资源简介

(共32张PPT)
首例胚胎移植成功
1890年
首创动物组织体外培养法
1907年
发现哺乳动物精子获能现象
1951年
体细胞核移植成功
1958年
试管家兔诞生
1959年
创立单克隆抗体技术
1975年
胚胎分割移植成功
1978年
分离和培养小鼠胚胎干细胞
1981年
克隆羊多莉诞生
1996年
获得诱导多能干细胞
2006年
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
2014年
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
2017年
动物细胞工程的发展历程
科技探索之路
动物细胞工程
常用的技术
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程的基础
人造皮肤
克隆猴：中中和华华
单克隆抗体
是最基础的技术
从社会中来
1）使用他人皮肤如何？
患者自身的不够用，如何解决？
大面积烧伤：
2）培养自身细胞？
人造皮肤
小面积烧伤：
患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复
那么，怎样获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
在体外进行培养、扩增
目前，可对皮肤干细胞进行培养，获得适合临床上使用的人造皮肤。
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
到社会中去
组织
1. 概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
细胞生长和增殖
适宜条件
动物体
取出
单个细胞
分散
①培养原理：
②目的：
细胞增殖(有丝分裂)
获得细胞或者细胞产物， 不能获得完整动物个体。
营养容易供应，其代谢废物容易排出
分散成单个细胞的原因：
一、动物细胞培养的条件
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件。你还记得有哪些条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
一、动物细胞培养的条件
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等。
。
血清等天然成分
营养条件
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
动物细胞培养
所需的基本条件
1.营养条件：合成培养基 + 血清等天然成分
一般使用液体培养基，也称为培养液。
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。
合成培养基
营养条件
1
不能以淀粉、蔗糖为碳源
有利于培养的细胞与营养物质充分接触
一、动物细胞培养的条件
无毒：
无菌：
防止微生物污染
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
无菌无毒的环境
2
目的：
定期更换培养液
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
③添加一定量的抗生素
一、动物细胞培养的条件
3、温度、pH和渗透压
①适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以______________为宜；
36.5±0.5℃
②适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为___________
7.2-7.4
③适宜的渗透压：
维持细胞正常的形态和功能
人体内环境的理化性质
①人体细胞外液的温度一般维持在：
36.5±0.5℃
②正常人的血浆近中性，pH约为：
7.35~7.45
③渗透压：指溶液中溶质微粒对水的吸引力。
一般与相应动物内环境的理化性质保持一致。
一、动物细胞培养的条件
770 kPa
在37℃时，人的血浆渗透压约为：
①气体的组成及作用：
O2：
CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
②容器：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
③仪器：
置于含有 和 的混合气体 的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
气体环境
4
95%空气
5%CO2
动物细胞培养的过程又是怎样的呢？
问题:
一、动物细胞培养的条件
2.分散成单个细胞
(1)取材对象:
(2)取材原因:
1.取动物组织
制成细胞悬液
取动物组织
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
(1)原因：
①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。②利于细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
二、动物细胞培养的过程
制成细胞悬液
取动物组织
2.分散成单个细胞
（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？
机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等去掉组织间蛋白，将组织处理一段时间。
蛋白质
不可以，因为胃蛋白酶的最适PH为1.5左右
细胞膜也含蛋白质，长时间会分解细胞膜蛋白，破坏细胞结构，把细胞消化掉。注意控制时间和酶用量。
①说明动物细胞间的物质主要是什么成分？
②用胃蛋白酶可以吗？
③胰蛋白酶处理时间过长，会怎样？
二、动物细胞培养的过程
3.细胞悬液
用培养液将细胞制成细胞悬液。
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中进行原代培养。
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养液进行原代培养
二、动物细胞培养的过程
悬浮生长类：
贴壁生长类：
体外培养的动物细胞
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖。
另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。
（大多数）
这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
——细胞贴壁
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养液进行原代培养
4.原代培养:
指动物组织经处理后的初次培养。
(1)概念：
二、动物细胞培养的过程
4.原代培养:
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
悬浮生长类：
贴壁生长类：
体外培养的动物细胞
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象。
思考：细胞培养一段时间，分裂会受阻，这是为什么？怎样解决这一问题？
二、动物细胞培养的过程
接触抑制现象：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。数量不再增加。
刚开始铺展贴壁生长
贴壁生长并进行有丝分裂
单层相互接触出现接触抑制
一（单）层细胞
多层细胞
癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
某些异常细胞能解除这种现象。
需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
判断依据：是否分瓶！
(1)原代培养：
(2)传代培养：
指动物组织经处理后的初次培养。
分瓶后的细胞培养。
5.分瓶、传代培养
制成细胞悬液
取动物组织
放入CO2培养箱中培养
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
二、动物细胞培养的过程
传代培养视频演示
二、动物细胞培养的过程
（1）收集细胞
①悬浮生长类：
直接用离心法收集
②贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶等处理,使之分散
成单个细胞，然后再用离心法收集。
（2）将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶：
5.分瓶、传代培养
第一次使用的目的是使组织细胞分散开；
贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
【思考】细胞培养一段时间，分裂会受阻，怎样解决这一问题？
二、动物细胞培养的过程
思考：正常细胞能否一直传代培养下去？
不可以；
细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；
传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株；
继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了；
细胞株
细胞系
原代培养
传代培养
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
单个细胞
加培养液
10代以内，保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)；
部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，
这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展
遗传物质改变
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
核型是指一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
目前使用或冷冻保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型（遗传物质不改变）。
二、动物细胞培养的过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基物理性质
培养基特有成分
过程
培养结果
培养目的
相同点
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
脱分化-再分化
原代培养-传代培养
思考●讨论2：植物组织培养和动物细胞培养的比较 P42
(2)分布：
(3)分类：
动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。
在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
(1)干细胞的概念：
干细胞存在于 、 和 等多种组织和器官中。
早期胚胎
骨髓
脐带血
胚胎干细胞
成体干细胞
按来源
全能干细胞
多能干细胞
按分化潜能
专能干细胞
三、干细胞培养及其应用
早期胚胎中
胚胎干细胞
分布
特点
应用实例
在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
局限性
胚胎干细胞(ES或EK细胞)
1
(1)形态上：体积小、细胞核大、核仁明显。
(3)在体外培养的条件下，可以只增殖，而不分化。
可以冷冻保存，也可以进行遗传改造。
(2)功能上：具有发育的全能性。
三、干细胞培养及其应用
成体组织或器官内造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中）具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力成体干细胞分布举例特点应用实例治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞神经干细胞治疗细胞损伤造成的疾病03成体干细胞2造血干细胞是发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例三、干细胞培养及其应用通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）诱导多能干细胞概念制备方法应用优点②用小分子化合物诱导形成。①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得新进展03诱导多能干细胞(iPS细胞)3三、干细胞培养及其应用移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
定向诱导分化
诱导多能干细胞(iPS细胞)
3
三、干细胞培养及其应用
来源或存在 功能、特点 局限性
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能干细胞(iPS细胞)
早期胚胎
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。
具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织
不具有发育成完整个体的能力
需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用
技术不成熟。
面临的问题:存在着导致肿瘤发生的风险。
三、干细胞培养及其应用
动物细胞培养
动物细胞培养的概念和原理
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
原理：细胞的增殖
在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
(1)营养条件
(2)无菌、无毒的环境
(3)温度、pH和渗透压
(4)气体环境
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
干细胞培养及其应用
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞（ ES细胞）
成体干细胞
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
课堂小结
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
×
√
×
×
练习与应用
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
练习与应用

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