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专题17 基因工程
考点01 重组DNA技术的基本工具
一、多选题
1．（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（ ）
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
考点02 DNA的粗提取、PCR、电泳鉴定
一、单选题
2．（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（ ）
A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团
3．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）对下列关于中学生物学实验的描述错误的是（ ）
①探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用
②观察植物细胞的质壁分离现象
③探究培养液中酵母菌种群数量的变化
④观察植物细胞的有丝分裂
⑤观察叶绿体和细胞质的流动
⑥DNA的粗提取与鉴定
A．①⑥通过观察颜色判断实验结果 B．③⑥均须进行离心操作
C．②④均可使用洋葱作为实验材料 D．②⑤实验过程均须保持细胞活性
4．（2025·湖南·高考真题）用替代的实验材料或者试剂开展下列实验，不能达成实验目的的是（　　）
选项 实验内容 替代措施
A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片”
B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”
C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”
D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”
A．A B．B C．C D．D
5．（2025·河北·高考真题）某科创小组将叶绿素合成相关基因转入小麦愈伤组织，获得再生植株，并进行相关检测。下列实验操作错误的是（ ）
A．将种子消毒后，取种胚接种到适当的固体培养基诱导愈伤组织
B．在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA
C．将小麦色素提取液滴加到滤纸条，然后将色素滴加部位浸入层析液进行层析
D．对叶片抽气处理后，转到富含CO2的清水中，探究不同光照下的光合作用强度
二、多选题
6．（2025·河北·高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（ ）
注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测
A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500
B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同
C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变
D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病
二、解答题
7．（2025·河南·高考真题）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型：紧凑株型=3：1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题：
(1)该紧凑株型性状由 （填“A”或“a”）基因控制。
(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是 。
(3)研究人员设计了3条引物（P1~P3），位置如图1（→表示引物5 →3 方向）。以3个F2单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B（不考虑PCR结果异常）。
①图2-A中使用的引物组合是 ；丙单株无扩增条带的原因是 。
②结合图2-A的扩增结果，在图2-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑） 。
③使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型= 。
8．（2025·云南·高考真题）冬瓜果面有蜡粉可提高果实抗病、耐日灼和耐储性。为探究冬瓜果面蜡粉的遗传方式并对蜡粉基因（用“A”“a”表示）进行定位，科研人员进行了一系列杂交实验，结果如表。
群体 植株总数/株 果面有蜡粉株数/株 果面无蜡粉株数/株
P1 30 30 0
P2 30 0 30
F1 523 523 0
F2 574 430 144
注：F1为P1和P2杂交后代，F2为F1自交后代。
回答下列问题：
(1)根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的 定律，依据是 。
(2)实验证明蜡粉性状的改变是由基因突变引起的，突变基因上出现了一个限制酶H的切割位点，可用于在苗期筛选出果实表面有蜡粉的植株，据此设计引物后进行植株基因型鉴定的步骤为：提取基因组DNA→ 目的DNA片段→限制酶H切割扩增产物→电泳。结果显示P1植株为1条条带，P2植株为2条条带，则F2中有蜡粉的植株为 条条带，限制酶H的切割位点位于 （填“A”“a”或“A和a”）上。
(3)用表中材料设计实验，验证（1）中得到的结论，写出所选材料及遗传图解。
9．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。
野生动物个体识别的新方法
识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。
微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。
依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。

有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（如表）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。
两次采样所鉴定出的貉的个体编号
第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号
N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13
N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24
第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号
N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26
N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37
N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46
(1)图2中个体B的“基因型”为 。
(2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和 的数目决定的。
(3)科学家根据表1信息，使用了 法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为 。
(4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例 。
10．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取① ，加入乙醇
② 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg 缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
11．（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题：
(1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为 。
(2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a：
①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的 ；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的 （填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。
②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为 [书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是 。
