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(共28张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第1课时
Bt基因
Bt抗虫蛋白
表达
与表面受体结合
细胞膜穿孔
破坏细胞渗透平衡
最终导致昆虫停止取食而死亡
昆虫肠上皮细胞
传统的杂交育种方法可以培养出抗虫棉吗？
×
导入
棉花细胞
培育
抗虫棉
基因工程
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期
表达产物等的基因。
(2)实例：
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
1、目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
那么，如何筛选目的基因呢？
一、目的基因的筛选与获取
筛选方法
从相关的
已知结构
和功能清晰
的基因中进行筛选
已知结构
科学家掌握了Bt基因的序列信息
功能清晰
Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响
2、目的基因的筛选
一、目的基因的筛选与获取
2、目的基因的筛选
测序技术
测定核酸和蛋白质序列
序列数据库
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
序列比对工具
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能
利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
一、目的基因的筛选与获取
3、目的基因的获取
从基因文库中获取
基因组文库 含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体
cDNA文库 含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体
cDNA：先由mRNA在逆转录酶作用下获得单链DNA，再利用DNA聚合酶，将单链DNA复制，产生双链DNA，即为cDNA。
概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
一、目的基因的筛选与获取
3、目的基因的获取
人工合成法
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成
化学方法直接人工合成
一、目的基因的筛选与获取
3、目的基因的获取
90℃高温 DNA在体外90℃高温时变性会变成单链
50℃低温 引物与单链按碱基互补配对的原则结合
72℃适温 DNA聚合酶在最适反应温度，沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链
反应原理 DNA半保留复制
反应条件 缓冲液、DNA模板、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、与两条模板链结合的2种引物
利用PCR扩增目的基因
阅读P77，获取PCR的定义、条件、大致过程。
一、目的基因的筛选与获取
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
思考：1. PCR技术与DNA复制过程比较？
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
一、目的基因的筛选与获取
思考： 2.PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中
分离出目的基因？
3.需要引物的原因？
答：DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。
一、目的基因的筛选与获取
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
思考：4、如何对产物进行鉴定？
一、目的基因的筛选与获取
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
知识补充
基因的结构
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
转录
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
mRNA
蛋白质
翻译
思考：如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现什么样的结果？
如何避免该结果的发生呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
1、目的：
---基因工程的核心
思考：要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达 和发挥作用，载体还需要哪些结构？
2、基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
二、基因表达载体的构建
---基因工程的核心
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
位置：基因的下游
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
二、基因表达载体的构建
易错提醒
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 ______ _____ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
二、基因表达载体的构建
小组活动：请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程？
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
问题：该过程需要用到哪些工具酶？
3、基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？
请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。
探究 活动
载体与目的基因
反向连接
载体与目的基因
正向连接
目的基因与目的基因之间的连接
目的基因自身环化
载体自身环化
载体与载体之间的连接
二、基因表达载体的构建
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
二、基因表达载体的构建
问题探讨
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
-G
-CTTAA
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
二、基因表达载体的构建
1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核
苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因
等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因
的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
√
课堂练习
2.用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（ ）
C
解析　利用PCR技术将DNA分子中的A1片段扩增时，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸总是从5′端到3′端。据此依题意和图示分析可知，扩增后得到的绝大部分DNA片段如图D所示。
√
课堂练习
3.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反
向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
课堂练习
小结
1、目的基因的筛选：
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
2、目的基因的获取：
人工合成、基因文库、利用PCR获取和扩增目的基因等
DNA半保留复制
原理:
PCR反应体系（条件）
过程:
3、利用PCR获取和扩增目的基因
DNA模板（目的基因）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物：一小段DNA单链，与DNA母链的一段碱基序列互补配对
酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
缓冲液、温控条件等
变性（ 90℃以上，双链DNA解聚为单链）
复性（ 50℃左右，引物与两条单链DNA结合）
延伸（ 72℃左右，Taq酶合成新的DNA链。 ）
5.6课前背记
1、基因工程的原理？操作水平？
2、限制酶的来源 作用部位 限制酶切割的结果 切割一次产生几个磷酸基团
3、限制酶切割一次产生几个黏性末端 断几个磷酸二酯键？
4、DNA 连接酶作用部位 种类
5、E.coli DNA 连接酶和T4连接酶连接平末端的效率更高
6、载体的种类 作为载体应该具备的条件 质粒的概念 质粒都是天然存在的么
7、基因工程的基本操作的四个步骤
8、获取目的基因的方法 PCR的原理和操作环境 PCR的条件 PCR的过程？
9、引物结合在模板链的那端 引物的作用 子链延伸方向
10、通过PCR 扩增n次后 DNA分子有多少个 子代等长链DNA分子(目的基因)数目多少个 含引物A(或B)的DNA分手数为多少个 同时含两种引物的DNA分子数多少个 复制过程中共需引物多少个 复制过程中其需引物多少对

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