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3.3.2
基因工程操作的基本程序
（第2课时）基因工程操作基的本程序
一、目的基因的获取
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
基因工程操作的基本程序
四、目的基因的检测与鉴定
用于______________________或______________________等的基因就是目的基因。目的基因主要是指______________的基因，如与生物抗逆性、优良品质等相关的基因。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的_________来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生__________抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因——Bt抗虫蛋白基因，简称__________。
目的基因
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
编码蛋白质
消化系统
Bt抗虫蛋白
Bt基因
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的_____________结合，导致___________，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的______性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈_____性，肠道细胞也没有______________。因此，Bt 抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
细胞膜穿孔
特异性受体
碱
酸
特异性受体
生物材料
人工合成
获取目的基因
DNA
cDNA
一定大小范围的DNA
PCR
mRNA
基因组文库 cDNA文库
基因文库
包括
限制酶
酶切
逆转录
导入受体菌中保存
在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即_____________和从___________中分离。
人工合成
生物材料
基因比较小，核苷酸序列又已知
DNA合成仪
基因组文库
从细胞中提取DNA
细胞
基因组DNA
质粒
质粒酶切
DNA连接酶连接
限制酶酶切
导入细菌中
基因组文库克隆
提取
酶切的DNA片段
cDNA文库
逆转录
逆转录酶
酶切的cDNA片段
限制酶酶切
质粒
质粒酶切
连接
导入细菌中
cDNA文库克隆
提取
基因组DNA限制酶酶切
mRNA逆转录得cDNA，酶切
拼接质粒，导入细菌中保存为文库
基因组文库
cDNA文库
（部分基因文库）
生物材料
人工合成
获取目的基因
DNA
cDNA
一定大小范围的DNA
PCR
mRNA
基因组文库 cDNA文库
基因文库
包括
限制酶
酶切
逆转录
导入受体菌中保存
在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即_____________和从___________中分离。
人工合成
生物材料
基因比较小，核苷酸序列又已知
DNA合成仪
一、目的基因的获取
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
基因工程操作的基本程序
四、目的基因的检测与鉴定
获取了足够量的目的基因（Bt基因）后，下一步就是要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体。这一步是培育转基因抗虫棉的核心工作。
pBI121载体
多克隆位点是目的基因插入部位，一般具有多种限制酶的酶切位点
RNA聚合酶识别位点，启动转录。具有物种和组织细胞特异性
可转移至细胞的染色体DNA上
抗卡那霉素基因，用于重组质粒的筛选
T-DNA
T-DNA
动
子
启
标
R
记
基
因
Kan
多
克
隆
位
点
复制
原点
终
子
止
转录终止信号
启动子位于基因上游，是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录。
组成型启动子（一直干活）
组织特异性启动子（特定组织中干活）
诱导性启动子（特定诱导物下干活）
终止子位于基因下游，提供转录终止的信号。
目的基因
限制酶切割位点
构建程序：先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶（同尾酶）切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
一、目的基因的获取
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
基因工程操作的基本程序
四、目的基因的检测与鉴定
转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加纯化的表达载体，使目的基因借助____________进入受体细胞。我国的________________就是用此种方法获得的。
花粉管通道
转基因抗虫棉
第三步：将目的基因导入植物细胞（花粉管通道法）
Ti质粒
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现新性状的植物
转基因植物细胞
染色体DNA
植物叶片切下与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，或将花序培养在农杆菌溶液中，获得种子，然后筛选、鉴定
第三步：将目的基因导入植物细胞（农杆菌转化法）
组培
把目的基因插入到农杆菌的__________的________上，构建重组质粒。将重组质粒转入农杆菌，然后用农杆菌侵染植物细胞。侵染过程中，目的基因随着__________转移到植物细胞，并插入到植物细胞的____________上。转基因的植物细胞还需要通过_________________技术才能发育成转基因植株。
Ti质粒
T-DNA
T-DNA
染色体DNA
植物组织培养
第三步：将目的基因导入植物细胞（农杆菌转化法）
思考、如果抗虫基因只插入到植物细胞的一条染色体上，转基因植物相当于______（纯合子/杂合子）。如果转基因植株的染色体上成功导入了2个抗虫基因，则理论上，该转基因植株自交的后代中，抗虫植株所占的比例为 ______或 ______或 ______。
甲自交 → 全为抗虫
乙自交 → 抗虫：不抗虫=3：1
丙自交 → 抗虫：不抗虫=15：1
杂合子
最常用的方法是______________。
操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯→从雌性动物体内取出卵（卵可以在体内受精，也可以在体外受精）→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植到雌性动物的输卵管或子宫内→转基因动物。
显微注射法
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化动物细胞）
早期的基因工程操作都用____________作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。转化大肠杆菌细胞最常用的方法是：首先用______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为__________细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于______液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
原核生物
Ca2+
感受态
缓冲
原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化微生物细胞）
思考：为什么早期基因工程都用原核细胞作为受体细胞？
一、目的基因的获取
二、基因表达载体的构建
三、将目的基因导入受体细胞
基因工程操作的基本程序
四、目的基因的检测与鉴定
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
PCR
第四步：目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测）
提取培育出的转基因植株细胞中的DNA，依据目的基因两端的特异性序列设计两种引物，对转基因植物细胞中的DNA进行PCR扩增。对扩增产物进行电泳鉴定。
1、分子水平的检测（检测目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上）
提取培育出的转基因植株细胞中的RNA，依据目的基因两端的特异性序列设计两种引物，对转基因植物细胞中的DNA进行RT-PCR 扩增。对扩增产物进行电泳鉴定。
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
第四步：目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测）
1、分子水平的检测（检测目的基因是否转录出mRNA ）
第四步：目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测）
抗原—抗体杂交
原理：抗原与抗体特异性结合。
应用：用标记的抗体检测待测样品中是否存在对应的抗原。也可用标记的抗原检测待测样品中是否存在对应的抗体。
1、分子水平的检测（检测目的基因是否基因是否翻译为蛋白质）
第四步：目的基因的检测与鉴定（个体水平的鉴定）
2、个体生物学水平的鉴定
例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做____________________实验，以确定是否具有抗性以及____________。又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的__________是否与天然产品相同。
抗虫或抗病的接种
抗性的程度
功能活性
转基因生物 检测方法 观察指标
抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能
活性正常
常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法（列举如下表）
基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的的一条链发生碱基互补配对。
DNA1
DNA2
检测目的基因是否插入和转录，还可以用探针。
基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与____________________碱基互补配对，并带有________________标记或荧光标记。
例如，胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的________形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有_____________，也可以检测胰岛素基因是否______。
人体的细胞中，胰岛B细胞的______________（DNA/RNA/DNA和RNA）能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有______（DNA/RNA）能与之形成杂交分子。
目的基因的一条链
放射性同位素
mRNA
胰岛素基因
转录
DNA和RNA
DNA
卵清蛋白基因 唾液淀粉酶基因 胰岛素基因 卵清蛋白 唾液淀粉酶 胰岛素
输卵管细胞 ＋ ＋ ＋ ＋ — —
唾液腺细胞 ＋ ＋ ＋ — ＋ —
胰岛细胞 ＋ ＋ ＋ — — ＋
总DNA（基因）
蛋白质
“＋”表示有，“－”表示无

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