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3.2.1
植物细胞工程
第1节 植物细胞工程的基本技术
细胞工程：是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学的原理和方法，通过_________水平、_______水平或_______水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
根据操作对象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。
细胞
细胞器
组织
3.2.1 植物细胞工程
第1节 植物细胞工程的基本技术
1、概念：是指将_______的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的________上，给予适宜的培养条件，诱导其形成_____________的技术。
完整植株
培养基
离体
一、植物组织培养
细胞经分裂和分化后，仍然具有___________________________________________的潜能，即细胞具有全能性。但是，在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，这是因为在特定的______________条件下，细胞中的基因会__________。
产生完整生物体或分化成其他各种细胞
时间和空间
选择性地表达
2、植物细胞的全能性
外植体
愈伤组织
芽、根
植株
脱分化
再分化
3、植物组织培养的基本流程
外植体：_______的植物器官、组织或细胞。
细胞分化：个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在______、______和______上出现稳定性差异的过程。
脱分化：已经分化的细胞，失去其特有的结构和功能而转变成__________细胞，形成愈伤组织的过程。
愈伤组织：由外植体脱分化形成的一团排列疏松无规则、高度液泡化的具有______能力的薄壁细胞。
再分化：由愈伤组织重新分化成__________等器官的过程。
离体
形态
结构
功能
未分化
分生
根、芽
外植体
愈伤组织
芽、根
植株
脱分化
再分化
愈伤组织
见光后愈伤组织变为绿色
愈伤组织
4、案例：菊花的组织培养
（1）材料的选取
同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。菊花的组织培养一般选择未开花植株茎上部新萌生的侧枝。
（2）常用的培养基是____________，主要成分包括：
①____________：N、P、S、K、Ca、Mg等。
②____________：B、Mn、Cl、Zn、Fe、Mo、I、Co等。
③有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、以及________（葡萄糖/蔗糖）等。
MS培养基
大量元素
微量元素
蔗糖
思考1、MS培养基中为什么用蔗糖而不用葡萄糖？
分析：蔗糖同样可以作为植物细胞的碳源和能源物质。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显______（低于/高于）葡萄糖，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显______（慢于/快于）吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定。此外，微生物生长所需的最适合的碳源是__________，因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可在一定程度上减少____________________。
④植物激素：
_________和______________是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，二者的______、及____________等都会影响实验结果。常用的生长素及类似物有NAA (萘乙酸)、2，4-D等 。常用的细胞分裂素有6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT（激动素）和玉米素。
低于
慢于
葡萄糖
生长素
细胞分裂素
浓度
用量的比例
微生物的污染
（3）外界条件：如pH、温度、光照等环境条件。
思考2、组培时，光照条件该如何控制？
分析：形成愈伤组织以及愈伤组织的扩大培养需______，诱导愈伤组织再分化出芽需______。
思考3、胡萝卜组织培养时，若选取胡萝卜韧皮部细胞，______（能/不能）培养出完整植物体。与韧皮部细胞相比，选取胡萝卜形成层细胞进行组培更______。
避光
照光
能
容易
使用情况 实验结果
生长素用量/细胞分裂素用量的比值高
生长素用量/细胞分裂素用量的比值低
生长素用量/细胞分裂素用量的比值适中
促进根分化，抑制芽形成
促进芽分化，抑制根形成
促进愈伤组织的形成
5、操作提示
（1）无菌技术是组织培养成功的关键因素
①由于植物组织培养所利用的植物材料体积小，抗性差，所以对培养条件要求高。MS培养基同样适合于某些微生物生长，因此要进行严格的______操作。
②无菌技术包括对培养基、器械和植物材料（外植体）的____________。对培养材料表面消毒时要考虑药剂的______________和材料的__________。
③培养基可能会出现细菌污染或真菌污染。妥善处理被污染的培养物，一旦发现培养材料污染，一定要先______再打开清洗。
无菌
灭菌或消毒
消毒效果
耐受性
灭菌
5、操作提示
（2）试管苗培养过程中应注意的问题
①培养一株完整的试管苗，必须先进行______（生根/生芽）培养，然后进行______（生根/生芽）培养，如果顺序颠倒，就不容易诱导生芽了。
②试管苗一般在高湿、弱光、恒温下生长，移出瓶后一定要保温、保湿。
③试管苗____________能力低，在移栽前应给予较强光照且进行闭瓶炼苗，以促进小苗向自养转化。
生芽
生根
光合作用
稀释
70%酒精
无菌水
5%的次
氯酸钠
消毒效果
材料耐受性
70%酒精
灼烧灭菌
酒精灯火焰旁
倒插
封口膜
培养基
外植体的选择与消毒
外植体的接种
配制诱导愈伤组织培养基
愈伤组织培养
（不需要光照）
生芽培养
