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3.2.2
动物细胞工程（二）
动物细胞融合与单克隆抗体
一、动物细胞融合
二、单克隆抗体
动物细胞融合与单克隆抗体
三、动物细胞融合
概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
原理：动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同（磷脂分子重新排布）。
诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
物理方法：电融合法、离心法
化学方法：聚乙二醇(PEG)
高钙—高pH培养法
灭活的仙台病毒诱导
灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子__________，细胞膜打开，细胞发生融合。
灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去______能力，但是并不破坏这些病原体的______结构。
重新排布
感染
抗原
利用细胞融合进行基因定位
已知人的体细胞和小鼠的体细胞(2N=40) 杂交(融合)后，杂种细胞在有丝分裂过程中，人的染色体逐渐地丢失，最后仅保留少数几条。由于人染色体的丢失是随机的，因此不同的杂种细胞会保留不同的人染色体。
结论：人胸苷激酶基因位于17号染色体上。
获得杂种植株
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
细胞的全能性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后
诱导细胞融合
物理、化学方
法、灭活的病毒
制备单克隆抗体
物理、化学方法
4、意义：
细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使____________成为可能。至今种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造_____________开辟了新途径。
远缘杂交
单克隆抗体
一、动物细胞融合
二、单克隆抗体
动物细胞融合与单克隆抗体
1、传统抗体的缺陷
长期以来，人们为了获得抗体，采用的方法是向动物体内____________________，使动物产生抗体，然后，从动物______中分离所需抗体。这种方法不仅__________，而且____________。
B1
B2
B3
1
2
细菌
3
反复注射某种抗原
血清
产量低、
纯度低
特异性差
传统抗体是多克隆抗体
四、单克隆抗体
动物在免疫反应的过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞__________________。
只产生一种抗体
克隆
B淋巴细胞与癌细胞融合形成杂交细胞
四、单克隆抗体
因此，要想获得大量的单一抗体，必须______单一的B淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，解决这一问题的思路是让 ____________________________________________。
选择培养基筛选
单克隆抗体
诱导融合
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基筛选
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
克隆化培养
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能无限增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
合成DNA
D途径
S途径
D途径
氨基喋呤
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
选择性培养基：
在该培养基上，_______________细胞和____________________的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。
未融合的亲本
融合的具有同种核
AB1、AB2、AB3 。。。。。。
专一抗体检验阳性：有限稀释法
用羊的红细胞对小鼠进行注射，使小鼠产生免疫反应，从产生免疫反应小鼠的脾脏细胞中，他们得到了抗_________的抗体，这说明在小鼠的脾中形成了_______________细胞。他们又设法将鼠的__________细胞与脾脏细胞中产生的__________细胞融合，再用特定的__________培养基进行筛选。在该培养基上，_______________细胞和____________________的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。这种杂种细胞的特点是既能_______________，又能___________。对上述经选择性培养的杂交瘤细胞，还需进行_____________和____________，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖，这样，从_____________或____________中，就可以提取出大量的单克隆抗体了。
羊红细胞
相应的B淋巴
骨髓瘤
B淋巴
选择性
未融合的亲本
融合的具有同种核
迅速大量繁殖
产生专一抗体
克隆化培养
抗体检测
细胞培养液
小鼠腹水
4、单克隆抗体的应用
单克隆抗体最主要的优点在于它的____________、___________________________。
①作为诊断试剂
由于单克隆抗体纯度高、特异性强，所以能准确地识别各种______物质的细微差异，并跟一定抗原发生_____________，因此，单克隆抗体在诊断的应用上，具有准确、高效、简易、快速的优点。
特异性强
灵敏度高并可大量制备
抗原
特异性结合
抗（人绒毛膜促性腺激素）单克隆抗体
在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。
思考、正常的性成熟女性每个月都会排卵，最佳受精时间为排卵后24-36小时。在女性的月经周期中，尿液中的促黄体生成素（SH）会在排卵前24小时左右出现高峰值。据此可推测，排卵试纸起核心作用的物质是___________________。
抗促黄体生成素单克隆抗体
②用于疾病检测
甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备__________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。
抗原
抗AFP单克隆抗体
AFP
肿瘤
资料：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。
ADC示意图
问题：细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害。
解决方法：抗体—药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
抗体
药物
接头
ADC的作用机制示意图
①
ADC
②
③
④
溶酶体裂解
释放药物
⑤
细胞凋亡
脂质体给药：
高效、低毒、靶向
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基筛选
克隆化培养
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
单克隆抗体
融合
杂交瘤细胞
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
AB3
小鼠
骨髓瘤细胞 （连续分裂）
B淋巴细胞（不能无限分裂）
专一抗体检验阳性
从脾中分离
诱导融合
抗原
注入
克隆培养
单抗
细菌
B1
B2
B3
2
3
1
选择 培养基
特异性强，灵敏度高，可大量制备
诊断试剂
生物导弹
特 点
应 用
既能无限增殖，又能产生特异性抗体

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