③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明 。
考点03 基因工程的基本操作程序及应用和蛋白质工程
一、单选题
12．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（ ）
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
二、解答题
13．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
14．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。
15．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。
回答下列问题：
(1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。
(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。
(3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。
16．（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过 （方法）将该质粒转入植物细胞，并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
17．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。

限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。

18．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是 （答出两点即可）。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有 （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
19．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。
(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号）
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
20．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题：
(1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是 。
(2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内 （填细胞结构名称）的改变。
(3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 。
(4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入 序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。
(5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是： 。
(6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是： 。
21．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
22．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。
23．（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题：
(1)基因内碱基的增添、缺失或 都可导致基因突变。
(2)以Aa植株为 （填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为 。
(3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生 种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为 。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为 。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为 。
(4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验：
①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为 的F1植株。
②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为 ；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为 。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因： 。
24．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
25．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路 。
26．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：

(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。
A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2 B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
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21世纪教育网(www.21cnjy.com)专题17 基因工程
考点01 重组DNA技术的基本工具
一、多选题
1．（2025·江苏·高考真题）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（ ）
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
【答案】BD
【难度】0.4
【知识点】基因突变、DNA重组技术的基本工具
【分析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。
【详解】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误；
B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；
C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误；
D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。
故选BD。
考点02 DNA的粗提取、PCR、电泳鉴定
一、单选题
2．（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（ ）
A．1'-碱基 B．2'-氢 C．3'-羟基 D．5'-磷酸基团
【答案】C
【难度】0.85
【知识点】DNA分子的结构和特点、PCR扩增的原理与过程
【分析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。
【详解】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。
故选C。
3．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）对下列关于中学生物学实验的描述错误的是（ ）
①探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用
②观察植物细胞的质壁分离现象
③探究培养液中酵母菌种群数量的变化
④观察植物细胞的有丝分裂
⑤观察叶绿体和细胞质的流动
⑥DNA的粗提取与鉴定
A．①⑥通过观察颜色判断实验结果 B．③⑥均须进行离心操作
C．②④均可使用洋葱作为实验材料 D．②⑤实验过程均须保持细胞活性
【答案】B
【难度】0.65
【知识点】质壁分离及其复原实验、酶的特性、有丝分裂实验、DNA的粗提取及鉴定
【分析】探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用的实验中，最后需要用斐林试剂检测，因此需要水浴加热和根据颜色反应来确定。