（每天光照12～16h）
生根培养
更换培养基
更换培养基
炼苗、移栽入土
操作者、外植体、其他器物或环境消毒
在等待外植体消毒的同时，做后面的准备工作：如点燃酒精灯、用酒精棉进行培养基瓶口的消毒、桌面的酒精消毒、准备无菌纸等。
超净工作台
贴标签：植物名称、接种日期、姓名等
生长素/细胞分裂素比例适当
细胞分裂素含量较高
生长素含量较高
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
外植体
愈伤组织
幼苗（芽、根）
植株
离体
控制光照
温度
pH
脱分化
再分化
移栽
比例适中
照光
无菌
激素 生长素
细胞分裂素
营养 有机物
无机盐
凝固剂
（琼脂）
避光
配比低→发芽
配比高→生根
MS
培养基
大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg
大量元素：Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo
植物体细胞杂交
二、植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
植物细胞
原生质体
融合的原生质体
去除细胞壁
杂种细胞
植株
融合
组培
再生细胞壁
A细胞
A原生质体
B细胞
再生出细胞壁
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
纤维素酶果胶酶
PEG融合法
高钙-高pH融合法
电融合法离心法
B原生质体
正在融合的原生质体
筛选
思考3、诱导融合之后为什么要对原生质体进行筛选？
分析：融合体系中有多个原生质体A和多个原生质体B，由于融合是______的，所以除了会出现融合原生质体AB，也会出现____________________和____________________；又由于融合的的成功率不是百分之百，所以除了会出现融合细胞，也会有_______________。因此诱导融合之后要对原生质体进行筛选。
随机
融合原生质体AA
融合原生质体BB
未融合细胞
选出AB型(杂种) 细胞的方法
方法1：互补选择法
第一次培养在适合A不适合B的条件下
第二次培养在适合B不适合A的条件下
淘汰B和BB型的细胞
淘汰A和AA型的细胞
选出AB型细胞
方法2：融合前两个亲本有可分辨的明显标记
亲本1：来自愈伤组织
亲本2：来自叶肉细胞(含叶绿体)
细胞壁薄且含有叶绿体的细胞
选择
方法3：利用抗性互补
亲本1：对放线菌素D有抗性，但在MS培养基不能超过50个世代
亲本2：对放线菌素D敏感，但能在MS培养基生生长。
将杂种细胞培养在含有放线菌素D的MS培养基上即可。
选出AB型(杂种) 细胞的方法
思考4、科学家已经培育出“番茄一马铃薯”超级杂种植株，但并未出现，地上长番茄、地下结马铃薯的性状，可能的原因是什么？
提示：马铃薯基因组的____________可能影响了番茄基因组的表达，番茄基因组的表达产物也可能影响了马铃薯基因组的表达，导致融合植株细胞中的基因不能______表达。
表达产物
有序
思考5、据报道，某男子培育出一株奇怪的植株，实现了“地上长番茄、地下结马铃薯”，你认为该男子可能是利用什么方法获得的该植株？
分析：______________________________________________________。
接穗
砧木
嫁接 以土豆植株为砧木，以番茄植株为接穗
项目 体细胞杂交 P1：2n(Aabb) 与 P2：2m(ccDd)
生殖类型
变异类型
染色体数
染色体组数
基因组成
植物体细胞杂交后代的遗传变化
无性繁殖，育种过程中不遵循孟德尔定律
染色体数目变异
两亲本染色体数之和（2n+2m）
两亲本染色体组数之和（2+2）
两亲本基因之和（AabbccDd）
意义：打破远缘亲本杂交不亲和的障碍。大大扩展杂交的亲本组合范围。
植物体细胞杂交育种
杂交育种诱导多倍体
秋水仙素
四倍体
四倍体
二倍体
1902年，哈伯兰特（G. Haberlandt，1854-1945）提出了细胞全能性的理论，但相关实验尝试没有成功。
1958年，斯图尔特（F. G. Steward，1904-1993）等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年，科金（E. C. Cocking，1931-）用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964年，古哈（S. Guha，1938-2007）等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉发育而成的胚。
1890年，希普（W. Heape，1855-1929）将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈里森（R. G. Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
1951年，张明觉（1908-1991）等发现哺乳动物精子的获能现象。
1958年，格登（J. Gurdon，1933-）用非洲爪蟾进行体细胞核移植，成功培育出性成熟个体。同一时期，童弟周（1902-1979）等开展了鱼类细胞核移植工作。
1959年试管兔诞生，之后多种试管动物相继出生。
1975年，米尔斯坦（C. Milstein，1927-2002）和科勒（G. K hler，1946-1995）等创立了单克隆抗体技术。
1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。
1996年，世界上第一只细胞克隆羊多莉在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。
1981年，埃文斯（M. J. Evans，1941-）等成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞。
2006年，山中伸弥（S. Yamanaka，1962-）等获得了诱导多能干细胞。我国科学家利用这种细胞培育出了 小鼠。
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。
2017年，我国科学家首次培育出体细胞克隆猴。
植物细胞工程
动物细胞工程（含胚胎工程）
1971年，卡尔森（P. S. Carlson，1944-2017）诱导烟草种间原生质体融合，获得种间杂种。
