.蛋白质工程的基本原理
丙氨酸
苯丙氨酸
色氨酸
谷氨酸
赖氨酸
查密码子表得知：
推知mRNA序列为：
丙氨酸（GCU、GCC、GCA、GCG)、色氨酸(UGG)、赖氨酸(AAA、AAG）、谷氨酸（GAA、GAG）、苯丙氨酸（UUU、UUC）。
GCU（或C或A或G）UGG AAA（或G）GAA（或G）UUU（或C）
共 种可能序列
32
脱氧核苷酸序列
GCT(或C或A或G)TGG AAA(或G)GAA（或G） TTT(或C)
CGA(或G或T或C) ACC TTT(或C)CTT（或C） AAA(或G)
共 种可能序列
32
讨论2: 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
提示：
天然蛋白质
改造蛋白质
蛋白质工程基本思路的应用
P94思考.讨论
定点诱变法的过程示意图
引物
突变
DNA聚合酶
DNA连接酶
受体细胞
转录
突变
二.蛋白质工程的基本原理
常规下游引物
课堂活动2：根据活动1结果设计引物部分碱基序列
C A C A A G
G T G T T C
C A C A A G
C T G T T C
G T G T T C
C A C A A G
1
大引物PCR
归纳总结定点诱变技术
项目 内容
条件 原料
酶
引物
操作方法
结果
适用范围
特点
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶和DNA连接酶
含突变位点的DNA分子片段
先通过PCR扩增已获得定点突变的基因，再通过基因工程将突变基因导入受体细胞，经过转录和翻译合成所需的蛋白质
后代中半数为诱变的DNA分子
空间结构完全清楚的蛋白质，进行“小改”
定点诱变有目的性和针对性
二.蛋白质工程的基本原理
a.以据氨基酸的性质和特点，制造全新蛋白质（到目前还没有成功的例子）
b.改变蛋白质分子中某一个多肽链片段或一个特定的结构域
c.利用基因工程中的定点诱变技术，改造蛋白质分子某活性部位的一个或几个氨基酸残基（实践中运用的最多）
借助计算机构建蛋白质三维结构图
5.蛋白质工程的类型
二.蛋白质工程的基本原理
活动：探索胰岛素的改造思路和方案
天然胰岛素制剂往往以二聚体或六聚体的形式存在，阻碍胰岛素从注射部位进入血液，需要经历长时间才能解离为单体，延缓了降血糖作用，见效慢。
A链
B链
脯氨酸
胰岛素的分子结构示意图
问题：天然胰岛素见效慢
目标： 胰岛素的起效时间
前提：了解胰岛素 及其与 的关系
科学研究发现，胰岛素β链第20~29位的氨基酸是胰岛素分子形成多聚体的关键区域，若将第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸，可以有效抑制胰岛素的聚合。请小组讨论改造胰岛素分子的思路。
方案：改造胰岛素的 。
缩短
结构
功能
结构
方案：改造胰岛素的结构
是改造基因，还是直接改造蛋白质呢？
√
2.对比DNA和蛋白质的结构，对谁的改造更容易？
DNA分子结构
蛋白质分子结构
蛋白质的高级结构复杂，直接改造难度大，改造基因更容易；
1.为什么改造基因也可以实现对蛋白质的改造？
3.从遗传角度分析，改造基因与改造蛋白质相比，有什么优势？
蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质；
改造的基因可以遗传，蛋白质无法遗传。
如何改造基因呢？
定点诱变法
活动:探索胰岛素的改造思路和方案
胰岛素二聚体
胰岛素单体
脯氨酸
（CCU）
天冬氨酸(GAU)
CTA
GAT
GGA
CCT
碱基替换
思考：成功获得新的胰岛素基因后，最终如何实现新型胰岛素的大量生产？
基因工程
利用转基因生物生产新型胰岛素
新的胰岛素基因 + 基因的载体
速效胰岛素类似物
结果就是生产出了自然界没有的蛋白质！
项目 蛋白质工程 基因工程
区别 起点
过程
实质
结果
应用及现状
联系
预期蛋白质功能
目的基因
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
通过改造相应的基因达到对蛋白质的改造
基因重组
可以创造出自然界不存在的蛋白质
生产自然界已存在的蛋白质
①主要集中在对现有蛋白质进行改造，②对创造新的蛋白质还有许多技术难题未突破，因为蛋白质高级结构非常复杂，人们对此知之甚少
①已被广泛应用，如转基因植物、动物、药品生产等已商业化
①蛋白质工程获得目的基因后，需要通过基因工程获得预期蛋白质
②蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
操作对象
操作水平
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
思考：如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？
是否合成新的基因
蛋白质工程
是否对原有基因进行改造
是
否
是
否
蛋白质工程
基因工程
看蛋白质
看基因
是否为天然蛋白质
是
否
蛋白质工程
基因工程
二.蛋白质工程的基本原理
练习：下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：
(1)代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是__________。(填写数字)
(2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容： ①______；
②______；③______；④______；⑤_____________。
(3)蛋白质工程的目的是_______________________________ ___________________________，通过____________________实现。
(4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是______的。
④⑤
①②③
转录
翻译
折叠
推测
改造或合成
根据人们对蛋白质功能的特定需求，
基因改造或基因合成
相反
对蛋白质的结构进行分子设计
（1）研发速效胰岛素类似物
定点突变
1.医药工业方面
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期结构
改造
B28位脯氨酸替换为
天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
新胰岛素基因
转录
mRNA
折叠
预期功能
行使功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20～29位氨基酸组成
推测序列
翻译
多肽链
有效抑制胰岛素的聚合
阻碍胰岛素从注射部位进入血液，延缓了降血糖作用
