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必考大题(五)　生物技术与工程
(时间:30分钟　分值:50分)
1.(8分)(2024·四川成都一模)非洲猪瘟是由ASFV(一种双链DNA病毒)感染猪引起的烈性传染病。某研究小组将ASFV外壳蛋白基因导入猪体细胞中,利用核移植技术培育转基因克隆猪,从而得到自动产生ASFV抗体的个体,其过程如图所示。回答下列问题:
(1)(3分)获得D猪的基础技术是　　　　　　　　,取B猪体细胞进行①过程相对于胚胎细胞难度大,原因在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,步骤③采用的技术手段是　　　　　　　　。
(2)(1分)B猪体细胞在培养瓶中培养时,除必须保证环境是无菌、无毒外,还必须定期更换培养液以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成的伤害。培养到一定程度后,需要分瓶再继续培养,分瓶后的培养过程称为　　　　　　　　。
(3)(2分)在导入目的基因之前,需要用双酶切法处理含目的基因的DNA片段和质粒,其优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (答出一点即可)。
(4)(2分)利用抗原—抗体杂交技术判断D猪是否产生ASFV抗体,使用的抗原物质最好是　　　　　　　　。该抗体也可以使用杂交瘤技术来制备,通常情况下,杂交瘤细胞是由骨髓瘤细胞和　　　　　　　　　　　　　　　　细胞融合获得的。
2.(12分)(2024·河南濮阳模拟预测)从红豆杉细胞中提取的紫杉醇是目前最好的抗肿瘤药物之一。为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量,研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因Bapt的超表达载体,并将其导入红豆杉细胞,具体流程如图。回答下列问题:
(1)(2分)紫杉醇是植物的一种次生代谢产物,该物质是植物生命活动所　　　　(填“必需”或“非必需”)的。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取,这种方法的弊端是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1种)。
(2)(4分)通过①过程获得的cDNA中的碱基序列与细胞中该基因的碱基序列是否完全相同 　　　　(填“是”或“否”)。除了图中获得Bapt基因的方法外,获取目的基因的方法还有　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1种)。过程③需要的酶是　　　　　　　　。
(3)(3分)图中将目的基因导入红豆杉细胞采取的方法是　　　　　　　　,据此可知p1301载体上有一段特殊的DNA,该DNA可　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)(3分)用含有潮霉素的培养基进行筛选,说明p1301载体上含有　　　　基因。最终为确定超表达Bapt基因的红豆杉细胞是否提高了紫杉醇的含量,需设计实验探究,请写出简要过程　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
3.(8分)(2024·河南安阳一模)基因工程中,可利用报告基因(如增强绿色荧光蛋白基因,EGFP基因)与目的基因相连形成融合基因,用于鉴定目的基因是否在受体细胞中表达。为培育抗冻的转基因番茄品种,研究人员设计了四种引物将多毛番茄的CBF1基因与EGFP基因通过融合PCR技术进行融合,如下图所示。回答下列问题:
(1)(2分)PCR反应中引物的作用是使　　　　从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。为使CBF1基因与EGFP基因成功连接,应使引物R1和F2　　　　　　　　。
(2)(4分)利用重叠PCR构建融合基因时,第一轮PCR产生的DNA链①~⑧中,　　　　(填“能”或“不能”)选取①和⑧进行组合。继续进行PCR扩增后,产生的子链⑨~12中,子链相互连接后不利用引物即可进行扩增的组合是　　　　　　　　,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)(2分)引物F1和R2含有限制酶NcoI、BstEⅡ识别的序列,在引物中添加这两种限制酶识别序列的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
4.(11分)(2024·福建福州一模)虾青素具有抗氧化和提高免疫力等特点,在医药和食品添加剂等领域都有广泛应用。可通过基因工程改造酵母,进行虾青素生物合成。
(1)(2分)天然虾青素的来源之一是雨生红球藻,但并非其基本生命活动必需的产物,在雨生红球藻体内属于　　　　　　　　(填“初生代谢物”或“次生代谢物”)。
(2)(2分)科学家欲将雨生红球藻合成虾青素过程中关键酶的基因crtZ通过质粒导入酿酒酵母中表达。为使基因crtZ片段能连接到图中质粒中,应选用限制酶　　　　和　　　　来处理质粒。
(3)(2分)酵母的质粒载体也可以在大肠杆菌中扩增,被称为穿梭载体。一般扩增质粒时,将目的基因片段和质粒的连接产物转化到大肠杆菌DH5α(缺失限制酶)中,与其他大肠杆菌相比,选用该菌的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
转化之前,使用CaCl2等处理大肠杆菌细胞,其目的是使细胞处于　　　　　　　　的生理状态。
