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动物细胞工程（一）
——动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞融合
单克隆抗体技术
核移植
动物细胞工程常用技术
一、动物细胞培养的概念
二、动物细胞培养的过程
三、干细胞
动物细胞培养
治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会存在免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出人的皮肤呢？
动物细胞培养
动物细胞培养是指从动物体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
动物细胞培养所需的基本条件
营养条件
其他条件
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
糖类、氨基酸、无机盐、维生素……
营养
将细胞所需的营养物质按照种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基
使用合成培养基时，（因为对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚）通常需要加入血清等天然成分
培养动物细胞一般使用液体培养基，也叫培养液
无菌、无毒的环境
无菌操作
定期更换培养液清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
温度、pH和渗透压
温度多36.5±0.5℃（哺乳动物）
pH 7.2～7.4
气体环境
O2是细胞代谢必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
通常将培养皿或松盖培养瓶置于95%空气＋5%CO2的混合气体CO2培养箱中培养。
一、动物细胞培养的概念
二、动物细胞培养的过程
三、干细胞
动物细胞培养
在从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。因此，在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用_______________、_________________等处理一段时间，将组织分散成_______________。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
胰蛋白酶
胶原蛋白酶
单个细胞
细胞贴壁现象
形成一层细胞
可形成多层细胞
胚胎或幼龄动物的组织块
胰蛋白酶（胶原蛋白酶）
剪碎
单细胞悬液
原代培养
传代培养
单细胞悬液
消化
细胞贴壁
接触抑制
消化
稀释分瓶
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
传代培养
制备细胞悬液
原代培养
转入培养液中
放入CO2培养箱中培养
分瓶培养
离心、收集细胞
细胞贴壁
接触抑制
思考1、为什么选用胚胎或幼龄动物的组织块？ 分析：胚胎或幼龄动物的组织细胞________________________。
思考2、贴附性细胞有什么特点？ 分析：存在____________和____________现象。
思考3：为什么要进行传代培养，一次传代中细胞分裂几次？
分析：动物组织消化后经过初次培养已经贴满瓶壁，出现____________，细胞不再______。一次传代培养，细胞分裂3到5次就又会出现接触抑制，需要用____________消化后才能继续传代培养。
分裂能力强，容易培养
细胞贴壁
接触抑制
接触抑制
分裂
胰蛋白酶
思考4、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？
分析：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是__________。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2—7.4，胃蛋白酶在此环境中____________，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化，但也不宜处理时间______。
蛋白质
没有活性
太长
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
细胞的全能性
细胞增殖
固体培养基
液体培养基
蔗糖、植物激素
葡萄糖、动物血清
植物体
大量动物细胞
快速繁殖、培育无病毒植株
获得细胞或细胞分泌蛋白
相同点：培养基中都需要加入营养物质、培养过程中都需要防止杂菌污染、都需要提供适宜的温度、pH和渗透压的条件。
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
细胞的全能性
细胞增殖
固体培养基
液体培养基
蔗糖、植物激素
葡萄糖 动物血清
植物体
大量动物细胞
快速繁殖、培育无病毒植株
获得细胞或细胞分泌蛋白
植物细胞(如愈伤组织细胞) 培养时，也需分散成单个细胞，制成细胞悬液用液体培养基培养。
一、动物细胞培养的概念
二、动物细胞培养的过程
三、干细胞
动物细胞培养
干细胞
胚胎干细胞
成体干细胞
成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的潜能。
存在于早期胚胎中，也叫ES细胞。具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和甚至器官的潜能。
成体
干细胞
骨髓、外周血和脐带血中：造血干细胞
血 细 胞
神经系统中：神经干细胞
睾丸中：精原干细胞
神经细胞
精原细胞
分化
分化
分化
干细胞与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
移植
修复或替换
正常
干细胞
患者
体内
受损的器官或组织
治愈疾病
正常的造血干细胞
移植
患者体内
修复或替换
受损的血细胞
治疗
白血病
造血系统、免疫系统功能障碍疾病
神经组织损伤和神经退行性疾病
帕金森病、阿尔茨海默病
正常的神经干细胞
移植
患者体内
修复或替换
受损神经组织
治疗
2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它成为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），之后用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。2007年，科学家通过类似的方法成功诱导出人类的iPS细胞。
体细胞
永生化
iPS细胞
细胞衰老
肿瘤细胞
c-Myc
Klf4
Oct3/4
Sox2
Klf4
科学家利用逆转录病毒将4种基因转入小鼠或人的体细胞中表达，体细胞可诱导转变为类胚胎干细胞。
iPS细胞存在导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用。
c-Myc作为原癌基因，一方面促进细胞的自我更新，另一方面也增加了细胞的成瘤性。
成纤维细胞
T细胞和B细胞
iPS
细胞
导入特定基因
导入特定蛋白
小分子化合物诱导
治疗心血管疾病
治疗阿尔茨海默病
①诱导过程无需破坏胚胎。
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
2006年，利用逆转录病毒载体将四个基因的组合转入已分化的小鼠胚胎或成体成纤维细胞，获得小鼠iPS细胞。2012年获得诺奖。
2007年，Jaenisch研究组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗小鼠镰刀状红细胞性贫血，这项研究从理论和实践上为人类单基因遗传病的治疗奠定了基础。
01
02
iPS细胞研究历史（标志性事件）
2009年，中国科学家周琪和曾凡一研究组由iPS细胞培育出了具有繁殖能力的小鼠：”小小”。在世界上首次证明了iPS细胞的全能性。由此，iPS细胞的研究进入了新纪元。
03
2008年，Ying Shao Yao 研究组报道，将皮肤癌细胞重编程为iPS细胞，该研究开辟了一条获得iPS细胞的新途径。
04
2013年，中国科学家邓宏魁研究组用四种小分子化合物组合诱导小鼠体细胞重编程为可分化发育为各种组织器官类型的多潜能干细胞，邓宏魁研究组将其命名为CiPS。该成果向制备无遗传修饰的iPS细胞方面迈出了一大步，开辟了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。
2014年，科学家利用能发育成多种细胞的诱导多功能干细胞(iPS细胞)制成视网膜细胞，并移植到一名70多岁的渗出型老年黄斑变性女患者的右眼中。这是世界首例利用iPS细胞完成的移植手术。
05
06
2018年，中国科学家丁胜研究组，通过靶向技术激活內源基因，可成功实现体细胞多功能性的诱导，获得iPS细胞。该研究不仅提供了一种构建诱导性多能干细胞的方法，也帮助人们更好地理解了表观遗传修饰调控细胞命运的机制。
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2021年，科学家借助基因技术，修改了iPS细胞中的基因，成功培养出只攻击癌细胞的T细胞，其效果已在小鼠实验中得到确认，朝着癌症免疫疗法实用化更进一步。
08

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