三、蛋白质工程的应用
（2）延长干扰素体外保存时间
天然干扰素不易保存
改造
新干扰素基因
预期功能
延长保存时间
设计结构
氨基酸替换
一个半胱氨酸变成丝氨酸
推测序列
预期结构
转录
mRNA
折叠
翻译
多肽链
行使功能
在-70℃下可以保存半年
定点突变
β-干扰素氨基酸序列
1.医药工业方面
（3） 制备人鼠嵌合抗体
小鼠单克隆抗体的制备比较简单，但这种 鼠源性的单克隆抗体会被人的免疫系统排斥， 不能直接用于人体。嵌合抗体（chimeric antibody）就是保留鼠单克隆抗体的可变区，而用人抗体的恒定区替换鼠单克隆抗体的恒定区， 这种嵌合抗体的抗原性显著下降，而抗体的特 异识别功能没有丧失（图1-1-22）。目前，已有多种嵌合抗体用于临床治疗。
基因融合
通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。
蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。
如枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。
3.农业方面
（1）改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。
（2）利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
2. 其他工业方面
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，高级结构非常复杂 前景展望：要设计出更符合人类需要的蛋白质还需不断地攻坚克难。随着科技的发展，蛋白质工程将会给人带来更多的福祉。
面临的问题
提高蛋白质的热稳定性
第3位上的
异亮氨酸
半胱氨酸
与第97位的半胱氨酸形成-s-s-
P96 二、拓展应用
这项工作属于蛋白质工程的范畴。
引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。
如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践，还有很多工作需要做。例如，由于改造后酶的空间结构发生了变化，因此它的一些基本特性需要重新明确，包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等; 需要建立规模化生产该酶的技术体系，评估生产成本等。
定点突变
一.概念检测
1.蛋白质工程可以说是基因工程的延伸。判断下列相关表述是否正确。
（1）基因工程需要在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程不需要对基因进行操作。 （ ）
（2）蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。 （ ）
（3）蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。 （ ）
×
×
√
练习与应用（P96）
2.蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到 的目的是 （ ）
A.分析蛋白质的三维结构
B.研究蛋白质的氨基酸组成
C.获取编码蛋白质的基因序列信息
D.改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满 足人类的需求
3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第 47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这 项替换研究中，目前可行的直接操作对象是（ ）
A.基因 B.氨基酸　　
C.多肽链 D.蛋白质
D
A
练习与应用（P96）
4.
(1)应选择用相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。
(2)加入DNA连接酶。
(3)该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒（没有连接目的基因的质粒）的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。
(4)含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，形成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。
复习与提高（P98）
5.
(1)逆转录病毒是载体，能将外源基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和KIf4送入小鼠成纤维细胞。
(2)可以设置对照组。将转入外源基因和没有转人外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。
(3)可以依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。（其他合理答案均可）
(4）不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。
复习与提高（P98）
6.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。
方案一　把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。
方案二　直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。
(1)请评估这两种方案哪种更容易实现。
从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。
复习与提高（P98）
水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。
方案一　把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。
方案二　直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。
(2)如果两个方案都实现的话，你认为哪种更值得推广？请说出你的理由。
此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。
复习与提高（P98）

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