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第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
知识点一　平板划线法分离和纯化微生物
1.下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是（　　）
A.将接种环放在火焰上灼烧
B.用已冷却的接种环挑取菌体
C.挑取菌体和划线都要在火焰旁进行
D.接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连
2.下列有关倒平板的操作，错误的是（　　）
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上
D.待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作
3.（2024·江苏宿迁期中）下列关于实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作说法正确的是（　　）
A.培养酵母菌的试剂和器具都要进行湿热灭菌
B.配制培养基、倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行
C.倒好的平板要立即使用，以免表面干燥，影响酵母菌生长
D.对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿底标记
4.如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤。下列有关叙述正确的是（　　）
A.步骤①操作时，倒好平板后应立即将其倒置，防止冷凝水落在培养基上
B.步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环伸入菌种管无菌体部位，待其冷却再挑取菌体
C.步骤③沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现的单个菌落计数
D.步骤④将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都是X细菌菌落
知识点二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
5.（2023·江苏扬州高二期中）某研究小组对非灭菌的一次性口罩中的微生物进行检测，部分操作如下：从口罩上剪取总量9 cm2样品（体积近似1 mL），剪碎后加入已灭菌的生理盐水中，定容至10 mL，充分混匀，得到样液。下列说法正确的是（　　）
A.对培养基使用电热鼓风干燥箱灭菌处理后，倒4个平板冷却后倒放搁置
B.向前3个平板中分别加入1 mL样液，用涂布器将样液涂布均匀
C.第4个平板接种等量已灭菌的生理盐水并培养，可用于检测是否有杂菌污染
D.若一段时间后，4个平板上长出的菌落数依次为31、42、35和0个，可计算出1 cm2口罩样品中菌体数量为36个
6.下列关于菌种计数方法的叙述，错误的是（　　）
A.若空白对照组中有7个菌落，则需要重新进行实验
B.应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据
C.为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D.在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果
7.（多选）（2024·南通高二期中）研究小组利用稀释涂布平板法来探究某河流中大肠杆菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，错误的是（　　）
A.涂布前，将取有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽后还要冷却
B.涂布完成后，将培养皿倒置于室温培养1～2 d
C.计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要全部平均
D.若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得最准确数据
8.（2024·江苏泰州一模）某种物质A（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个。相关叙述正确的是（　　）
A.实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
B.乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照
C.③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂布于平板上
D.若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105
9.（2024·江苏阶段练习）用纸片扩散法测定某病原菌对各种抗生素敏感性的实验，是在某病原菌均匀分布的平板上，铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。如图为培养的结果，其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列分析正确的是（　　）
A.不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响
B.在图示固体培养基上可用平板划线法或稀释涂布平板法接种病原菌
C.未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生抗性变异
D.形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
10.（多选）（2024·江苏南京一模）A、B、C、D四种抗生素均可治疗金黄色葡萄球菌（Sau）引起的肺炎，为选出有最佳疗效的抗生素，研究者将分别含等剂量抗生素的四张大小相同的滤纸片a、b、c、d置于Sau均匀分布的平板培养基上，在适宜条件下培养48 h，结果如图。下列叙述正确的是（　　）
A.实验中一般采用干热灭菌的方法对培养皿进行灭菌处理