(4)(5分)从大肠杆菌中提取质粒导入酵母,若要筛选含有该质粒的酵母细胞,首先需要使用　　　　　　　　(单项选择)培养尿嘧啶合成酶基因缺失型酵母;然后向缺失型酵母转入带有crtZ基因的质粒,涂布在　　　　(单项选择),上述筛选的机理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。A.含有氨苄青霉素的培养基
B.含有尿嘧啶的培养基
C.不含尿嘧啶的培养基
5.(11分)(2024·九省联考广西卷,21)PCR可用于扩增并检测DNA,但存在交叉污染或偏差等问题,而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法,可在低浓度样本中更灵敏,快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光,通过检测荧光强度确定靶标DNA含量,利用Cas12a检测靶标DNA的过程如下图所示。回答:
(1)(3分)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时,具有类似　　　　酶和　　　　酶的功能;gRNA识别靶标DNA,遵循的是　　　　原则。
(2)(2分)在构建表达Cas12a蛋白的载体时,通常是将Cas12a基因插入到lacZ基因内,使lacZ基因失活,从而失去催化无色底物显色的能力,Ampr为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养,不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌,判断的依据是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)(2分)荧光检测时,60分钟后三组荧光信号强度达到一致,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)(4分)实验研究时,增加NTC组作对照的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　;
g-3+g-7组可更快检测出靶标DNA,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
必考大题(五)　生物技术与工程
1.(1)细胞核移植技术　动物体细胞分化程度高,表现全能性十分困难　胚胎移植　(2)传代培养　(3)保证目的基因和载体定向连接　(4)ASFV外壳蛋白　经ASFV外壳蛋白免疫后的B淋巴细胞
解析　(1)分析题可知,获得D猪设计去核卵母细胞与含有目的基因的细胞的融合基础技术是细胞核移植技术;取B猪体细胞进行①过程相对于胚胎细胞难度大,原因在于动物胚胎细胞分化程度低,表现全能性相对容易,而动物体细胞分化程度高,表现全能性十分困难,因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植;步骤③表示将早期胚胎移植给C猪,其技术手段为胚胎移植。(2)人们通常将分瓶之前的细胞培养,即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养,将分瓶后的细胞培养称为传代培养,所以培养到一定程度后,需要分瓶再继续培养,分瓶后的培养过程称为传代培养。(3)使用双酶切法可以避免目的基因自身环化、避免载体自身环化、避免目的基因反向连接到载体上,保证目的基因和载体定向连接。(4)利用抗原—抗体杂交技术判断D猪是否产生ASFV抗体,该技术的原理是抗体与抗原的特异性结合,因此,使用的抗原物质最好是ASFV外壳蛋白;该抗体若使用杂交瘤技术来制备,杂交瘤细胞应该由骨髓瘤细胞和经ASFV外壳蛋白免疫后的B淋巴细胞融合获得的。
2.(1)非必需　不利于对红豆杉的保护、紫杉醇产量低等
(2)否　人工合成(从基因文库中获取)　限制酶和DNA连接酶　(3)农杆菌转化法　可转移到受体细胞,并且整合到受体细胞的染色体DNA上　(4)潮霉素抗性　培养超表达Bapt基因的红豆杉细胞,从中获得紫杉醇后与等量普通红豆杉细胞中的紫杉醇对比,观察其紫杉醇含量是否远高于普通红豆杉
解析　(1)紫杉醇是红豆杉的次生代谢产物,次生代谢产物不是植物生命活动所必需的物质。植物细胞中的次生代谢物含量很低,用传统的方法提取紫杉醇,会破坏红豆杉植物资源,不利于对红豆杉的保护。(2)从细胞中获取的mRNA是加工过的,所以通过逆转录形成的cDNA中的碱基序列和细胞中相关基因中的碱基序列不完全相同。获取目的基因的方法有从基因文库中获得、PCR和人工合成,图中②过程为PCR。过程③是构建目的基因的表达载体,该过程需要的酶是限制酶和DNA连接酶。(3)从图中可以看出,目的基因的表达载体先导入了农杆菌,所以可判断将目的基因导入红豆杉细胞的方法是农杆菌转化法。农杆菌转化法中采用的p1301载体上应含有一段DNA序列,该DNA序列可转移到受体细胞,并且整合到受体细胞的染色体DNA。(4)从图中可以看出,用含有潮霉素的培养基筛选红豆杉细胞,说明在p1301载体上含有潮霉素抗性基因。确定超表达了Bapt基因的红豆杉细胞是否提高了紫杉醇的含量,应分别培养等量的超表达了Bapt基因的红豆杉细胞和普通红豆杉细胞,从中获得紫杉醇后进行对比,观察超表达Bapt基因的红豆杉细胞的紫杉醇含量是否远高于普通红豆杉细胞。
3.(1)DNA聚合酶　末端的部分序列互补配对　(2)不能　⑩11　DNA子链的延伸方向是从5'端至3'端,⑩与11组合后互补配对片段的游离末端均为3'端,可以起到引物的作用　(3)使融合基因两端带有这两种限制酶的识别序列,在构建基因表达载体时,使用这两种限制酶处理融合基因,可产生不同的黏性末端,防止融合基因自身环化
