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课时跟踪检测（五十七）基因工程的基本工具和操作程序
一、选择题
1.(2025·青岛模拟)下图为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断下列相关叙述错误的是 (　 )
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
2.RT PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是 (　 )
A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲液中一般要添加Mg2+
B.一般情况下，引物A和B的长度越长、C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越低
C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色
D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
3.(2025·桂林二模)基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是 (　 )
A.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA片段内
B.可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物
C.目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则
D.转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
4.干扰素是一种广谱抗病毒制剂，是具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，①~④表示相关操作过程。下列分析不正确的是 (　 )
A.图中过程①③中都需用到限制性内切核酸酶
B.过程②需用耐高温的DNA聚合酶，②操作的原理是DNA半保留复制
C.过程③操作要注意干扰素基因上有启动子、终止子及标记基因等
D.过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定
5.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是 (　 )
A.引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关
C.Taq DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到3'端
D.若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
二、非选择题
6.(8分)(2025·贵阳二模)某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图1所示，①~④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ的酶切位点唯一。其中BamHⅠ与EcoRⅠ之间的距离为20 kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25 kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切割位点如图2。请回答下列问题：
(1)常用的特异性扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→　　　　”三步。(1分)
(2)步骤①应选择限制酶　　　　　切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加　　　　　，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株，原因是__________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________。(4分)
(3)经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因存在正向与反向两种连接方式。用　　　　　酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产物大小，若出现　　　　　条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。(3分)
若只选一种酶切割基因表达载体，无论目的基因正向连接还是反向连接，均只得到长度为180+25+20=225(kb)的DNA，无法区分目的基因正向连接还是反向连接。若选用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切割，目的基因正向连接的重组质粒被切成180 kb、45 kb的两种DNA片段，目的基因反向连接的重组质粒被切成205 kb、20 kb两种DNA片段，所以电泳应出现四条条带。
Ti质粒的T DNA中含有潮霉素抗性基因　
(3)BamHⅠ和EcoRⅠ　四
7.(10分)为分别建立具有红色荧光与绿色荧光的转基因模型小鼠，科学家进行了如下操作将红色荧光基因R插入表达载体A，构建重组表达载体A'，如图所示。其中含R基因的DNA片段内部没有限制酶的酶切位点，R基因以α链为模板链。将绿色荧光基因G插入表达载体B，构建重组表达载体B'。
(1)表达载体上的启动子是　　　　 　酶的结合位点，能决定基因转录方向，并确定其中的一条链为模板，若图中表达载体A和R基因通过酶切和拼接后能使R基因成功表达，则其启动子是　　　(填“①”或“②”)。(2分)
(2)据图分析，　　　　 　(填“可以”或“不可以”)通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'，理由是__________
_____________________________________________________________________________________。(3分)
(3)在绿色荧光基因G内部插入了一个DNA片段P，会引起G基因产生　　　　 　，但获得的上述转基因模型鼠依然能表现出绿色荧光的原因有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(回答2点即可)。为确定导入的基因是否有片段P的插入，可通过　　　　 　或　　　　 　的方法进行分析。(5分)
5 / 5课时跟踪检测（五十七）基因工程的基本工具和操作程序
一、选择题
1.(2025·青岛模拟)下图为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断下列相关叙述错误的是 (　 )
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
解析：选D　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着它们识别序列的中心轴线切开，切割后形成平末端，A正确；由题图可知，Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部，B正确；由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端，C正确；HindⅡ能识别GTYRAC，Y为C或T，R为G或A，则一种限制酶不一定只能识别一种核苷酸序列，D错误。
2.RT PCR是将mRNA逆转录获得cDNA的方法和cDNA聚合酶链式反应相结合的技术。某兴趣小组为该过程设计了相关引物并进行实验。下列说法错误的是 (　 )
A.PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲液中一般要添加Mg2+
B.一般情况下，引物A和B的长度越长、C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越低
C.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色
D.实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效
解析：选B　PCR过程主要涉及的酶是耐高温的DNA聚合酶，反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活DNA聚合酶，A正确；一般情况下，引物A和B的长度越长、C和G比例越高，则PCR循环步骤中的复性温度设定就越高，B错误；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，其中的DNA分子可用核酸染料染色，然后可在紫外灯下检测出来，C正确；实验后发现几乎不能得到扩增产物，原因可能是引物B自身出现了局部碱基互补配对而失效，导致子链无法延伸，D正确。
3.(2025·桂林二模)基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是 (　 )