【详解】A、淀粉和蔗糖都不是还原糖，不能与斐林试剂反应，淀粉和蔗糖水解产物为还原糖，可以与斐林试剂反应，因此可以用斐林试剂鉴定淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用，若淀粉组出现红黄色，蔗糖组没有出现红黄色，说明淀粉酶可以催化淀粉水解不能催化蔗糖水解；⑥中DNA与二苯胺在沸水浴下显蓝色，因此①⑥均通过颜色判断结果，A正确；
B、③通过血球计数板直接计数酵母菌，无需离心；⑥需离心去除杂质以提取DNA，B错误；
C、②可用洋葱紫色外表皮观察质壁分离，④可用洋葱根尖分生区观察有丝分裂，C正确；
D、②活的植物细胞原生质体具有选择透性，可以发生质壁分离现象；⑤活细胞的叶绿体和细胞质才能流动，因此
②⑤实验过程均须保持细胞活性，D正确。
故选B。
4．（2025·湖南·高考真题）用替代的实验材料或者试剂开展下列实验，不能达成实验目的的是（　　）
选项 实验内容 替代措施
A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片”
B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”
C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”
D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”
A．A B．B C．C D．D
【答案】B
【难度】0.65
【知识点】观察叶绿体、线粒体和细胞质流动实验、酶促反应的因素及实验、有丝分裂实验、DNA的粗提取及鉴定
【分析】制作装片流程：解离→漂洗→染色→制片。解离的目的是用药液使组织中的细胞相互分离开来，漂洗的目的是洗去药液，防止解离过度，染色时用甲紫溶液或醋酸洋红液能使染色体着色。
【详解】A、藓类叶片薄，只有一层细胞，可直接用于观察叶绿体，菠菜叶由多层细胞构成，但可用菠菜叶稍带些叶肉的下表皮细胞来观察叶绿体，因为叶肉细胞中有叶绿体，所以能用“菠菜叶”替代“藓类叶片”进行高倍显微镜观察叶绿体的实验，A正确；
B、猪是哺乳动物，猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，也就不含DNA，而猪肝细胞含有细胞核和线粒体等含有DNA的结构，所以不能用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”进行DNA的粗提取与鉴定实验，B错误；
C、醋酸洋红液和甲紫溶液都属于碱性染料，都能使染色体着色，所以在观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂实验中，能用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”，C正确；
D、肝脏研磨液中含有过氧化氢酶，所以在比较过氧化氢在不同条件下的分解实验中，能用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”，D正确。
故选B。
5．（2025·河北·高考真题）某科创小组将叶绿素合成相关基因转入小麦愈伤组织，获得再生植株，并进行相关检测。下列实验操作错误的是（ ）
A．将种子消毒后，取种胚接种到适当的固体培养基诱导愈伤组织
B．在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定DNA
C．将小麦色素提取液滴加到滤纸条，然后将色素滴加部位浸入层析液进行层析
D．对叶片抽气处理后，转到富含CO2的清水中，探究不同光照下的光合作用强度
【答案】C
【难度】0.85
【知识点】绿叶中色素的提取和分离实验、影响光合作用的因素、DNA的粗提取及鉴定、植物组织的培养及基本过程
【分析】色素提取的原理：叶绿体中的色素溶解于有机溶剂，如无水乙醇；色素分离的原理：四种色素在层析液中的溶解度不同，因而随层析液在滤纸上扩散的速度不同，溶解度越高，扩散速度越快，溶解度越低，扩散速度越慢。
【详解】A、将种子消毒后，取种胚接种到适当的固体培养基可以诱导愈伤组织，这是植物组织培养中常用的获取愈伤组织的方法，A正确；
B、在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色反应，以此来鉴定DNA，B正确；
C、在进行色素层析时，色素滴加部位不能浸入层析液，否则色素会溶解在层析液中，无法在滤纸条上进行层析分离，C错误；
D、对叶片抽气处理后，转到富含CO2的清水中，通过观察不同光照下叶片上浮的情况等可以探究不同光照下的光合作用强度，D正确。
故选C。
二、多选题
6．（2025·河北·高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（ ）
注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测
A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500
B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同
C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变
D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病
【答案】AB
【难度】0.4
【知识点】伴性遗传的遗传规律及应用、PCR扩增的原理与过程
【分析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。
【详解】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A错误；
B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误；
C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确；
D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。
故选AB。
二、解答题
7．（2025·河南·高考真题）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型：紧凑株型=3：1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题：
(1)该紧凑株型性状由 （填“A”或“a”）基因控制。
(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是 。
(3)研究人员设计了3条引物（P1~P3），位置如图1（→表示引物5 →3 方向）。以3个F2单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B（不考虑PCR结果异常）。
①图2-A中使用的引物组合是 ；丙单株无扩增条带的原因是 。
②结合图2-A的扩增结果，在图2-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑） 。
③使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型= 。
【答案】(1)a
(2)插入序列后，a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译
(3) P2和P3 丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物 2∶1
【难度】0.65
【知识点】基因分离定律的实质和应用、遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、性状的显、隐性关系及基因型、表现型、等位基因
【分析】基因分离定律的实质：杂合体内，等位基因在减数分裂形成配子时随同源染色体的分开而分离，进入两个不同的配子，独立的随配子遗传给后代。
【详解】（1）根据题意可知，研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型=3∶1，说明紧凑株型为隐性性状，由a基因控制。
（2）在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，说明终止密码子提前出现，因此推测可能是A基因内部插入一段序列后，使a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译。
（3）①子二代中的基因型为AA、Aa、aa，根据图示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则A基因和a基因均能扩增出相应产物，只是a基因扩增的产物长度要大于A基因扩增的产物，即AA的个体扩增产物的电泳条带与aa的个体扩增产物的电泳条带不同，且Aa的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图A不符，若选择引物P3和P2进行扩增，则只有Aa和aa的个体中因含有a基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，而AA的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图2-A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。