B.四种抗生素中，抗生素A治疗Sau感染引起的肺炎效果最好
C.滤纸片b周围抑菌圈中出现的菌落，离抑菌圈越远抗药性越强
D.接种涂布后的培养皿倒置于37 ℃的恒温箱中培养
11.（2024·江苏泰州期中）某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下：
请分析并回答下列问题：
（1）该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于　　　　培养基，从功能上来说，属于　　　　　培养基，琼脂在培养基中的作用是　　　　　　。
（2）该培养基中只选择了　　　　作为唯一氮源。氮源在菌体内可以参与合成　　　　　　　（答出2种即可）等生物大分子。
（3）琼脂培养基灭菌后，冷却至温度　　　 ℃左右时，倒入培养皿中，冷凝后倒置，从而获得平板培养基，倒置的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）分解尿素的细菌能产生　　　　酶，将尿素分解为　　　　。
（5）在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，涂布器的灭菌方法是　　　　　　　。
（6）实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的估算数目是　　　　个。
第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
1.D　划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，D错误。
2.C　倒平板时，培养皿的皿盖不能完全打开。
3.D　培养酵母菌的试剂通常要进行湿热灭菌，实验器具可以采用干热灭菌或灼烧灭菌，A错误；倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行，而配制培养基不需要在酒精灯的火焰旁进行，因为培养基最后还需要灭菌，B错误；倒好的平板需要冷却后使用，且不宜久存，以免表面干燥，影响接种后微生物的生长，C错误；由于是倒置培养，对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿底标记，这样便于观察，D正确。
4.B　等平板冷却凝固后，将平板倒置备用，A错误；接种环和试管口的灼烧都属于无菌操作，接种环伸入菌种管无菌体部位，待其冷却后才能挑取菌体，B正确；计数一般使用稀释涂布平板法，平板划线法不适合计数，C错误；步骤④培养后得到的菌落可能还有杂菌，需要进一步纯化，D错误。
5.C　对培养基使用高压蒸汽灭菌法灭菌处理，A错误；用稀释涂布平板法统计细菌数量时，滴加到培养基表面的菌悬液的量一般不超过0.1 mL，其原因是避免培养基表面的菌液出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果，B错误；培养接种等量已灭菌的生理盐水的固体培养基是为了作为对照组，第4个平板接种等量已灭菌的生理盐水并与前3个平板共同培养，可用于检测是否有杂菌污染，C正确；第4个平板没有菌落形成，说明没有杂菌污染，且前三个平板长出的菌落数均在30～300之间，说明操作中的稀释倍数（10倍）是合适的。若接种的样液是0.1 mL，则9 cm2口罩样品中菌体数量为（31＋42＋35）÷3÷0.1×10＝3 600个，则1 cm2口罩样品中菌体数量为400个，D错误。
6.C　若空白对照组中有7个菌落，则说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，A正确；计数时应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据，B正确；为了保证结果准确，一般采用菌落数为30～300的平板进行计数，C错误；在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果，D正确。
7.BCD　使用涂布器在酒精灯下涂布时，要先将涂布器取少量酒精进行灼烧灭菌，燃尽后还要冷却再进行涂布，A正确；涂布完成后，将培养皿倒置于37 ℃恒温箱中培养1～2 d，B错误；计算平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值，C错误；若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。
8.D　实验时，要从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株，则①为淤泥取样进行稀释，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，淤泥中有菌种，因此不能进行灭菌处理；盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A错误；识图分析可知，③是稀释涂布平板法接种到以A为唯一碳源和氮源的选择培养基上，因此乙为固体培养基，需要加琼脂和物质A等，为了提高准确度，实验需设平行重复实验，且需要另外设置空白对照，检测培养基配制是否合格，B错误；③接种方法为稀释涂布平板法，接种工具是涂布器，但是不能用涂布器蘸取菌液，应该将菌液用微量移液管加入到培养基中，用涂布器进行均匀涂抹，C错误；若乙平板上长出的菌落数平均为240个，假设稀释倍数为a，根据摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个，在每个平板上涂布0.1 mL稀释后的菌液，则有240×a÷0.1＝2.4×108，则稀释倍数a＝105，D正确。
9.A　纸片所含的药物吸取平板中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响，A正确；图示固体培养基上用的是稀释涂布平板法接种病原菌，B错误；病原菌发生抗性变异在接触之前，未出现抑菌圈可能是病原菌对该抗生素不敏感，C错误；微生物对药物较敏感形成的抑菌圈应较大，形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物敏感程度较低，D错误。
