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专题精研课12　PCR技术中引物的拓展应用
应用一　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
专项突破
1.(2024·山东青岛期末)某研究小组构建了能表达ACTA1—GFP融合蛋白的重组质粒,该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
注:F1和F2表示上游引物,R1和R2表示下游引物。
A.RNA聚合酶与启动子结合,调控ACTA1基因和GFP基因的表达
B.使用F2和R2一对引物,可以确定ACTA1基因插入方向是否正确
C.ACTA1基因转录的模板链是a链,引物F1与b链的部分序列相同
D.为了减少PCR中非特异性条带的产生,可以适当升高复性的温度
B
解析 据图可知,ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间,故RNA聚合酶与启动子结合,调控ACTA1基因和GFP基因的表达,A项正确;据图可知,引物F1、R2或F2、R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列,因此推测为了确定ACTA1基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若用一对引物,应选择图中的引物F1、R2或F2、R1,B项错误;ACTA1基因转录的模板链是a链,引物F1与b链均可以和a链互补配对,二者部分序列相同,C项正确;非特异条带增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少反应中非特异性条带的产生,D项正确。
应用二　利用PCR技术引导基因定点突变
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
专项突破
2.(2024·福建福州期末)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　　)
A.在该PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、耐高温的DNA聚合酶等
B.第2轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA分子占1/2
答案 C　
解析 PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶,直接利用高温解旋,不需要加解旋酶,A项错误;第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因,B项错误;引物中设计两种限制酶识别位点,可以配合载体的限制酶识别位点,帮助目的基因定向定点插入运载体,避免发生自身环化,C项正确;第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个,而子代DNA有23=8个,故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4,D项错误。
应用三　利用PCR技术扩增未知基因序列
利用PCR技术进行基因扩增时,为了便于设计引物,要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。
专项突破
3.(2024·广西南宁二模)常规PCR只能扩增两引物之间的DNA序列,要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列,可用反向PCR技术。反向PCR
技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.酶切阶段,L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B.环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
C.图中引物,应选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对
D.PCR扩增,将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合
D
解析 在酶切阶段,已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列,否则会将已知序列L切断,造成序列识别混乱,A项正确;T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端,因此环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶,B项正确;PCR过程需要两种引物,能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合,为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列,应该选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对,C项正确;PCR扩增中,将温度调至72 ℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将四种脱氧核苷酸,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,D项错误。
应用四　利用PCR技术快速检测病原体
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段,为迅速而准确地确定病原体的存在和种类,发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法,它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA,并且具备高度的特异性和敏感性。
专项突破
4.(2024·湖北华中师大附中高三模拟)幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌,其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白,用重叠延伸PCR技术(指在PCR技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因,且不会影响基因的表达)进行连接,构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒,实验流程如图所示。据图回答下列问题。
(1)重叠PCR获得带有标签的MreB基因
①获得两种具有重叠片段DNA的过程中,PCR1和PCR2必须在不同的反应体系中,原因是_________________________________________________
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
②PCR3反应体系中所加入的引物是　　　　　 　　　　　。
引物2和引物3中存在互补配对的片段,置于同一反应体系时,它们会发生结合而失去作用
引物1、引物4
(2)重组质粒的构建
①为将带有标签的MreB基因定向插入pK18mobSacB质粒中,需要在引物末端添加限制酶识别序列,据图分析,在引物1添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在引物4添加的序列所对应的限制酶是　　　　。经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobSacB质粒进行连接时,可选用
　　　　　　　　　(填“E.coliDNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
②重组质粒中,KmR基因的作用是
　　　　　 　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　。
SmaⅠ　
XhoⅠ　
T4 DNA连接酶　
鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来
解析 (1)①重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术,引物2和引物3中存在互补配对的片段,置于同一反应体系时,它们会发生结合而失去作用。②分析题意可知,PCR3是为了获得带有标签的MreB基因,所以应选择引物1和引物4。(2)①要将带有标签的MreB基因定向插入pK18mobSacB质粒中的启动子与终止子之间,EcoRⅠ在启动子两侧均有其切割位点,因此不能选择EcoRⅠ,在引物1添加的序列所对应的限制酶只能是SmaⅠ,在引物4添加的序列所对应的限制酶只能是XhoⅠ;SmaⅠ切割后产生平末端,经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mobSacB质粒进行连接时应选择T4 DNA连接酶。②重组质粒中,KmR基因是标记基因,其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
应用五　DNA片段电泳与遗传试题的综合
DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团带有正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同,凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来,若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同,则在电场作用下移动距离不同,最终使得A、a得以分开,形成不同的条带。
专项突破
5.(2024·辽宁辽阳模拟)生菜的颜色受两对等位基因A/a和B/b控制。野生生菜通常表现为红色,人工栽培的生菜品种均表现为绿色。让某纯合野生型红色生菜植株与人工栽培的绿色生菜植株杂交,所得F1再自交,F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7。育种工作者根据A/a和B/b的基因序列设计了特异性引物,并分别对F2中编号为1~8的部分红色生菜植株的DNA进行扩增和分离,结果如图所示。下列分析错误的是(　　)
A.杂交亲本的基因型是AABB和aabb
B.由植株1~8的DNA扩增和分离结果可知,F2红色生菜植株中基因A/a杂合的概率高于基因B/b的
C.野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的
D.植株1~8中的杂合子占3/4,但杂合子的基因型不一定相同
答案 B　
解析 F1自交,F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9∶7,说明红色生菜基因型为A_B_,F1基因型为AaBb,由图可知,植株3、5的A/a、B/b的基因扩增结果都只有一条带,可知3、5为纯合子,杂交亲本的基因型为AABB和aabb时,满足亲本性状为红色和绿色,F1基因型为AaBb,A项正确;植株1~8个体数较少,其基因型存在偶然性,F2红色植株的基因型为A_B_,A/a基因杂合的概率等于B/b,B项错误;F2中红色生菜植株与绿色生菜植株的数量之比始终为9(A_B_)∶7,野生生菜通常表现为红色,因此野生生菜的性状是由两种显性基因共同决定的,C项正确;植株1~8中,除3、5是纯合子外,其余均是杂合子,杂合子占3/4,由图DNA扩增和分离的条带分布可知杂合子基因型不一定相同,D项正确。

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