②图A是利用引物P3和P2扩增后电泳的结果，则图B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，因此AA（松散株型）、aa（紧凑株型）基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，且aa基因的个体扩增的产物电泳时形成的电泳条带距离点样孔近，而Aa（松散株型）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带，故乙与丙的电泳条带为 。
③使用图2-A中的引物组合（P3和P2）扩增F2全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A-为松散株型，而子二代中Aa∶AA=2∶1，所以使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型（Aa）∶无扩增条带松散株型（AA）=2∶1。
8．（2025·云南·高考真题）冬瓜果面有蜡粉可提高果实抗病、耐日灼和耐储性。为探究冬瓜果面蜡粉的遗传方式并对蜡粉基因（用“A”“a”表示）进行定位，科研人员进行了一系列杂交实验，结果如表。
群体 植株总数/株 果面有蜡粉株数/株 果面无蜡粉株数/株
P1 30 30 0
P2 30 0 30
F1 523 523 0
F2 574 430 144
注：F1为P1和P2杂交后代，F2为F1自交后代。
回答下列问题：
(1)根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的 定律，依据是 。
(2)实验证明蜡粉性状的改变是由基因突变引起的，突变基因上出现了一个限制酶H的切割位点，可用于在苗期筛选出果实表面有蜡粉的植株，据此设计引物后进行植株基因型鉴定的步骤为：提取基因组DNA→ 目的DNA片段→限制酶H切割扩增产物→电泳。结果显示P1植株为1条条带，P2植株为2条条带，则F2中有蜡粉的植株为 条条带，限制酶H的切割位点位于 （填“A”“a”或“A和a”）上。
(3)用表中材料设计实验，验证（1）中得到的结论，写出所选材料及遗传图解。
【答案】(1) 分离 F2中出现3:1的性状分离比，符合一对等位基因的遗传规律
(2) PCR扩增 1或3 a
(3)选用材料：F1植株和P2植株
遗传图解
【难度】0.65
【知识点】基因分离定律的实质和应用、PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具
【分析】基因分离定律：在生物的体细胞中，控制同一性状的遗传因子成对存在，不相融合；在形成配子时，成对的遗传因子发生分离，分离后的遗传因子分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代。
【详解】（1）根据杂交结果可知，果面蜡粉的遗传遵循基因的分离定律，因为F1自交得到的F2中，果面有蜡粉株数与果面无蜡粉株数之比约为3：1（430：144≈3：1），符合基因分离定律中杂合子自交后代性状分离比3：1的比值。
（2）要进行植株基因型鉴定，在提取基因组DNA后，需要通过PCR扩增目的DNA片段。P1植株为1条条带，P2植株为2条条带，说明P1为纯合子且其基因不能被限制酶H切割（假设P1基因型为AA），P2为纯合子且其基因能被限制酶H切割（假设P2基因型为aa），限制酶H的切割位点位于a上。F1基因型为Aa，F2中有蜡粉的植株基因型为AA或Aa。AA只有1条条带（不能被切割），Aa会有3条条带（A不能被切割为1条，a被切割为2条），所以F2中有蜡粉的植株为1条或3条条带。
（3）验证分离定律，采用测交的方法，所选材料：F1Aa与P2aa（测交实验可以验证基因的分离定律）。
9．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。
野生动物个体识别的新方法
识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。
微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。
依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。

有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（如表）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。
两次采样所鉴定出的貉的个体编号
第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号
N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13
N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24
第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号
N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26
N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37
N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46
(1)图2中个体B的“基因型”为 。
(2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和 的数目决定的。
(3)科学家根据表1信息，使用了 法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为 。
(4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例 。
【答案】(1)174/174
(2)重复单位
(3) 标记重捕 根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。
(4)从现有 DNA 样品中，选择 Y 染色体上特有的微卫星 DNA 序列，设计特异性引物；对所有 DNA 样品进行 PCR 扩增；对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性，若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性；统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。
【难度】0.4
【知识点】种群密度的调查方法及应用、PCR扩增的原理与过程
【分析】标记重捕法是一种用于估算动物种群数量的常用方法。其原理是在被调查种群的活动范围内，捕获一部分个体，做上标记后再放回原来的环境，经过一段时间后进行重捕，根据重捕到的动物中标记个体数占总个体数的比例，来估计种群密度。标记重捕法适用于活动能力强、活动范围大的动物，使用时需要满足一定条件，比如标记个体与未标记个体在重捕时被捕获的概率相等，在调查期间没有个体迁入、迁出、出生、死亡等。
【详解】（1）从图 2 中可知，个体 B 扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为 174 ，根据 “以片段长度命名” 等位基因进而确定基因型的规则，个体 B 的 “基因型” 为 174/174。
（2）根据题干信息 “每个位置的微卫星 DNA 可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体” 可知，使用微卫星 DNA 鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星 “基因” 的数目和重复单位的数目决定的。
（3）科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集 30 份粪便样品鉴定出 24 个不同个体（相当于标记数M=24），第二次采集 40 份粪便样品鉴定出 32 个不同个体（相当于重捕数n=32），其中两次都有的个体数为 10 个（相当于重捕中被标记的个体数m=10）。根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。
（4）从现有 DNA 样品中，选择 Y 染色体上特有的微卫星 DNA 序列，设计特异性引物。 对所有 DNA 样品进行 PCR 扩增。 对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性；若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性。 统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。
10．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取① ，加入乙醇