10.ABD　干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术，可以对培养皿进行灭菌处理，A正确；据抑菌圈的大小，抗生素D的抑菌圈最小，治疗Sau感染引起的肺炎效果最差；而抗生素A抑菌圈最大，则治疗Sau感染引起的肺炎效果最好，B正确；滤纸片b周围抑菌圈中出现的菌落，离抑菌圈越远，药性变弱，说明菌落抗药性越弱，C错误；接种涂布后的培养皿倒置于37 ℃的恒温箱中培养，防止冷凝水滴落引发杂菌污染，D正确。
11.（1）固体　选择　作为凝固剂　（2）尿素　蛋白质、核酸　（3）50　防止培养皿盖上的水珠落入培养基，造成污染（或防止培养基中的水分蒸发）　（4）脲　NH3和CO2
（5）（火焰）灼烧灭菌法　（6）7.6×1011
解析：（1）琼脂可作为凝固剂，故从物理性质来说，含琼脂的培养基属于固体培养基；该实验中用于筛选分解尿素的细菌的培养基为选择培养基。（2）该实验中用于筛选分解尿素的细菌的选择培养基应选择以尿素作为唯一氮源，氮源主要是提供氮元素，在菌体内可以用于合成蛋白质、核酸等大分子含氮有机物。（3）琼脂培养基灭菌后，冷却至温度50 ℃左右开始倒平板，温度太高会烫手，温度太低培养基会凝固；待平板冷凝后将平板倒置，目的是防止培养皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，以及防止培养基中的水分蒸发。（4）分解尿素的细菌产生的脲酶能将尿素分解为NH3和CO2。（5）在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，涂布器的灭菌方法是火焰灼烧灭菌法。（6）由于平板计数的适宜值在30～300之间，所以应选择7号试管涂布的平板进行计数，其平均菌落数为（58＋73＋97）/3＝76，据图可知，10 g土壤样品经梯度稀释至7号试管，稀释度为108倍，而不是107倍，因为在锥形瓶中已经稀释10倍，所以利用公式计算每克土壤样品中的菌落数为（C÷V）×M＝（76÷0.1）×108＝7.6×1010，但要特别注意，此时求出的是1 g土壤中的微生物数量，所以该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的数目是7.6×1010×10＝7.6×1011个。
3 / 3第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
导学 聚焦 1.能通过平板划线法和稀释涂布平板法的操作，掌握微生物分离和纯化的基本方法。 2.学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌，并对实验结果进行分析和评价
知识点（一）　平板划线法分离和纯化微生物
1.平板划线法
（1）概念：是指把含有多种微生物的　　　　样品，通过在特定的琼脂平板表面　　　　　　　，从而获得　　　　　　的方法。
（2）具体做法：将微生物样品在琼脂平板表面多次做“　　　　　　”的稀释划线，经过这样的操作可得到较多独立分布的　 　　　微生物。
（3）操作步骤
2.通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
（1）培养基和培养皿灭菌
将配制好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基装入　　　　，用　　　　塞紧，并用　　　　包住棉塞扎在瓶口上，置于　　　　　　　　　　中；用牛皮纸将　　　　包好后也放入高压蒸汽灭菌锅中，与培养基一起灭菌。
（2）倒平板
①在　　　　　　　　旁，打开装有培养基的锥形瓶瓶塞，使　　　　迅速通过火焰2～3次，并转动瓶口。
②取　　　　　　　　，在火焰旁将培养皿打开（　　　　锥形瓶瓶口），将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中。
③等平板　　　　　　后，将平板　　　　备用。
（3）划线和培养
①划线：利用平板划线法在平板上划线。
②培养酵母菌
划完线后盖上　　　　，置于　　　恒温箱内，　　　　培养。通过培养可以得到由单个酵母菌增殖而形成的菌落。
（4）结果与分析
①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的　　　　出现　　　　的单个菌落。
②纯化失败的原因
a.接种环灭菌后　　　　直接在斜面上挑取菌体，菌体可能因为接触高温接种环而死亡。
b.若第一次划线前挑取的菌体　　　　，则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。
3.基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）培养基分装到培养皿后再进行湿热灭菌。（　　）
（2）倒平板操作中，等待平板冷却凝固后，要将平板倒置。（　　）
（3）平板划线操作中，划完一个区域后要将接种环灼烧，再划下一个区域。（　　）
（4）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用。（　　）
1.阅读教材P22有关倒平板的内容，回答下列问题：
（1）倒平板时，为什么在酒精灯火焰旁操作？
（2）倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
（3）平板冷凝后为何要倒置？
2.阅读教材P21有关平板划线法的内容，回答下列问题：
（1）平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
（2）在琼脂平板表面多次做“由点到线”的稀释划线的目的是什么？
（3）接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环，其目的分别是什么？
1.平板划线法的注意事项
（1）灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（2）在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（3）划线时最后一区域不要与第一区域相连。
（4）划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
2.平板划线灼烧接种环的目的
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上原有的微生物
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，下列关于倒平板的具体叙述，正确的是（　　）