1974年，土壤农杆菌Ti质粒被发现。
植物组织培养
植物体细胞杂交
二 植物细胞工程的应用
1、快速繁殖
快速繁殖优良品种的_________________技术，被人们形象地称为植物的快速繁殖技术，也叫作____________技术。它不仅可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还可以保持优良品种的___________。
植物组织培养
微型繁殖
遗传特性
一、植物繁殖的新途径
快速繁殖
微型繁殖
无性繁殖
有丝分裂，保持亲代优良的遗传特性
1、快速繁殖
快速繁殖优良品种的_________________技术，被人们形象地称为植物的快速繁殖技术，也叫作____________技术。它不仅可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还可以保持优良品种的___________。
2、作物脱毒
马铃薯、草莓和香蕉等通常是用______繁殖的方式进行繁殖的，它们感染的______很容易传给后代。病毒在作物体内逐年积累，就会导致作物产量降低，品质变差。科学家就发现植物顶端________附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒。因此，切取一定大小的_______进行____________，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得________。
植物组织培养
微型繁殖
遗传特性
无性
病毒
分生区
茎尖
组织培养
脱毒苗
一、植物繁殖的新途径
马铃薯
草莓
香蕉
感染的病毒很容易传给后代
无性繁殖
病毒在作物体内积累
作物产量降低品质变差
顶端分生区
病毒极少，甚至无毒
（如茎尖、根尖)
植物组
织培养
脱毒苗
明显提高农作物产量和品质
一、植物繁殖的新途径
3、作物新品种的培育
单倍体育种
常规选育出一个可以稳定遗传的作物优良品种，一般要经过5～6年的连续筛选。而单倍体育种可以先通过花药（或花粉）培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加倍，当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株，这极大地缩短了育种的年限。此外，由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现，因此它也是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。
一、植物繁殖的新途径
单倍体育种
花药离体培养
人工诱导染色体加倍
优良品种
花药
花粉
离体培养
单倍体(A、a)
（一个染色体组）
纯合二倍体(AA、aa)
人工诱导
染色体加倍
选择
二倍体（Aa）
四倍体（AAaa）
单倍体(AA、aa、Aa)
（2个染色体组）
四倍体
(AAAA、aaaa、AAaa)
AABB × aabb
AaBb
A B
A b
a B
a b
A B
A b
a B
a b
AA BB
AA bb
aa BB
aa bb
减数分裂
花药离体培养
秋水仙素处理幼苗
亲本
F1
F1配子
单倍体
恢复 育性
高杆抗病
矮杆感病
F2
9A_B_
3A_bb
3aaB_
1aabb
多代连续自交选优，提高纯合体的比例
选优aaB_
纯合体
U
杂交育种
单倍体育种
育种时间较长
极大缩短育种时间
3、作物新品种的培育
单倍体育种
常规选育出一个可以稳定遗传的作物优良品种，一般要经过5～6年的连续筛选。而单倍体育种可以先通过花药（或花粉）培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加倍，当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株，这极大地缩短了育种的年限。此外，由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现，因此它也是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。
突变体的利用
在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。从产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。
一、植物繁殖的新途径
基因突变、染色体变异
次生代谢物：植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本的生命活动所必需的产物。
次生代谢物是一类小分子有机化合物（如酚类、萜类和含氮化合物等），在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。
次生代谢一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。
初生代谢物：有糖类、脂质、蛋白质和核酸等。初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，因此在整个生命过程中它一直进行着。
二、细胞产物的工厂化生产
由于植物细胞的次生代谢物含量很低，从植物组织提取会大量破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合成途径得到，因此人们期望利用植物细胞培养来获得目标产物，这个过程就是细胞产物的工厂化生产。
植物细胞培养：是指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。它不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，因此对于社会、经济、环境保护具有重要意义。
外植体
愈伤组织
细胞悬液
脱分化
振荡分散
悬浮培养
细胞产物
提取
含紫草宁
人参皂苷
植物细胞培养
外植体
愈伤组织
试管苗
脱分化
再分化
植株
作物脱毒
选择顶端分生组织
快速繁殖
单倍体育种
选择花药
进行诱变
突变体的利用
分散后
悬浮培养
细胞产物的工厂化生产
植物新品种的培育
植物繁殖的新途径
筛选

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