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(共51张PPT)
3.3.2
基因工程操作的基本程序
一、PCR的原理
二、PCR的应用
三、电泳的原理和应用
PCR和电泳
PCR的全称是_________________，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
细胞内DNA复制的时候，解旋是靠__________完成的，合成DNA子链时要用到DNA聚合酶。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链，因此DNA复制需要______，其作用是_________________________。
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5‘
AUCGCG
5‘
RNA引物Ⅰ
RNA引物Ⅱ
TAGCGCTATCGCATCGACGCT
3’
ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
聚合酶链式反应
解旋酶
引物
给DNA聚合酶提供3’端
3′
5′
DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。
PCR技术中，解开双链没有用解旋酶，而是利用的DNA的热变性和复性的原理。
变性：在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开
复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链
PCR技术中使用的DNA聚合酶是能够耐高温的Taq 酶（在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%）。
变性：当PCR反应体系的温度设定为95℃时，模板DNA的氢键被破坏，模板DNA变为单链；
复性（退火）：当PCR反应体系的温度降为55 ℃时候，碱基互补的DNA片段之间会自发形成氢键，恢复双链结构。此时会有一些引物片段与单链模板DNA结合，为Taq 酶提供3’。
延伸：此后将PCR反应体系的温度升高为72℃，Taq 酶沿着引物3’扩增DNA。
92
55
75
℃
3`
5`
5`
3`
将模板DNA、4种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq酶、过量的2种引物、Mg2+加入缓冲溶液中。
引物1
引物2
原料
模板DNA
目的基因
Taq聚合酶
92
55
75
℃
变性
3`
5`
5`
3`
92
55
75
℃
退火
思考、引物为何会结合在图中所示位置？
92
55
75
℃
延伸
92
55
75
℃
变性
92
55
75
℃
退火
92
55
75
℃
延伸
92
55
75
℃
变性
92
55
75
℃
退火
92
55
75
℃
延伸
第1次扩增
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
第2次扩增
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
2
3
3
第3次扩增
短链-短链DNA______个
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
4
2
7
7
第4次扩增
短链-短链DNA______个
中长链-短链DNA____个
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
6
8
15
15
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
2×2n-2
2
3`
5`
5`
3`
思考、如果两种引物结合在模板DNA的一条链上，扩增结果如何？
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
C
B
C
D
E
A
D
引物丙
引物乙
引物甲
A
B
C
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
C
引物丙
引物乙
引物丙
引物乙
B
C
A
A
B
C
B
C
A
引物丙
引物乙
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
C
B
C
D
E
A
D
引物丙
引物乙
引物甲
B
C
D
E
A
C
引物乙
B
C
D
E
A
D
B
C
D
E
A
C
引物乙
引物甲
引物甲
引物乙
引物乙
引物甲
B
C
E
A
D
D
C
PCR技术扩增目的基因
如果目的基因的核苷酸序列未知，但知道目的基因两端的部分_____________，就可以设计合适的______，利用PCR技术大量扩增出目的基因。
核苷酸序列
引物
PCR反应需要在一定的______溶液中进行，需提供：____________、 _______________（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、________和_________________，同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为______、______和______。控制的温度分别是______、______和______。
缓冲
DNA模板
4种脱氧核苷酸
两种引物
耐高温的DNA聚合酶
变性
复性
延伸
95℃
55℃
72℃
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 思考5、dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？
①引物的长度通常为20-30bp。
②引物自身不能含互补序列，否则会形成二级发卡结构；两个引物在3‘端也不应出现同源性，避免形成引物二聚体。
③引物浓度不宜过高，否则会错配。
引物：决定PCR特异性扩增的关键
一、PCR的原理
二、PCR的应用
三、电泳的原理和应用
PCR和电泳
5′
3′
5′
3′
待添加的限制酶的识别序列
5′
5′
5′
5′
5′
3′
3′
5′
3′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
思考、若目的基因两侧无合适的限制酶切割位点怎么办？
待添加的限制酶的识别序列
5′
3′
3′
5′
3′
3′
5
3
5
3
5
3
5
3
第一轮
第二轮
2021湖北卷16. 某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A .增加模板DNA的量
B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间
D. 提高复性的温度
3′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
3′
5′
再依靠另两种末端引物进行PCR。不同大小的扩增产物用电泳分离
3′
3′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
5′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
3′
5′
5′
5′
3′
3′
思考、如何利用PCR得到融合基因？
思考、如何利用PCR对基因进行定点突变？
5
3
5
3
A
T
G
5
3
5
3
5
3
A
G
5
3
5
3
T
5
3
A
第一轮
第二轮
G
5
3
5
C
3
5
3
A
G
5
3
5
3
5
3
A
T
G
5
3
5
3
3
5
5
G
T
A
3
5
3
5
3
5
G
3
5
3
C
5
3
5
3
A
T
3
5
5
G
3
5
3
C
5
3
C
一、PCR的原理
二、PCR的应用
三、电泳的原理和应用
PCR和电泳
电泳是指_______________________________________________。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上_____________。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷______的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子___________________以及_______________，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
_____________电泳和____________________电泳是两种常用的电泳方法。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它___________________以及_____________等因素。
带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
正电或负电
相反
带电性质的差异
分子本身的大小和形状的不同
琼脂糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
所带净电荷的多少
分子的大小
DNA琼脂糖凝胶
琼脂糖的微结构
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
pH=8左右时，DNA分子带负电。在碱性环境下，不同的DNA分子具有相同的电荷密度。DNA分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。
电泳一般需要Marker（标记），为一组已知分子量的标准DNA片段，在电泳中作为未知样品大小的参照物。如D2000 plus DNA Ladder含有9条双链DNA分子，其分子量为100，250，500，750，1000，1500 ， 2000，3000，5000 bp。
电泳结果
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小。
SDS的作用：
①SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成_____________；
②SDS能与各种蛋白质（肽链）形成_________，SDS所带负电荷的量____________蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的____________，使电泳迁移率完全取决于____________。
单条肽链
复合物
大大超过
电荷差别
分子的大小
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分子量，其原理是？
分析：使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得换算，可以测定未知蛋白质的分子量。

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