② 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg 缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
【答案】(1) 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等
(2)互利共生
(3) 上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
(4) 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段
(5)ab
【难度】0.4
【知识点】群落中生物的种间关系、生态系统中信息的种类、作用及传递过程、生物多样性丧失原因及其保护措施、PCR扩增的原理与过程
【分析】生态系统中信息的种类(1)物理信息：生态系统中的光、声、温度、湿度、磁力等，通过物理过程传递的信息，如蜘蛛网的振动频率；(2)化学信息：生物在生命活动中，产生了一些可以传递信息的化学物质，如植物的生物碱、有机酸，动物的性外激素等；(3)行为信息：动物的特殊行为，对于同种或异种生物也能够传递某种信息，如孔雀开屏。
【详解】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。
（2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。
（3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg 缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。
（4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。
（5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确；
b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确；
c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误；
d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。
故选ab。
11．（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题：
(1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为 。
(2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a：
①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的 ；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的 （填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。
②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为 [书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是 。
③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明 。
【答案】(1)绿色
(2) 替换 Ⅱ (G+h)/(△G+H) 该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚 非编码序列G缺失不影响基因H表达
【难度】0.4
【知识点】基因分离定律的实质和应用、PCR扩增的原理与过程
【分析】判断性状显隐性通常有两种方法。一是具有相对性状的纯合亲本杂交，子一代所表现出来的性状就是显性性状，比如本题中纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，此表型对应的性状即为显性性状 。二是杂合子自交，后代出现性状分离，分离比中占比多的那个性状为显性性状，像本题F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为3:1 ，绿色植株数量多，所以绿色是显性性状。
【详解】（1）纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，说明F1表现的性状为显性性状。F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为297:105≈3:1，符合孟德尔分离定律中杂合子自交后代显性性状与隐性性状的分离比，所以显性性状为绿色。
（2）①若扩增产物电泳结果全为预测的 1125bp ，基因 H 可能未发生突变，若发生突变且产物长度不变，则可能是发生了碱基对的替换。 H 的扩增产物能被酶切为 699bp 和 426bp 的片段，h的酶切位点丧失。 Hh植株会产生两种类型的扩增产物，一种是H经酶切后的699bp 和426bp 片段，一种是h未被酶切的1125bp 片段，所以图 b 中的 Ⅱ 对应的是 Hh 植株。
② Hh 植株与黄色豆荚植株 (△G+H)/(△G+H) 杂交，若 F1 中绿色豆荚：黄色豆荚 =1:1 ，说明 Hh 植株产生了两种配子 G+H 和G+ h ，且黄色豆荚植株只能产生含 △G+H 的配子，所以 F1 中黄色豆荚植株的基因型为 (G+h)/(△G+H) 。中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是：该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚。
③ 若图a的F1中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，说明虽然黄色亲本中基因H上游缺失G ，但H基因仍能正常表达（或表达量足够）合成叶绿素，使豆荚表现为绿色，即非编码序列G缺失不影响基因H表达。
考点03 基因工程的基本操作程序及应用和蛋白质工程
一、单选题
12．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（ ）
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
【答案】C
【难度】0.65
【知识点】将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；
B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；
C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；
D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。
故选C。
二、解答题
13．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
【答案】(1) 4种脱氧核苷酸 延伸
(2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ
(3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化
【难度】0.4
【知识点】植物组织培养技术综合、基因工程的操作程序综合
【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。
【详解】（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。
（2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。
（3）T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
14．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。
【答案】(1)荧光
(2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解
(3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定
(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中
【难度】0.15
【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。
15．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。
回答下列问题：
(1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。
(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。
(3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。
