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(共80张PPT)
第1课时 目的基因的筛选与获取
任务一 利用获取和扩增目的基因
任务二 探究·实践片段的扩增
及电泳鉴定
1.目的基因
(1)概念：用于改变______________或获得预期表达产物等的基因。
(2)类型：主要是指编码________的基因。
(3)举例： 基因通过产生____________，破坏鳞翅目昆虫的消化系
统杀死棉铃虫。
受体细胞性状
蛋白质
抗虫蛋白
2.筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的__________________________中进行
筛选是较为有效的方法之一。
(2)认识基因结构和功能的技术方法：__________技术、___________
__、__________工具。
已知结构和功能清晰的基因
测序
序列数据库
序列比对
3.利用 获取和扩增目的基因
(1) 全称：________________。
聚合酶链式反应
(2)作用：特异性地快速扩增目的基因。
(3) 的概念：
在______提供参与 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的
核苷酸序列进行大量复制的技术。
体外
(4) 的原理：________________。
半保留复制
(5)扩增的过程：
重复循环多次，每次循环一般可以分为__________________三步。
变性、复性、延伸
(6) 产物的鉴定方法：常采用________________。
琼脂糖凝胶电泳
4.其他获取目的基因的方法:________________________等。
人工合成、构建基因文库
任务一 利用 获取和扩增目的基因
【情境】 阅读教材P78 PCR反应过程示意图，分析下面内容。
(1)请完善图中信息。
变性
复性
两种引物
延伸
聚合酶
(2) 的条件是一定的缓冲液、__________、2种______、4种_____
_______和__________________酶等。
模板
引物
脱氧核苷酸
耐高温的聚合
(3) 所需引物是依据__________的一段已知序列设计而成的，图
中引物A与引物B______(填“相同”或“不同”)，其在 过程中______
(填“能”或“不能”)重复利用。
目的基因
不同
不能
(4)复性过程中引物与 模板结合，延伸过程中,4种脱氧核苷酸加
到引物的___端，新的 链的合成都遵循______________原则。
碱基互补配对
(5) 反应中，下一次循环的模板是__________________。
上一次循环的产物
(6)结果： 反应需要重复循环多次，每一次循环后目的基因的量
可以增加______，即呈______形式扩增，至少经____轮循环才可得
到所需目的基因。
一倍
指数
三
(7)用______(填“能”或“不能”)扩增 ，原因是_____________
_______________________。
不能
需要逆转录成再进行扩增
1.技术与生物体内 复制的比较
不同 点 解旋方 式 解旋酶催化
场所 生物体外 主要在细胞核内
引物
不同 点 酶
温度条 件 需控制温度，在较高温度下进 行 细胞内温和的温度条
件
结果
（续表）
相同 点 原理 原料 四种脱氧核苷酸 条件 都需要模板、酶、引物等 （续表）
［注意］
(1)真核细胞和细菌的聚合酶都需要用激活，因此 反应
缓冲液中一般要添加 。
(2)在反应中实际用到的原料是 (脱氧核糖核苷三磷酸)，包
括，，， 。其作用是提供能量和原料，不需要
单独加 。
2.由逆转录形成 的过程
例1 利用将某小段含目的基因的分子扩增循环 次，则
( )
A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需个引物参与子代 分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、 聚合酶、缓冲液等
D.耐高温的聚合酶可将脱氧核苷酸与引物 端相连
√
[解析] 只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；
扩增循环次共需两种引物的数量为 ，B错误；
不需向的反应体系中加入解旋酶，在体外通过高温使双链 解
聚为单链，C错误；耐高温的 聚合酶可将游离的脱氧核苷酸连接
到引物的 端，D正确。
例2 [2024·山东青岛模拟] 作为一个体外酶促反应，其效率和特
异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异性结合，二是多聚酶
对引物的延伸。引物设计的总原则是提高扩增的效率和特异性。下
列有关叙述错误的是( )
A.引物长度过短，特异性降低
B.两种引物之间不能发生碱基互补配对
C.引物的含量越高，越利于目标 的扩增
D.可在引物的 端添加特定限制酶的识别序列
√
[解析] 引物与模板结合依赖于碱基的互补配对，引物长度过短，特
异性降低，A正确；两种引物之间不能发生碱基互补配对，以防止引
物之间结合形成双链而影响引物与 模板链的结合，B正确；引物
的含量越高，结合特异性越强，但 含量过高，不利于复性，
从而阻碍目标的扩增，C错误；聚合酶从引物 端开始延伸
链，即的合成方向是从子链的端向 端延伸的，根据需要
可在引物的 端添加限制酶识别序列，以便更加准确地获得目的基
因，D正确。
［题后归纳］引物的选取原则
①引物自身不能环化；②两种引物之间不应存在互补序列，否则会
相互结合成引物二聚体；③引物长度不宜过短，防止引物随机结合，
使得不能特异性扩增目的基因。
任务二 探究·实践 片段的扩增及电泳鉴定
1.原理
(1) 片段的扩增
利用了______________原理，通过__________来控制 双链的
解聚与结合。
的热变性
调节温度
(2)电泳鉴定
①分子具有________的基团，在一定的 下，这些基团可以带
上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所
带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。
② 的产物一般通过________________来鉴定。
③凝胶中的分子通过染色，可以在波长为 的紫外灯下被
检测出来。
可解离
相反
琼脂糖凝胶电泳
2.操作过程
配制反应体系：用微量移液器在微量离心管内加入 反应体系
的各组分，并离心。
进行设置好相关参数，将装有反应液的微量离心管放入 仪
中进行反应。
配制琼脂糖溶液：依据待分离的 片段的大小配制，加入适量核
酸染料。
制备凝胶
加样，进行电泳(注：留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照
物。)
分析结果
［分析］ (1)配制 反应体系时，应加入的物质有：____________
______________________________________扩增缓冲液等，其中扩
增缓冲液能_________________________________________________
__________________________________。
模板、2种引物、聚合酶、4种脱氧核苷酸
维持合适的，其含有的能激活聚合酶，给反应提供一个最适合酶催化的条件
(2)通过是否成功扩增出 片段，判断依据是什么？
____________________________
电泳结果中条带的分布。
例3 下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响