解析　(1)DNA聚合酶不能从头合成DNA,只能从引物的3'端开始延伸DNA链;根据题图可知,R1末端序列对应DNA片段和F2末端序列对应DNA片段互补,则二者能连接形成局部双链,再以两条链互为模板便可继续扩增出融合基因,能使CBF1基因与EGFP基因成功连接,因此引物R1和F2末端序列应互补。(2)根据题图信息可知,需要通过PCR过程使图中CBF1基因左端添加NcoⅠ酶识别序列,EGFP基因右端添加BstE Ⅱ酶的识别序列,图中①和⑧进行组合,融合基因左端和右端没有成功添加相关限制酶的识别序列,因此不能选择;图中⑨链式引物R1序列所在单链,从右至左为5'→3',则⑩链从左至右方向为5'→3',同理,11链从右至左方向为5'→3',12链从左至右方向为5'→3'端,因此子链延伸方向是5'端到3'端,⑩和11链相互连接后,可以以这两条长链互为模板,沿着⑩链的3'端从左至右延伸,同时沿着11的3'端从右至左延伸,两条链即可起到引物的作用,也可作为子链延伸的模板。(3)在引物F1中添加NcoⅠ的识别序列可使CBF1基因左端添加NcoⅠ识别序列,引物R2添加BstE Ⅱ识别序列,可使EGFP基因右端添加BstE Ⅱ识别序列,进而扩增形成的融合基因两端有不同的限制酶识别序列,在以融合基因为目的基因构建基因表达载体时,使用这两种限制酶处理融合基因,可产生不同的黏性末端,防止融合基因自身环化。
4.(1)次生代谢物　(2)EcoRⅠ　BamHⅠ　(3)外源DNA不会被切除,能够提高质粒DNA的产量和质量　一种能吸收周围环境中DNA分子　(4)B　C　缺失型酵母在无尿嘧啶的培养基上无法生长,导入重组质粒的酵母菌(含有尿嘧啶基因)可以长成菌落
解析　(1)次生代谢物质是生物体产生的一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物,天然虾青素的来源之一是雨生红球藻,但并非其基本生命活动必需的产物,在雨生红球藻体内属于次生代谢物。(2)据图可知,目的基因的两端只有EcoRⅠ和BglⅡ识别序列,目的基因应该用这两种酶切割,为使基因crtZ片段能在受体细胞中表达,应将基因crtZ片段连在启动子和终止子之间,它们之间有Bgl Ⅱ、EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ识别序列,但BglⅡ有一个识别位点在启动子左边,如果使用此酶,有可能会将启动子切除,不能使用此酶,BglⅡ和BamHⅠ切割后产生的黏性末端相同,为保证目的基因和质粒能连接在一起,应该用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒。(3)大肠杆菌DH5α缺失限制酶,不会降解外源DNA,与其他大肠杆菌相比,选用该菌的优点是外源DNA不会被切除,能够提高质粒DNA的产量和质量。使用CaCl2等处理大肠杆菌细胞,其目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(4)据图可知,质粒上含有URA3,缺失该基因酵母菌无法合成尿嘧啶,缺失型酵母在无尿嘧啶的培养基上无法生长,导入重组质粒的酵母菌(含有尿嘧啶基因)可以长成菌落,因此要想筛选含有该质粒的酵母细胞,首先需要使用含有尿嘧啶的培养基培养尿嘧啶合成酶基因缺失型酵母;然后向缺失型酵母转入带有crtZ基因的质粒,涂布在不含尿嘧啶的培养基上,能在此培养基上生存的酵母菌说明导入了质粒。
5.(1)限制　解旋　碱基互补配对　(2)使用的培养基中不含无色底物,所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养上长出的菌落,无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应　(3)Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同　(4)排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光　g-3+g-7组在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用
解析　(1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时,可以切割靶标DNA,并能解开靶标DNA,使其与g-3和g-7结合,所以Cas12a具有类似限制酶和解旋酶的功能;gRNA识别靶标DNA,遵循的是碱基互补配对原则。(2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时,通常是将Cas12a基因插入到lacZ基因内,使lacZ基因失活,从而失去催化无色底物显色的能力,而使用的培养基中不含无色底物,所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落,无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应。(3)荧光检测时,60分钟后三组荧光信号强度达到一致,原因是Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同。(4)实验研究时,增加NTC组作对照的作用是排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光;g-3+g-7组可更快检测出靶标DNA,原因是g-3+g-7组在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用。

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