【答案】(1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点
(2) 稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升
(3) 高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
【难度】0.65
【知识点】微生物的接种方法、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用
【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。
【详解】（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。
（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。
（3）从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，诱导细菌死亡，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
16．（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过 （方法）将该质粒转入植物细胞，并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
【答案】(1) 农杆菌转化法 Ti质粒上的T - DNA 潮霉素
(2) 外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素
(3) PCR - 测序 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）
(4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。
【难度】0.65
【知识点】将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、植物组织培养技术综合
【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定。植物组织培养技术是指在无菌和人工控制的环境条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实等）、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的技术。
【详解】（1）将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。
（2）在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。
（3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。
（4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。
17．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。

限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。

【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
【难度】0.65
【知识点】基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、蛋白质工程的应用及实例分析
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
18．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是 （答出两点即可）。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有 （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
【答案】(1) 终止子、复制原点 P1 和 P3 782 重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解
(2) 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测
【难度】0.4
【知识点】基因表达载体的构建、动物细胞融合与单克隆抗体的制备
【分析】1基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminator等，这是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。
【详解】（1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。
将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生沉淀，蛋白A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。
（2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。
②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
19．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。
(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号）
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。
(2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键
(3) 细胞表面发出黄色荧光 高
(4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用
(5) ① ③
【难度】0.4
【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。
（2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。
（3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。
（4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol L 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。
（5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。
20．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题：
(1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是 。
(2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内 （填细胞结构名称）的改变。
(3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 。
(4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入 序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。
(5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是： 。
(6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是： 。
【答案】(1)电子显微镜
(2)细胞骨架
(3)抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所
(4)大肠杆菌复制原点
(5)病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子
(6)蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内
【难度】0.65
【知识点】病毒结构、分类和增殖、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞
【分析】病毒的结构较为简单，无细胞结构，主要由核酸（DNA 或 RNA）和蛋白质外壳组成。有些病毒在核衣壳之外还有包膜结构。核酸是病毒的遗传物质，储存着病毒的遗传信息，控制着病毒的繁殖、变异等生命活动。蛋白质外壳则起到保护核酸的作用，同时还能介导病毒与宿主细胞的识别与结合。具有包膜的病毒，其包膜一般来源于宿主细胞膜或核膜，包膜上镶嵌着一些糖蛋白刺突，这些刺突有助于病毒吸附和侵入宿主细胞。