分子在凝胶中的迁移速率
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D. 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
√
[解析] 分子具有可解离的基团，在一定的 下，这些基团可以
带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它
所带电荷相反的电极移动，这个过程是电泳，A正确，C错误；待测
样品中分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响 分子在
凝胶中的迁移速率，B正确； 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来
鉴定，D正确。
例4 [2024·山东枣庄期末] 某环状 分别用限制酶1和限制酶2完全
切割后进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，结果如下图所示
(注：表示千碱基对数， 代表标准对照)。下列叙述不正确的是
( )
A.该总长度不可能为
B.该 上至少有2个酶1的切割位点
C.该 上至少有1个酶2的切割位点
D.同时用酶1和酶2切割该 ，电泳结
果至少呈现2个条带
√
[解析] 限制酶2切割后有 这一种条带，若限制
酶2切割后有两条，则总长度可能为 ，
A错误；限制酶1切割后产生了两个条带，说明至
少有两个酶1的切割位点，B正确；若环状 总
长度最短为，限制酶2切割后有这一种条带，则该 上至少有
1个酶2的切割位点，C正确；若两个酶1的切割位点与酶2的切割位点距
离相同或酶2切割位点与其中一个酶1切割位点距离为 ，则同时用酶
1和酶2切割，产生和或和 两种长度的片段，电泳结果
呈现两个条带，若不是，则会呈现多个条带，D正确。
1.正误辨析
(1)利用技术扩增目的基因所需的酶与体内 复制所需的酶相
同。( )
×
[解析] 利用 技术扩增目的基因不需要解旋酶催化，且所用的
聚合酶需要耐高温，而体内 复制需要解旋酶催化。
(2)在恒温条件下进行 扩增避免温度变化导致酶失活。( )
×
[解析] 扩增过程经历了高温变性、低温复性和中温延伸的过程，
而不是在恒温条件下进行的。
(3)技术中，模板链上碱基和C的比例越高， 变性解链
所需的温度就越高。( )
√
[解析] C和之间连有三个氢键，模板中 碱基对多,氢键相
对较多,结构稳定,不容易解旋， 变性解链需要的温度相对更高。
(4) 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，电泳时电泳缓冲液
不能没过凝胶。( )
×
[解析] 通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 的产物时，电泳缓冲液没过
凝胶 为宜。
(5)凝胶中的 分子可以通过电子显微镜被检测出来。( )
×
[解析] 凝胶中的分子通过染色，可以在波长为 的紫外灯
下被检测出来。
2.[湖北卷]某实验利用 技术获取目的基因，实验结果显示除目的
基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板
不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效
的是( )
A.增加模板 的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
[解析] 出现非特异扩增条带可能的原因：模板 出现污染；复性
温度过低； 循环次数过多等，D正确。
√
3.[2024·福建南平期中] 引物的
端为结合模板 的关键碱基；
A.在 的循环过程中，图示过程需要的温度最低
B.四种脱氧核苷酸作为原料将会连接到引物的 端
C. 聚合酶催化相邻的脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
D.用图示引物扩增至少四个循环后才能获得目的产物
端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关分析错误的
是( )
√
[解析] 变性过程温度超过 ，
复性过程温度在 左右，延伸
过程温度在左右，图示为复性阶段,其在 循环过程中需要的温度
最低，A正确；扩增过程中，脱氧核苷酸只能连接在引物 端，B正
确；延伸时，在聚合酶催化下，脱氧核苷酸会连接到引物的
端，相邻的脱氧核苷酸间形成磷酸二酯键，C正确；由于两个引物均不
结合在该片段的末端，第一轮循环后，得到的两个 片段中两条脱氧
核苷酸链不等长，通过题图可推知，第二轮循环后也不会出现两条链等
长的产物，在第三轮循环后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的目的产物，
所以扩增三个循环后可获得目的产物，D错误。
4.[2024·河南漯河月考]某女孩患有一种单基因遗传病，该遗传病由
等位基因 控制，其父母及哥哥的表型均正常。现将其家庭成员的
相关基因用限制酶Ⅱ切割后进行电泳，结果如图所示。已知B、
基因中仅有一种基因上含有一个限制酶 Ⅱ的酶切位点。下列相关
叙述正确的是( )
A.该遗传病属于常染色体隐性遗传病，
患病女孩的哥哥不含致病基因
B.该致病基因出现是基因突变的结果，
突变过程中发生了碱基对的增添
C.限制酶 Ⅱ能识别特定的核糖核苷
酸序列，并在特定部位断开氢键
D.电泳过程中， 分子的迁移速率
只与 分子的大小有关
√
[解析] 该女孩患病，其父母表型正常，
可判断该病为常染色体隐性遗传病，
该女孩的基因型为 ，其父母的基因
型均为 ；根据图示分析可知，的条带对应的基因为 ，B基
因被限制酶 Ⅱ切割可产生大小为和 的两个片段，
，即B、 基因的长度相等，在基因突变产
生等位基因的过程中发生了碱基对的替换，根据电泳结果可知，患病女
孩的哥哥的基因型为 ，不含致病基因，A正确，B错误；限制酶能识
别双链 中特定的脱氧核苷酸序列，并在特定部位断开磷酸二酯键，
C错误；
电泳过程中， 分子的迁移速率与
凝胶的浓度、 分子的大小和构象
等有关，D错误。
1.PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种
分子生物技术。下列叙述正确的是( )
A.双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链
B.温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同
C.以2条DNA单链为模板，以4种核糖核苷酸为原料，经耐高温酶在高
温下合成2个新的DNA
D.设置PCR仪的温度进行反应可重复循环多次， DNA呈指数式扩增
√
[解析] 双链DNA在高温下解旋即使得DNA双链打开，破坏的是碱基对
之间的氢键，磷酸二酯键没有断裂，A错误；当温度降低时，单链DNA
和引物结合的部分碱基序列互补，B错误；以2条DNA单链为模板，以
4种脱氧核苷酸为原料， C错误；PCR的反应步骤为目的基因DNA受热
变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在热稳定DNA
聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，因而每一次循环后目的基因
的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增，约为2n，其中n为扩增循环的
次数，D正确
2.我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的