A.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA片段内
B.可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物
C.目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则
D.转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
解析：选C　农杆菌中Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA片段内，A正确；可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B正确；目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端的结合依赖碱基互补配对原则，C错误；转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D正确。
4.干扰素是一种广谱抗病毒制剂，是具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，①~④表示相关操作过程。下列分析不正确的是 (　 )
A.图中过程①③中都需用到限制性内切核酸酶
B.过程②需用耐高温的DNA聚合酶，②操作的原理是DNA半保留复制
C.过程③操作要注意干扰素基因上有启动子、终止子及标记基因等
D.过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定
解析：选C　图中①表示获取目的基因，②表示扩增目的基因，③表示构建基因表达载体，④表示导入目的基因，其中在获取目的基因、构建基因表达载体过程中均需用到限制酶，A正确；②表示通过PCR技术扩增目的基因，其原理是DNA半保留复制，该过程需用到耐高温的DNA聚合酶，B正确；过程③操作要注意最终构建的基因表达载体上有干扰素基因、启动子、终止子及标记基因等，C错误；过程④为目的基因的导入，最后必须对干扰素进行功能活性鉴定，D正确。
5.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是 (　 )
A.引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关
C.Taq DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到3'端
D.若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
解析：选B　引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；模板DNA含量越高，PCR扩增过程中形成的荧光分子越多，荧光强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B错误；Taq DNA 聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端向3'端延伸，C正确；cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的，故若以cDNA为模板，题述技术便可用于检测某基因的转录水平，D正确。
二、非选择题
6.(8分)(2025·贵阳二模)某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图1所示，①~④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ的酶切位点唯一。其中BamHⅠ与EcoRⅠ之间的距离为20 kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25 kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切割位点如图2。请回答下列问题：
(1)常用的特异性扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→　　　　”三步。(1分)
(2)步骤①应选择限制酶　　　　　切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加　　　　　，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株，原因是__________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________。(4分)
(3)经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因存在正向与反向两种连接方式。用　　　　　酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产物大小，若出现　　　　　条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。(3分)
解析：(1)利用PCR扩增目的基因，每次循环一般分为“变性→复性→延伸”三步。(2)由图1可知，目的基因用限制酶BamHⅠ、BglⅡ切割，由于BamHⅠ和BglⅡ的黏性末端相同，且质粒的T DNA 中有BamHⅠ的酶切位点(质粒只有1个BamHⅠ的酶切位点)，因此步骤①应选择限制酶BamHⅠ切割农杆菌质粒。Ti质粒的T DNA中含有潮霉素抗性基因，因此在步骤④的培养基中需要添加潮霉素，以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。(3)由图2可知，用BamHⅠ酶和BglⅡ酶切割得到的黏性末端相同，因此剪切后的目的基因能与质粒连接在一起。在构建的重组质粒中，不再有BglⅡ酶的识别位点，但含有BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，目的基因的正向和反向连接方式如图所示。
若只选一种酶切割基因表达载体，无论目的基因正向连接还是反向连接，均只得到长度为180+25+20=225(kb)的DNA，无法区分目的基因正向连接还是反向连接。若选用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切割，目的基因正向连接的重组质粒被切成180 kb、45 kb的两种DNA片段，目的基因反向连接的重组质粒被切成205 kb、20 kb两种DNA片段，所以电泳应出现四条条带。
答案：(1)复性→延伸　(2)BamHⅠ　潮霉素　
Ti质粒的T DNA中含有潮霉素抗性基因　
(3)BamHⅠ和EcoRⅠ　四
7.(10分)为分别建立具有红色荧光与绿色荧光的转基因模型小鼠，科学家进行了如下操作将红色荧光基因R插入表达载体A，构建重组表达载体A'，如图所示。其中含R基因的DNA片段内部没有限制酶的酶切位点，R基因以α链为模板链。将绿色荧光基因G插入表达载体B，构建重组表达载体B'。
(1)表达载体上的启动子是　　　　 　酶的结合位点，能决定基因转录方向，并确定其中的一条链为模板，若图中表达载体A和R基因通过酶切和拼接后能使R基因成功表达，则其启动子是　　　(填“①”或“②”)。(2分)
(2)据图分析，　　　　 　(填“可以”或“不可以”)通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'，理由是__________
_____________________________________________________________________________________。(3分)
(3)在绿色荧光基因G内部插入了一个DNA片段P，会引起G基因产生　　　　 　，但获得的上述转基因模型鼠依然能表现出绿色荧光的原因有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(回答2点即可)。为确定导入的基因是否有片段P的插入，可通过　　　　 　或　　　　 　的方法进行分析。(5分)
解析：(1)启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶的结合位点，控制着转录的开始；若图中表达载体A和R基因通过酶切和拼接后能使R基因成功表达，则其启动子是①。(2)据图分析可知，表达载体A、目的基因、重组表达载体A'的分子量不同，因此可以通过凝胶电泳分离出重组表达载体A'。(3)在绿色荧光基因G内部插入了一个DNA片段P，会引起G基因结构发生改变，产生基因突变；如果片段P插入G基因的内含子或非编码序列中就不会影响绿色荧光基因G的表达，或者插入片段P的G基因表达的蛋白质结构不同，但功能与原蛋白质相同，转基因模型鼠依然能表现出绿色荧光；为确定导入的基因是否有片段P的插入，可通过基因测序或核酸杂交技术或PCR结合电泳技术进行分析。
答案：(1)RNA聚合　①　(2)可以　重组表达载体A'与其他片段的分子量不同(或重组表达载体A'的分子量与表达载体A及目的基因的分子量不同)(合理即可)　(3)基因突变　片段P插入G基因的内含子或非编码序列中；基因突变后表达的蛋白质结构不同但功能相同　基因测序(或核酸杂交技术)　PCR结合电泳技术　
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