①待培养基冷却至40 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板　②将灭菌后的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞　③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰　④用左手的拇指和食指完全打开皿盖　⑤右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖　⑥等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A.①③④⑤ B.④⑤⑥
C.③⑤ D.①②④⑥
2.（多选）为了获得纯化的酵母菌菌落，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行划线接种，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（　　）
A.为保证无菌操作，接种环使用前必须灭菌
B.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
C.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
D.接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行
知识点（二）　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
1.稀释涂布平板法
（1）用途：是常用的　　　　　　　　微生物的方法，也可以对微生物进行　　　　。
（2）操作方法
将待分离的材料做一系列的　　　　　，再取一定量的　　　　　　　　　的菌液涂布平板，然后用　　　　　　　　　将菌液均匀涂布在整个平板表面，使其中的微生物充分分散，培养后在平板培养基表面形成　　　　　　　　。
2.混合平板法：将稀释的少量菌悬液与　　　　左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样在培养基　　　　　　　　均可长出单个菌落。
3.分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
（1）实验目的
①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。
②学会采用　　　　　　　　　　　分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。
（2）实验原理
①利用　　　　培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在　　　　　　的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成　　　　菌落。单个菌落即为　　　　　　　　，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
（3）实验器材和试剂
①土壤样品。
②灭菌处理过的各种工具。
③配制以　　　　为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。
（4）实验步骤
（5）结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。
4.基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。（　　）
（2）稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数。（　　）
（3）测定不同微生物数量时，接种的土壤悬液的稀释度相同。（　　）
（4）采用混合平板法分离和纯化微生物时，仅在培养基的表面长出菌落。（　　）
（5）通过培养未接种的培养基，可以判断是否存在着杂菌污染。（　　）
探讨一　探究分离分解尿素的细菌
1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方如表所示：
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
（1）在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
（2）分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
探讨二　探究测定微生物数量的方法
2.甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
（1）甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否可靠？为什么？
（2）某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板菌落数稀释度 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
（3）为什么统计的菌落数往往比活菌的实际数目低？
　纯化方法的比较
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中
接种工具 接种环 涂布器 －
能否用于 计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 可以计数
培养结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板表面和内部
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
1.（2024·江苏苏州检测）如图所示为两种微生物分离纯化的方法，下列叙述正确的是（　　）
A.甲图中3号试管的稀释倍数为10倍
B.甲图所测定的微生物数量一般用菌落数表示
C.乙图所示的操作过程中接种环需要灼烧3次
D.甲、乙两种操作均可以用于微生物的计数
2.如图为“分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列描述错误的是（　　）