“引子”，成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种
生物的DNA中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法
正确的是( )
A.“引子”的彻底水解产物有两种
B.设计“引子”的DNA序列信息只能来自核DNA
C.设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列
D.土壤沉积物中的古人类双链DNA可直接与“引子”结合从而被识别
√
[解析] 根据分析“引子”是一段DNA序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧
核糖和四种含氮碱基，共6种产物，A错误；由于线粒体中也含有DNA，
因此设计“引子”的DNA序列信息还可以来自线粒体DNA，B错误；根
据题干信息“利用现代人的DNA序列设计并合成了引子”，说明设计“引
子”前不需要知道古人类的DNA列，C正确；土壤沉积物中的古人类双
链DNA需要经过提取，且在体外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，
而不能直接与引子结合，D错误。
3.引物在极大程度上决定了 PCR 的成败，下列关于引物的说法不正确
的有( )
A.PCR 和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR 引物一般是单链DNA
B.若引物的C-G碱基对含量相对较高，PCR 复性步骤的温度需要适当
升高
C.在 PCR 的复性步骤中，两种引物分别结合在模板链的3 端和5 端
D.若初始有 10个胰岛素基因，PCR 中进行10轮循环，至少需要20 460
个引物分子
√
[解析] PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物
通常是RNA，PCR引物一般是单链DNA，A正确；G与C之间有3个氢键，
稳定性高，若引物的C-G碱基对含量相对较高，PCR复性步骤的温度需
要适当升高，B正确；在PCR的复性步骤中，两种引物都结合在模板链
的3 端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，得
到10×210个=10240个DNA分子，共1024×2=20480条链，由于初始的20
条链不需要引物，故至少需要20480-20=20460个引物分子，D正确。
[解析] PCR是在体外大量合成DNA的技术，是聚合酶链式反应的简称。
4.回答下列与PCR相关的问题。
(1)PCR是　 的缩写，是在体外大量合成DNA的技术。
(2)PCR过程中，用　 代替了解旋酶的作用，使DNA
的双链解开。目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆
菌DNA聚合酶的主要原因是
。
聚合酶链式反应　
90 ℃以上高温　
　 Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆
菌DNA聚合酶在高温下会失活　
[解析] PCR过程中，用90 ℃以上高温代替了解旋酶的作用，使氢键断
裂，导致DNA的双链解开，作为DNA复制的模板。目前在PCR反应中
使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是
Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活，
无法在温控调节下起作用。
[解析] PCR每次循环一般可以分为变性(高温条件下氢键断裂形成单
链)、复性(引物与模板链之间形成氢键)和延伸(子链合成)三步。这里
复性的过程是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(3)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和 三步。复性的结
果是　 。
　延伸　
使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合　
(4)在PCR扩增目的基因的过程中，加入诱变剂可提高目的基因的突变
率。与用诱变剂直接处理细胞相比，上述育种技术获得突变目的基因
的效率更高，原因是在PCR过程中 (多选)。
A.仅针对目的基因进行诱变
B.目的基因产生了定向突变
C.目的基因可快速累积突变
D.目的基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变
　　AC　　
[解析] PCR过程中仅针对目的基因进行诱变，因此该方法获得突变目
的基因的效率更高，A正确；基因突变具有随机性、不定向性等特点，
B错误；利用PCR技术能大量获得目的基因的突变基因，进而可快速
累积突变，C正确；目的基因突变可能会导致氨基酸的数目发生改变，
D错误。
5.研究人员从某病人的支气管肺泡灌洗液诊断标本中提取出DNA，其
扩增产物a、b的琼脂糖凝胶电泳结果如下图，Maker为指示分子大小
的标准参照物。下列叙述错误的是 ( )
A.在一定的pH下，带负电的DNA会通过琼脂糖
凝胶孔隙向带电性质相反的一端迁移
B.图中样品a、b的迁移速率与DNA分子的大小
等有关，a样品中DNA的迁移速率快
C.待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时应停止电
泳，以防止样品流失到缓冲液中
D.若电泳鉴定结果不止一条条带，可能是因复
性温度过高导致出现了非特异扩增条带
√
[解析] DNA分子的琼脂糖凝胶电泳鉴定过程中，一定
pH下DNA分子可带上正电荷或负电荷，在电场作用下，
向着与所带电荷相反的电极移动，A正确；DNA分子
在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小有关，DNA分子
越小，移动得越快，因此a样品中DNA的迁移速率快，
B正确；电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移
至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，C正确；扩增时
复性温度过低，可能会导致引物与非互补配对的序列发生部分结合，
从而产生不同长度的DNA分子，出现多条条带，D错误。
练习册
知识点一 利用 获取和扩增目的基因
1.下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的 基因可作为培育转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的
机会
[解析] 目的基因是在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性
状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因，A错误。
√
2.下列有关 技术的说法,不正确的是( )
A. 的循环过程分为变性、复性和延伸三步
B.技术的原理是 半保留复制
C.利用 技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷
酸序列
D.扩增中解旋酶的作用是解开双链
√
[解析] 全称为聚合酶链式反应，循环过程分为变性、复性和延
伸三步,A正确；技术以解开的双链为模板合成 ,利用的
原理是半保留复制,B正确；利用 技术获取目的基因的前提是
