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(共25张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第2课时：步骤三、四
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
自主学习：阅读课本相关内容（P81），总结将目的基因导入受体细胞的方法
有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？
总体把握
将目的基因导入受体细胞的方法，因为受体细胞的不同而有所区别。
导入方法：
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
显微注射法
Ca2+ 处理法
花粉管通道法（我国科学家独创）
农杆菌转化法（常用）
三、将目的基因导入受体细胞
1.导入植物细胞——花粉管通道法（我国科学家独创的一种方法）
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
2.导入植物细胞——农杆菌转化法
（2）特点：
①农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
（1）转化的概念：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
②农杆菌细胞内含有的Ti质粒，能将Ti质粒上的T - DNA 转移至受体细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
表现出新性状的植株
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
Ti质粒
T—DNA
目的基因
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
（3）过程：
2.导入植物细胞——农杆菌转化法
方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
（4）农杆菌转化的具体方法：
体细胞
受精卵
受体细胞为？
受体细胞为？
2.导入植物细胞——农杆菌转化法
3.导入动物细胞——显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物生物的受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。
——受体细胞是受精卵
思考：
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
1.体积大，易操作。
2.受精卵容易表现出全能性
4.导入微生物细胞——Ca2+处理法
（1）常用方法：
Ca2+处理
目的：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（3）过程：
（2）受体细胞：
原核细胞（常选择大肠杆菌）
一般先用Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
再将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。
1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是( )
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
D
都需要构建
只适用于植物
体细胞
【现学现用】
四、目的基因的检测与鉴定
Bt 基因
mRNA
Bt 蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原-抗体杂交技术
分子水平的检测
抗虫接种实验
个体生物学水平的鉴定
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
以检测 Bt 基因是否导入棉花体内并表达为例：
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
提取
DNA
转基因棉花
PCR
是否扩增出目的基因
利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物
M： marker
1-6：转基因棉花
7： 非转基因棉花
8： 阴性对照
电泳
（1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——PCR扩增+电泳
通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
基因探针：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
15N
15N
变性
变性
杂交DNA分子
（可检测）
探针
受体细胞的DNA
DNA分子杂交技术：
碱基互补配对原则
原理？
（1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——DNA分子杂交技术
基本思路：
步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。
步骤二：提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液。
步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR扩增+电泳
提取棉花细胞 mRNA
逆转录
得到 cDNA
用以 Bt 基因序列设计的
引物进行 PCR 扩增
电泳
检测
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术
15N
15N
变性
探针
受体细胞的mRNA
杂交分子（可检测）
步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。
步骤二：提取受体细胞全部RNA，与基因探针置于同一培养液。
步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
基本思路：
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术
①原理：
抗原抗体的特异性结合
②过程：
苏云金杆菌
提取
Bt 毒蛋白
注射
抗体
标记抗体
转基因棉花
提取蛋白
电泳分离
抗原-抗体杂交
2. 个体生物学水平的鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
——基因工程产品与天然产品的功能活性比较
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
饲喂
棉铃虫
转Bt基因
非转基因
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
思路：
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
1.江西南昌进贤一中高三月考)我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
√
课堂练习
2.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是
A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞
B.②过程中需要进行胚胎移植操作
C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B
D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素
√
培育转基因动物时，受体细胞A一般是该种动物的受精卵，A错误。
课堂练习
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
√
3.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是
课堂练习
4.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
√
课堂练习
5.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是
A.过程①合成人生长激素基因的过程
需要用到逆转录酶
B.过程③是将重组质粒溶于缓冲液后
与经Ca2＋处理的细菌B混合
C.成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长
D.可采用抗原—抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达
√
课堂练习
6.甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题：
(1)为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入 酶切位点。
ScaⅠ、HamHⅠ
课堂练习

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