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(共43张PPT)
3.3.1
重组DNA技术的基本工具
一、限制酶
二、DNA连接酶
三、运载体（质粒、标记基因）
DNA重组技术的基本工具
汉水丑生作品
（QQ:70939118）
四、单酶切和双酶切
磷酸酯键
基因工程是在DNA上进行的______水平的设计施工，需要有专门的工具。
分子
限制性内切核酸酶（简称__________）
限制酶
限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制酶是细胞的一种防御性工具。当原核细胞遭到外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效。
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
限制酶的专一性体现在：一种限制酶能够识别双链DNA分子的______________，并且使每一条链中特定部位的两个__________之间的_____________断开。
大肠杆菌中的一种叫做EcoR I的限制酶，能够专一识别DNA中的__________序列，并在G和A之间将这段序列切开（实质是在____________与14______________之间切断磷酸二酯键）。
特定核苷酸序列
核苷酸
磷酸二酯键
GAATTC
鸟嘌呤脱氧核苷酸
腺嘌呤脱氧核苷酸
基因的“剪刀”
（5 ′）黏性末端
5′
5′
平末端
5′
3′
5′
3′
中心轴线
EcoRⅠ
5′
3′
5′
3′
SmaⅠ
基因的“剪刀”
SmaI能够专一识别DNA中的___________序列，并在________之间将这段序列切开（实质是在鸟嘌呤脱氧核苷酸与胞嘧啶脱氧核苷酸之间切断磷酸二酯键）。
当限制酶在它识别序列的__________________将DNA的两条链分别切开时，产生的是______末端，而当限制酶在它识别序列的_____________切开时，产生的则是平末端。EcoRI切割DNA产生______末端，SmaI切割DNA产生______末端。
GGGCCC
G和C
中心轴线两侧
黏性
中心轴线处
黏性
平
基因的“剪刀”
同尾酶
限制酶的识别序列通常为6个核苷酸，也有的为4个核苷酸或8个核苷酸
一、限制酶
二、DNA连接酶
三、运载体（质粒、标记基因）
DNA重组技术的基本工具
汉水丑生作品
（QQ:70939118）
四、单酶切和双酶切
现有来自两种生物的DNA片段1和DNA片段2，用同一种限制酶处理后，DNA片段1和2带有______的黏性末端。在一个混合体系中，DNA片段1和2随机碰撞在一起时，黏性末端之间会自发形成______，但不同DNA片段骨架上的缺口无法自动连接。
DNA连接酶的作用是：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被________切开的两个__________之间的____________。
相同
氢键
限制酶
核苷酸
磷酸二酯键
基因的“针线”
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
5′
5′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
T4 DNA连接酶
E.coli DNA连接酶
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
3′
3′
5′
5′
5′
5′
5′
5′
T4 DNA连接酶
DNA连接酶的作用示意图
DNA聚合酶的作用示意图
同尾酶
练习1、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
（1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
（3）DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割， _______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。
能
不一定能
能
不一定
练习1、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
（3）DNA1被限制酶I切割，DNA1被限制酶II切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割， _______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。
能
不一定
—GGATCX—
—CCTAGX—
—XGATCX—
—XCTAGX—
—G
—CCTAG
GATCX—
X—
—GGATCC—
—CCTAGG—
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
一、限制酶
二、DNA连接酶
三、运载体（质粒、标记基因）
DNA重组技术的基本工具
汉水丑生作品
（QQ:70939118）
四、单酶切和双酶切
通常是利用______作为载体，将目的基因送入受体细胞中。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或细菌拟核DNA之外，并具有___________能力的很小的双链______DNA分子。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有________________、_________等。
质粒
自我复制
环状
噬菌体
动植物病毒
一段特殊的DNA序列，DNA聚合酶的识别和结合位点
基因的“运输车”
质粒作为运载体的优点：
①质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，便于_____________________；
②质粒含有复制原点，可在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞______________；
③质粒DNA分子上有特殊的____________，
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，
供重组DNA的________________。
外源DNA片段
（目的基因）插入
染色体DNA上
标记基因
鉴定和选择
基因的“运输车”
思考：形成一个重组质粒会形成_____个磷酸酯键？
4
练习2、普通的细菌一般是对抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四环素的培养基中______（能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的____________可使细菌获得抵抗四环素的性状。
敏感
不能
表达产物
2016课标I卷40、
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是_________________________________
_________________________；并且____________________和_____________________________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________________________。
二者均不含氨苄青霉素抗性基因，
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，
在该培养基上均不能生长
在该培养基上均能生长
含有质粒载体
含有插入了目的基因的重组质粒
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有＿＿＿＿的固体培养基。
四环素
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一、限制酶
二、DNA连接酶
三、运载体（质粒、标记基因）
DNA重组技术的基本工具
汉水丑生作品
（QQ:70939118）
四、单酶切和双酶切
练习4、图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，
__________________________________________________________。
目的基因
质粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
关于限制酶的选择
练习4、图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成________________________连接的环状产物以及_______________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是______________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。


…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…




…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GAGC CATACTTAA
AATTCTCG GTATG
目的基因
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GAGC CATACTTAA
AATTCTCG GTATG
目的基因
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGC CATACTTAA
AATTCTCG GTATG
目的基因
单酶切：同一种限制酶切割目的基因和质粒
在反应体系中会加入大量的含目的基因的DNA片段和大量的质粒，加入同一种限制酶和DNA连接酶后，会出现质粒自身首尾成环、两个质粒成环、目的基因片段首尾成环、两个目的基因片段成环、目的基因正向插入质粒、目的基因反向插入质粒等多种情况。
BamH Ⅰ
GGATCCAAGCTTGGG
CCTAGGTTCGAACCC
CCCAAGCTT
GGGTTCGAA
Hind Ⅲ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
Bt基因
Hind Ⅲ
Xba Ⅰ
Sma Ⅰ
多
克
隆
位
点
动
子
启
终
子
止
标
R
记
基
因
Kan
复制
原点
Bt基因
Bt基因
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt基因
Bt基因
Bt基因
DNA连接酶
同一种限制酶切（单酶切）
Bt
Bt
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
同两种限制酶切（双酶切）
质粒与质粒连接后的运载体过大，导致转化难以发生，故不予考虑
避免自身环化，增大目的基因和运载体连接的概率，
少
能避免反向连接
AGCTT
A
G
CCTAG
Bt基因
5′
5′
Bt
基因
练习4、图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成________________________连接的环状产物以及_______________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是______________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。
目的基因与目的基因
质粒片段与质粒片段
反向连接
练习4、图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（4）为避免目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，例如可选择用__________和__________这两种限制酶。
PstⅠ
EcoRⅠ
实验原理
可以利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在理化性方面的差异，对它们进行提取
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液中
在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂
DNA的粗提取与鉴定
1．30g洋葱切碎 ＋10mL研磨液，充分研磨。
2．双层纱布过滤，4℃放置几分钟，取上清液。加入等体积冷酒精，静置2～3min，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。
可替换操作：
1500r/min离心5min，取上清液。然后10000r/min离心5min，取管底沉淀物晾干。
DNA的粗提取与鉴定
3．2M的NaCl 5mL＋丝状物或沉淀物。再加二苯胺试剂4mL混匀，沸水浴5min，冷却后观察到蓝色（不加DNA做对照）。

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