要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,
C正确；双链模板在高温作用下,氢键断裂,形成单链 ,该过程
不需要解旋酶的催化，D错误。
3.[2024·湖北孝感期中]聚合酶链式反应 是一种体外迅速扩增目
的基因的技术。某研究小组计划通过 扩增目的基因，有关叙述正
确的是( )
A.必须不断向反应体系中加入模板
B.必须不断向反应体系中加入耐高温的 聚合酶
C.必须不断向反应体系中加入 连接酶
D.必须不断改变反应体系中温度
√
[解析] 该反应体系中需要加入模板，合成后的 分子又可作
为模板，故不需要向反应体系中重复加入模板 ，A错误；反应体
系中加入的聚合酶为耐高温的 聚合酶，该酶可以重复使用，
不需要重复加入，B错误； 技术需要的条件是目的基因作为模板、
两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶等，不需要
连接酶，C错误；在 扩增目的基因的过程中，需要经历变性
以上、复性左右和延伸左右 ，因此反应体系中
的温度需要不断改变，D正确。
4.[2024·山东济宁质检]将水稻耐盐
碱基因 导入不耐盐碱水
稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海
水稻新品种。下图表示 扩增
A.和
B.和
C.和
D.和
时需要添加引物，应选用的引物组合为( )
√
[解析] 有游离的磷酸基团的
一端为链的 端，有羟
基的一端为链的 端。
进行 时，引物与模板链
的端结合，因此在扩增 时需要添加的引物是
和 ，A正确。
5.[2024·江苏南通月考]下列关于 过程及结果的叙述，错误的是
( )
A.相比细胞内的复制，过程不需要解旋酶、 连接酶等
B.通过控制仪的温度，可重复循环多次，使 数量呈指数式增长
C.若酶和引物都正常，但是未出现扩增带，其原因可能是核酸模板
变性不彻底
D.理论上推测，经轮循环后的产物中只含1种引物的 片段占比
为
√
[解析] 通过高温破坏氢键，通过耐高温的 聚合酶延伸子链，
所以过程不需要解旋酶、连接酶等，A正确；通过控制
仪的温度，可重复循环多次，使 数量呈指数式增长，B正确；变
性是在高温条件下将 双链解开，作为模板，若酶和引物都正常，
但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底，C正确；
进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在 的两端，
经过轮循环，产物共有个分子，其中仅含有一种引物的
片段为2个(即含有亲代模板链的两个)，故理论上推测，经过 轮循
环，产物中只含有一种引物的片段所占比例为 ，
D错误。
6.[2024·河南南阳中学月考]通过引物设计运用 技术可以实现目的
基因的定点突变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引
物1序列中含有一个碱基 不能与目的基因片段配对，但不影响引物
与模板链的整体配对，反应体系中引物1
和引物2分别设计增加限制酶和限制酶
的识别位点。有关叙述正确的是( )
A.限制酶和限制酶 的识别位点分别加在引
物1和引物2的 端
B.在 反应体系中还需要加入4种游离核糖
核苷酸、解旋酶、 聚合酶等
C.第2轮 ，引物1与图中②结合并且形成两
条链等长的突变基因
D.在第3轮 结束后，含突变碱基对且两条
链等长的占
√
[解析] 的合成方向是从子链的端向 端
延伸，据此可知，图中限制酶和限制酶 的
识别位点分别加在引物1和引物2的 端，A正
确；在 反应体系中还需要加入4种游离脱
氧核苷酸、 聚合酶等，不需要加入
核糖核苷酸、解旋酶，B错误；在第2轮 中，引物1能与图中②结合
并且形成两条链不等长的突变基因，C错误；在第3轮 结束后，含突
变碱基对且两条链等长的有2个，分子总数共 个，所以比例
为 ，D错误。
7.[2024·辽宁阜新期末] 是将
逆转录和 的聚合酶链式
反应相结合的技术,可利用此技术获取
目的基因，具体过程如图所示,以下说
法错误的是( )
A.设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B. 含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
C.该技术用于对某些微量 病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的 聚合酶和引物A等
√
[解析] 利用 技术扩增目的基因的前
提是要有一段已知目的基因的核苷酸序
列，以便根据这一序列合成引物，因此
需要考虑目的基因两端的碱基序列，A
正确；碱基对之间有三个氢键， 含量高时稳定性高，所以需
要更高的复性温度，B正确；该技术可用于获取并大量扩增目的基因，
因此当 病毒量较少时，可以利用此技术增加核酸含量，提高检测的
灵敏度，C正确；过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆
转录酶和引物A等，D错误。
知识点二 片段的扩增及电泳鉴定
8.下列关于 片段的扩增及电泳鉴定原理的说法，正确的是( )
A.在一定的条件下 分子可带上正电荷或负电荷
B.带电 分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动
C.分子在凝胶中的迁移速率与 分子大小、构象等有关，与
凝胶的浓度等无关
D.凝胶中的分子可以直接在波长为 的紫外灯下被检测出来
√
[解析] 分子具有可解离的基团，在一定的 条件下这些基团可
带上正电荷或负电荷，从而能在电泳的条件下发生定向移动，A正确；
带电 分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相反的电极移动，
B错误；分子在凝胶中的迁移速率除了与 分子的大小、构象
等有关外，还与凝胶的浓度有关，C错误；凝胶中的 分子需要经
过染色后才能在波长为 的紫外灯下被检测出来，D错误。
9.[2024·重庆统测]以洋葱为材料提取后，用 技术对目的基因
进行扩增，并对扩增产物进行电泳检查。若电泳结果有多个条带，
则导致该结果的原因是( )
A.洋葱研磨离心后，取沉淀进行了纯化
B.所用的引物也结合了其他 序列
C.进行扩增时，变性温度设置成了
D.配制琼脂糖溶液时，没有加入核酸染料
√
[解析] 洋葱研磨离心后，应该取上清液，取沉淀进行了纯化，可能
提取不到 ，不会导致电泳结果有多个条带，A不符合题意；所用
的引物也结合了其他 序列，引物设计不合理，它们与非目标序
列结合，则电泳结果有多个条带，B符合题意；进行扩增时，变性温
度应该超过，若设置成了， 双链可能不会解开，最后
扩增不到 ，电泳结果不会出现多个条带，C不符合题意；配制琼
脂糖溶液时，没有加入核酸染料，会导致看不到条带，D不符合题意。
10.[2024·湖南邵阳二中期中]在基因工程操作中常
用琼脂糖凝胶电泳检测不同片段。科研人员
利用Ⅰ和 Ⅰ两种限制酶处理某 分子，得到
如下电泳图谱。其中1号泳道是标准样品，2号、3号、4号分别是 Ⅰ
单独处理、Ⅰ单独处理、Ⅰ和 Ⅰ共同处理后的电泳结果。下列
说法正确的是 ( )
A.该可能是含的环状 分子
B.电泳图谱中 片段越小，距离起点越近
C.Ⅰ和Ⅰ能够催化 的氢键断裂
D.Ⅰ和Ⅰ的切点最短相距约
√
[解析] 据图可知，用 Ⅰ单独处理(2号)
或用 Ⅰ单独处理(3号)都只得到一种大
小为的片段，说明该 最
可能是含的环状 分子，A正
确；电泳图谱中片段越小，距离起点越远，B错误；Ⅰ和 Ⅰ
都是限制酶，限制酶切割 分子，破坏的是作用位点上两脱氧核糖核
苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；由题图知，该 可能是一个含
的环状分子，两种限制酶同时切割时产生和
两种长度的片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距 ，D
错误。
11.聚合酶链式反应是一种用于扩增特定的 片段的分子生物学技
术，下图为 扩增中第一轮的变化，探究下列问题：
(1)引物是___________________________________________________
____，如果在某基因组定位了一个目的基因 ，但是其核苷酸序列未
知，现已知邻近区域的上、下游的部分 序列，此时如何设计引
物？___________________________________________。
一小段能与母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
可根据邻近区域的上、下游已知序列设计引物
[解析] 引物是一小段能与 母链的一段碱基序列互补配对的短单
链核酸;虽然目的基因的核苷酸序列未知，但 邻近区域的上、下游
的部分序列已知，因此可根据 邻近区域的上、下游已知序列设
计引物。
(2)结合下图分析 过程中需要引物的原因是___________________
_________________________________________。 链复制的方向
是_______________________。
加入引物，能够使聚合酶从引物的端开始连接脱氧核苷酸
从子链的端向端延伸
[解析] 聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连
接到已经存在的片段上。加入引物，能够使聚合酶从引物的
端开始连接脱氧核苷酸。链复制的方向总是从子链的端向 端
延伸。
(3)复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相
同，在 、C含量高时，复性温度需要适当______。
升高
[解析] 在引物的 、C含量高时，设定的复性温度要高一些，因为
分子中之间有三个氢键，之间有两个氢键， 含
量高时， 稳定性较高。第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取
【预习梳理】
1.(1)受体细胞性状　(2)蛋白质
(3)Bt抗虫蛋白
2.(1)已知结构和功能清晰的基因
(2)DNA测序　序列数据库　序列比对
3.(1)聚合酶链式反应　(3)体外　(4)DNA半保留复制　(5)变性、复性、延伸　(6)琼脂糖凝胶电泳
4.人工合成、构建基因文库
【任务活动】
任务一
[情境]
(1)变性　复性　两种引物　延伸　DNA聚合酶
(2)DNA模板　引物　脱氧核苷酸　耐高温的DNA聚合
(3)目的基因　不同　不能
(4)3'　碱基互补配对
(5)上一次循环的产物
(6)一倍　指数　三
(7)不能　mRNA需要逆转录成cDNA 再进行扩增
反馈评价
例1　D　[解析] 只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物,A错误;PCR扩增循环n次共需两种引物的数量为2×(2n-1)=2n+1-2,B错误;不需向PCR的反应体系中加入解旋酶,在体外通过高温使双链DNA解聚为单链,C错误;耐高温的DNA聚合酶可将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3'端,D正确。
例2　C　[解析] 引物与模板结合依赖于碱基的互补配对,引物长度过短,特异性降低,A正确;两种引物之间不能发生碱基互补配对,以防止引物之间结合形成双链而影响引物与DNA模板链的结合,B正确;引物的G—C含量越高,结合特异性越强,但G—C含量过高,不利于复性,从而阻碍目标DNA的扩增,C 错误;DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的,根据需要可在引物的5'端添加限制酶识别序列,以便更加准确地获得目的基因,D正确。
任务二
1.(1)DNA的热变性　调节温度
(2)①可解离　相反　②琼脂糖凝胶电泳
[分析]
(1)模板DNA、2种引物、Taq DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸　维持合适的pH,其含有的Mg2+能激活DNA聚合酶,给PCR反应提供一个最适合酶催化的条件
(2)电泳结果中DNA条带的分布。
反馈评价
例3　C　[解析] DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程是电泳,A正确,C错误;待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA分子在凝胶中的迁移速率,B正确;PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,D正确。
例4　A　[解析] 限制酶2切割后有7 kb这一种条带,若限制酶2切割后有两条7 kb,则DNA总长度可能为14 kb,A错误;限制酶1切割后产生了两个条带,说明至少有两个酶1的切割位点,B正确;若环状DNA总长度最短为7 kb,限制酶2切割后有7kb这一种条带,则该DNA上至少有1个酶2的切割位点,C正确;若两个酶1的切割位点与酶2的切割位点距离相同或酶2切割位点与其中一个酶1切割位点距离为1 kb,则同时用酶1和酶2切割,产生3 kb和1 kb或5 kb和1 kb两种长度的片段,电泳结果呈现两个条带,若不是,则会呈现多个条带,D正确。
【当堂自测】
1.(1)×　(2)×　(3)√　(4)×　(5)×
[解析] (1)利用PCR技术扩增目的基因不需要解旋酶催化,且所用的DNA聚合酶需要耐高温,而体内DNA复制需要解旋酶催化。
(2)PCR扩增过程经历了高温变性、低温复性和中温延伸的过程,而不是在恒温条件下进行的。
(3)C和G之间连有三个氢键,模板DNA中C—G碱基对多,氢键相对较多,DNA结构稳定,不容易解旋,DNA变性解链需要的温度相对更高。
(4)通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物时,电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
(5)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2.D　[解析] 出现非特异扩增条带可能的原因:模板DNA出现污染;复性温度过低;PCR循环次数过多等,D正确。
3.D　[解析] 变性过程温度超过90 ℃,复性过程温度在50 ℃左右,延伸过程温度在72 ℃左右,图示为复性阶段,其在PCR循环过程中需要的温度最低,A正确;PCR扩增过程中,脱氧核苷酸只能连接在引物3'端,B正确;延伸时,在TaqDNA聚合酶催化下,脱氧核苷酸会连接到引物的3'端,相邻的脱氧核苷酸间形成磷酸二酯键,C正确;由于两个引物均不结合在该片段的末端,第一轮循环后,得到的两个DNA片段中两条脱氧核苷酸链不等长,通过题图可推知,第二轮循环后也不会出现两条链等长的产物,在第三轮循环后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的目的产物,所以扩增三个循环后可获得目的产物,D错误。