【详解】（1）病毒个体极其微小，普通光学显微镜无法清晰观察其形态结构，需要使用电子显微镜才能清楚观察病毒的形态结构。
（2）细胞骨架对于维持细胞的形态具有重要作用，体外培养的梭形昆虫细胞被病毒感染后转变为圆球形，很可能是病毒感染引起了昆虫细胞内细胞骨架的改变。
（3）病毒需要在宿主细胞内进行生存和繁殖，细胞凋亡会导致宿主细胞死亡，不利于病毒的生存和繁殖。病毒基因组中含有的抗细胞凋亡基因可以抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 。
（4）要使病毒 DNA 能在大肠杆菌中复制，需要在病毒 DNA 中插入大肠杆菌复制原点序列，这样才能利用大肠杆菌细胞内的复制系统进行复制。
（5）转录需要特定的酶等条件，该病毒 DNA 能进入哺乳动物细胞，但无对应的转录产物，可能是因为病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子。
（6）该病毒具有包膜结构，包膜的主要成分是脂质等，脂溶剂可以溶解病毒的包膜，蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内。
21．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【难度】0.4
【知识点】遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。
（3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。
（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
22．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。
【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制
(2) 2 验证重组质粒是否构建成功
(3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻
(4) 目的基因发生突变或变异 发酵条件优化
【难度】0.65
【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。
（2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。
（3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。
（4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。
23．（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题：
(1)基因内碱基的增添、缺失或 都可导致基因突变。
(2)以Aa植株为 （填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为 。
(3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生 种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为 。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为 。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为 。
(4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验：
①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为 的F1植株。
②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为 ；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为 。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因： 。
【答案】(1)替换
(2) 父本 1/2
(3) 3 1/3 2/3 a花粉不育，无法形成纯合aa植株
(4) AaEe E/e和A/a连锁且无交换，F 中无同时含A和E的配子 1/6 若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6
【难度】0.4
【知识点】基因自由组合定律的实质和应用、基因突变、PCR扩增的原理与过程、基因连锁与交换定律
【分析】自由组合定律的实质：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。
【详解】（1）基因突变是指DNA分子上碱基对增添、缺失或替换引起基因结构的改变。基因内碱基的增添、缺失或替换都可导致基因突变。
（2）据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失（a基因）会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0；若Aa植株作为母本，其卵细胞可育（含a基因），而野生型父本花粉（含A基因）可育，F1基因型为Aa（抗性）和AA（非抗性），比例为1：1，因此卡那霉素抗性植株占比为1/2。
（3）为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为Aa（2号染色体为Aa，3号染色体为A0）。该植株会产生4种基因型的花粉，即AA、A0、Aa、a0，其中a不育，即产生3种可育基因型的花粉，而具有a基因的花粉占比为1/3。该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0，均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型为AAAA：AAA0：AA00：AAAa：AAa0：AAaa：Aa00：Aa00=1∶2∶1∶2∶3∶1∶1∶1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR扩增出900bp（A）和600bp（a）条带。Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900bp条带。其中Ⅰ型植株占比为（2+3+1+1+1）/（1+2+1+2+3+1+1+1）=2/3。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株。
（4）①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出F1中AaEe植株（双杂合）。若E/e和A/a连锁且无交换，F2中无同时含A和E的配子（花粉或种子致死），正常植株占比为0。若两基因独立遗传（非同源染色体），F1植株（AaEe）产生雌配子为AE：Ae：aE：ae=1：1：1：1，均可育，而雄配子AE：Ae=1；1，aE和ae不可育，利用棋盘法可知，F2为AAEE：AAEe：AaEE：AaEe=1：2：1：2，其中只有AAEE的花粉和自交所结种子均发育正常，即正常植株（AAEE）占比为1/6。其他可能：若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6。
24．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp
(2) 4 环化 测序和序列比对
(3)不能
【难度】0.15
【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。
（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
25．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路 。
【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
(2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中
(3)
设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测。
【难度】0.4
【知识点】微生物的接种方法、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、验证性实验与探究性实验
【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
【详解】（1） 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。
（2）PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。
（3）设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上

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