4.A　[解析] 该女孩患病,其父母表型正常,可判断该病为常染色体隐性遗传病,该女孩的基因型为bb,其父母的基因型均为Bb;根据图示分析可知,1350 bp的条带对应的基因为b,B基因被限制酶Mst Ⅱ切割可产生大小为1150 bp和200 bp的两个片段,1150 bp+200 bp=1350 bp,即B、b基因的长度相等,在基因突变产生等位基因的过程中发生了碱基对的替换,根据电泳结果可知,患病女孩的哥哥的基因型为BB,不含致病基因,A正确,B错误;限制酶能识别双链DNA中特定的脱氧核苷酸序列,并在特定部位断开磷酸二酯键,C错误;电泳过程中,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,D错误。第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取
1.目的基因
(1)概念:用于改变 或获得预期表达产物等的基因。
(2)类型:主要是指编码 的基因。
(3)举例:Bt基因通过产生 ,破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫。
2.筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法:从相关的 中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)认识基因结构和功能的技术方法: 技术、 、 工具。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR全称: 。
(2)作用:特异性地快速扩增目的基因。
(3)PCR的概念:
在 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(4)PCR的原理: 。
(5)扩增的过程:
重复循环多次,每次循环一般可以分为 三步。
(6)PCR产物的鉴定方法:常采用 。
4.其他获取目的基因的方法: 等。
任务一利用PCR获取和扩增目的基因
【情境】阅读教材P78PCR反应过程示意图,分析下面内容。
(1)请完善图中信息。
(2)PCR的条件是一定的缓冲液、 、2种 、4种 和 酶等。
(3)PCR所需引物是依据 的一段已知序列设计而成的,图中引物A与引物B (填“相同”或“不同”),其在PCR过程中 (填“能”或“不能”)重复利用。
(4)复性过程中引物与DNA模板结合,延伸过程中,4种脱氧核苷酸加到引物的 端,新的DNA链的合成都遵循 原则。
(5)PCR反应中,下一次循环的模板是 。
(6)结果:PCR反应需要重复循环多次,每一次循环后目的基因的量可以增加 ,即呈 形式扩增,至少经 轮循环才可得到所需目的基因。
(7)用PCR (填“能”或“不能”)扩增mRNA,原因是 。
1.PCR技术与生物体内DNA复制的比较
PCR技术 生物体内的DNA复制
不 同 点 解旋 方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
场所 生物体外 主要在细胞核内
引物 短单链核酸(RNA或单链DNA分子片段) 一小段RNA
酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 细胞内含有的DNA聚合酶
温度 条件 需控制温度,在较高温度下进行 细胞内温和的温度条件
结果 在短时间内形成大量的DNA片段 形成完整的DNA分子
相 同 点 原理 DNA半保留复制
原料 四种脱氧核苷酸
条件 都需要模板、酶、引物等
[注意]
(1)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要用Mg2+激活,因此PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。
(2)在PCR反应中实际用到的原料是dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸),包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP。其作用是提供能量和原料,不需要单独加ATP。
2.由mRNA逆转录形成cDNA的过程
例1利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次,则()
A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需2n-2个引物参与子代DNA分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D.耐高温的DNA聚合酶可将脱氧核苷酸与引物3'端相连
例2[2024·山东青岛模拟]PCR作为一个体外酶促反应,其效率和特异性取决于两个方面,一是引物与模板的特异性结合,二是多聚酶对引物的延伸。引物设计的总原则是提高扩增的效率和特异性。下列有关叙述错误的是()
A.引物长度过短,特异性降低
B.两种引物之间不能发生碱基互补配对
C.引物的G—C含量越高,越利于目标DNA的扩增
D.可在引物的5'端添加特定限制酶的识别序列
[题后归纳]引物的选取原则
①引物自身不能环化;②两种引物之间不应存在互补序列,否则会相互结合成引物二聚体;③引物长度不宜过短,防止引物随机结合,使得不能特异性扩增目的基因。
任务二探究·实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.原理
(1)DNA片段的扩增
PCR利用了 原理,通过
来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳鉴定
①DNA分子具有 的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。
②PCR的产物一般通过 来鉴定。
③凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
2.操作过程
配制PCR反应体系:用微量移液器在微量离心管内加入PCR反应体系的各组分,并离心。
↓
进行PCR:设置好相关参数,将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
↓
配制琼脂糖溶液:依据待分离的DNA片段的大小配制,加入适量核酸染料。
↓
制备凝胶
↓
加样,进行电泳(注:留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。)
↓
分析结果
[分析]
(1)配制PCR反应体系时,应加入的物质有: 扩增缓冲液等,其中扩增缓冲液能 。
(2)通过PCR是否成功扩增出DNA片段,判断依据是什么
例3下列有关电泳的叙述,不正确的是()
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA分子在凝胶中的迁移速率
C.进行电泳时,带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
例4[2024·山东枣庄期末]某环状DNA分别用限制酶1和限制酶2完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳,结果如下图所示(注:kb表示千碱基对数,M代表标准对照)。下列叙述不正确的是()
A.该DNA总长度不可能为14kb
B.该DNA上至少有2个酶1的切割位点
C.该DNA上至少有1个酶2的切割位点
D.同时用酶1和酶2切割该DNA,电泳结果至少呈现2个条带
1.正误辨析
(1)利用PCR技术扩增目的基因所需的酶与体内DNA复制所需的酶相同。()
(2)在恒温条件下进行PCR扩增避免温度变化导致酶失活。()
(3)PCR技术中,DNA模板链上碱基G和C的比例越高,DNA变性解链所需的温度就越高。()
(4)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,电泳时电泳缓冲液不能没过凝胶。()
(5)凝胶中的DNA分子可以通过电子显微镜被检测出来。()
2.[湖北卷]某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是()
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
3.[2024·福建南平期中]PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基;5'端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列相关分析错误的是()
A.在PCR的循环过程中,图示过程需要的温度最低
B.四种脱氧核苷酸作为原料将会连接到引物的3'端
C.TaqDNA聚合酶催化相邻的脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
D.用图示引物扩增至少四个循环后才能获得目的产物
4.[2024·河南漯河月考]某女孩患有一种单基因遗传病,该遗传病由等位基因B/b控制,其父母及哥哥的表型均正常。现将其家庭成员的相关基因用限制酶MstⅡ切割后进行电泳,结果如图所示。已知B、b基因中仅有一种基因上含有一个限制酶MstⅡ的酶切位点。下列相关叙述正确的是()
A.该遗传病属于常染色体隐性遗传病,患病女孩的哥哥不含致病基因
B.该致病基因出现是基因突变的结果,突变过程中发生了碱基对的增添
C.限制酶MstⅡ能识别特定的核糖核苷酸序列,并在特定部位断开氢键
D.电泳过程中,DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取
1.A　[解析] 目的基因是在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因,A错误。
2.D　[解析] PCR全称为聚合酶链式反应,循环过程分为变性、复性和延伸三步,A正确;PCR技术以解开的DNA双链为模板合成DNA,利用的原理是DNA半保留复制,B正确;利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物,C正确;双链DNA模板在高温作用下,氢键断裂,形成单链DNA,该过程不需要解旋酶的催化,D错误。
3.D　[解析] 该反应体系中需要加入模板DNA,合成后的DNA分子又可作为模板,故不需要向反应体系中重复加入模板DNA,A错误;反应体系中加入的DNA聚合酶为耐高温的DNA聚合酶,该酶可以重复使用,不需要重复加入,B错误;PCR技术需要的条件是目的基因作为模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等,不需要DNA连接酶,C错误;在PCR扩增目的基因的过程中,需要经历变性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)和延伸(72 ℃左右),因此反应体系中的温度需要不断改变,D正确。
4.A　[解析] 有游离的磷酸基团的一端为DNA链的5'端,有羟基的一端为DNA链的3'端。进行PCR时,引物与模板链的3'端结合,因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5'—CTTGGATGAT—3'和5'—TCTGTTGAAT—3',A正确。
5.D　[解析] PCR通过高温破坏氢键,通过耐高温的DNA聚合酶延伸子链,所以PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等,A正确;通过控制PCR仪的温度,可重复循环多次,使DNA数量呈指数式增长,B正确;变性是在高温条件下将DNA双链解开,作为模板,若酶和引物都正常,但是不出现扩增带,其原因可能是核酸模板变性不彻底,C正确;DNA进行半保留复制,每次复制都需要两种引物结合在DNA的两端,经过n轮循环,产物共有2n个DNA分子,其中仅含有一种引物的DNA片段为2个(即含有亲代模板链的两个),故理论上推测,经过n轮循环,产物中只含有一种引物的DNA片段所占比例为2/2n=1/2n-1,D错误。
6.A　[解析] DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸,据此可知,图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5'端,A正确;在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等,不需要加入核糖核苷酸、解旋酶,B错误;在第2轮PCR中,引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因,C错误;在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个,DNA分子总数共23个,所以比例为=1/4,D错误。
7.D　[解析] 利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物,因此需要考虑目的基因两端的碱基序列,A正确;G—C碱基对之间有三个氢键,G—C含量高时稳定性高,所以需要更高的复性温度,B正确;该技术可用于获取并大量扩增目的基因,因此当RNA病毒量较少时,可以利用此技术增加核酸含量,提高检测的灵敏度,C正确;过程Ⅰ是逆转录过程,所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等,D错误。
8.A　[解析] DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH条件下这些基团可带上正电荷或负电荷,从而能在电泳的条件下发生定向移动,A正确;带电DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相反的电极移动,B错误;DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子的大小、构象等有关外,还与凝胶的浓度有关,C错误;凝胶中的DNA分子需要经过染色后才能在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。
9.B　[解析] 洋葱研磨离心后,应该取上清液,取沉淀进行了纯化,可能提取不到DNA,不会导致电泳结果有多个条带,A不符合题意;所用的引物也结合了其他DNA序列,引物设计不合理,它们与非目标序列结合,则电泳结果有多个条带,B符合题意;进行扩增时,变性温度应该超过90 ℃,若设置成了72 ℃,DNA双链可能不会解开,最后扩增不到DNA,电泳结果不会出现多个条带,C不符合题意;配制琼脂糖溶液时,没有加入核酸染料,会导致看不到条带,D不符合题意。
10.A　[解析] 据图可知,用EcoRⅠ单独处理(2号)或用SmaⅠ单独处理(3号)都只得到一种大小为1000 bp的DNA片段,说明该DNA最可能是含1000 bp的环状DNA分子,A正确;电泳图谱中DNA片段越小,距离起点越远,B错误;EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ都是限制酶,限制酶切割DNA分子,破坏的是作用位点上两脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键,C错误;由题图知,该DNA可能是一个含1000 bp的环状DNA分子,两种限制酶同时切割时产生800 bp和200 bp两种长度的DNA片段,所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp,D错误。
11.(1)一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　可根据X邻近区域的上、下游已知序列设计引物
(2)加入引物,能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　从子链的5'端向3'端延伸
(3)升高
[解析] (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸;虽然目的基因X的核苷酸序列未知,但X邻近区域的上、下游的部分DNA序列已知,因此可根据X邻近区域的上、下游已知序列设计引物。(2)DNA聚合酶不能从头合成子链,只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物,能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5'端向3'端延伸。(3)在引物的G、C含量高时,设定的复性温度要高一些,因为DNA分子中G—C之间有三个氢键,A—T之间有两个氢键,G—C含量高时,DNA稳定性较高。第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取
知识点一利用PCR获取和扩增目的基因
1.下列有关获取目的基因的叙述,错误的是()
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
2.下列有关PCR技术的说法,不正确的是()
A.PCR的循环过程分为变性、复性和延伸三步
B.PCR技术的原理是DNA半保留复制
C.利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
D.PCR扩增中解旋酶的作用是解开双链DNA
3.[2024·湖北孝感期中]聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增目的基因的技术。某研究小组计划通过PCR扩增目的基因,有关叙述正确的是()
A.必须不断向反应体系中加入模板DNA
B.必须不断向反应体系中加入耐高温的DNA聚合酶
C.必须不断向反应体系中加入DNA连接酶
D.必须不断改变反应体系中温度
4.[2024·山东济宁质检]将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中,培育耐盐碱海水稻新品种。下图表示PCR扩增OsMYB56时需要添加引物,应选用的引物组合为()
A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'
B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'
C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'
D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3
5.[2024·江苏南通月考]下列关于PCR过程及结果的叙述,错误的是()
A.相比细胞内的DNA复制,PCR过程不需要解旋酶、DNA连接酶等
B.通过控制PCR仪的温度,可重复循环多次,使DNA数量呈指数式增长
C.若酶和引物都正常,但是未出现扩增带,其原因可能是核酸模板变性不彻底
D.理论上推测,经n轮循环后的产物中只含1种引物的DNA片段占比为1/(2n-1)
6.[2024·河南南阳中学月考]通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是()
A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5'端
B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、TaqDNA聚合酶等
C.第2轮PCR,引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
7.[2024·辽宁阜新期末]RT-PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应相结合的技术,可利用此技术获取目的基因,具体过程如图所示,以下说法错误的是()
A.设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B.G—C含量高的引物在与模板链结合时,复性的温度较高
C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度
D.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等
知识点二DNA片段的扩增及电泳鉴定
8.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定原理的说法,正确的是()
A.在一定的pH条件下DNA分子可带上正电荷或负电荷
B.带电DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动
C.DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象等有关,与凝胶的浓度等无关
D.凝胶中的DNA分子可以直接在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
9.[2024·重庆统测]以洋葱为材料提取DNA后,用PCR技术对目的基因进行扩增,并对扩增产物进行电泳检查。若电泳结果有多个条带,则导致该结果的原因是()
A.洋葱研磨离心后,取沉淀进行了纯化
B.所用的引物也结合了其他DNA序列
C.进行扩增时,变性温度设置成了72℃
D.配制琼脂糖溶液时,没有加入核酸染料
10.[2024·湖南邵阳二中期中]在基因工程操作中常用琼脂糖凝胶电泳检测不同DNA片段。科研人员利用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子,得到如下电泳图谱。其中1号泳道是标准DNA样品,2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、EcoRⅠ和SmaⅠ共同处理后的电泳结果。下列说法正确的是()
A.该DNA可能是含1000bp的环状DNA分子
B.电泳图谱中DNA片段越小,距离起点越近
C.EcoRⅠ和SmaⅠ能够催化DNA的氢键断裂
D.EcoRⅠ和SmaⅠ的切点最短相距约800bp
11.聚合酶链式反应是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,下图为PCR扩增中第一轮的变化,探究下列问题:
(1)引物是 ,如果在某基因组定位了一个目的基因X,但是其核苷酸序列未知,现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列,此时如何设计引物 。
(2)结合下图分析PCR过程中需要引物的原因是 。
DNA链复制的方向是 。
(3)复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,假设引物的长度相同,在G、C含量高时,复性温度需要适当 。

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