A.在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀
B.对4号试管中的稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能恰为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低
　（1）平板划线法是指把含有多种微生物的杂菌样品，通过　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，从而获得单个菌落的方法。
（2）某同学在某一浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？原因是什么？
1.下列关于制备固体培养基时倒平板的叙述，正确的是（　　）
A.倒好的培养基和培养皿要进行干热灭菌
B.应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C.为防止微生物侵入培养基，要在酒精灯火焰旁进行操作
D.倒好培养基后，应立即将平板倒过来放置
2.（2023·江苏连云港高二期中）下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是（　　）
A.应根据微生物代谢类型选择合适的培养基并控制好培养基的pH
B.实验操作时应避免已灭菌的材料用具与周围物品接触
C.使用过的培养基应进行灭菌，不应直接丢弃
D.待培养基冷却至室温后，在酒精灯火焰附近倒平板
3.（2023·淮安高二检测）将微生物接种到平板培养基上的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法等。下列相关叙述正确的是（　　）
A.平板划线法只能用于微生物的分离纯化，稀释涂布平板法只能用于微生物的计数
B.平板划线法使用无菌接种针接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布
C.采用两种方法接种后，通常需要在皿盖上注明相关信息
D.采用两种方法接种后，都需要将平板倒置放入恒温培养箱中培养
4.（多选）在分离、纯化酵母菌实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如图所示，且甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是（　　）
A.配制培养基时需进行湿热灭菌
B.甲中a区域为划线的起始位置
C.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D.图示接种过程中接种环灼烧了4次
5.（2024·江苏苏州检测）某中学生物兴趣小组在进行A细菌的培养过程中，发现了另一种B细菌，在B细菌周围A细菌的生长繁殖受到抑制，这有可能是B细菌产生了不利于（抑制）A细菌生存的物质。
（1）现在请你在以下实验的基础上，继续完成验证A细菌生长繁殖受到抑制的原因的实验过程：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（用序号、文字和箭头作答）。
（2）上图所示培养基中加入了　　　　　　，该培养基属于固体培养基。培养微生物前，所用培养基一般需采用　　　　　　　法进行灭菌，接种微生物常用的方法有　　　　　　　、　　　　　　　。
第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术
【核心要点·巧突破】
知识点（一）
自主学习
1.（1）杂菌　划线稀释　单个菌落　（2）由点到线　单个
（3） 皿底　 第1　 第2　 过火灭菌　 由点到线
倒置　 菌落
2.（1）锥形瓶　棉塞　牛皮纸　高压蒸汽灭菌锅　培养皿　（2）①酒精灯火焰　瓶口　②无菌培养皿　稍大于　③冷却凝固　倒置　（3）②皿盖　28 ℃　倒置　（4）①末端　不连续
②a.未冷却　b.过多
3.（1）×　提示：培养基湿热灭菌后再分装到培养皿。
（2）√
（3）√
（4）√
互动探究
1.（1）提示：酒精灯火焰旁是无菌区域，可以避免周围环境中的微生物的污染。
（2）提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
（3）提示：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快蒸发。
2.（1）提示：①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②划线操作在酒精灯火焰旁进行。③接种环挑取菌体前后，要将试管口通过火焰。④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
（2）提示：这样做可以得到较多独立分布的单个微生物增殖而成的菌落。
（3）提示：每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。接种结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
学以致用
1.C　琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不能及时操作，琼脂会凝固；无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基；等待平板冷却凝固（需5～10 min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
2.ACD　为保证无菌操作，接种环使用前必须灭菌，A正确；倒平板后无须间歇晃动，B错误；图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落，C正确；酒精灯火焰附近是无菌区，接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行，D正确。
知识点（二）
自主学习
1.（1）分离和纯化　计数　（2）梯度稀释　某一稀释度　无菌的涂布器　多个单菌落
2.50 ℃　表面和内部
3.（1）②稀释涂布平板法　（2）①选择　②高度稀释　单个　纯化培养物　（3）③尿素　（4） 3～5　 无菌水　 氮源
无菌水　 污染　 最低　 3　 倒置　 24 1030～300　11 稀释　12体积
4.（1）√
（2）√
（3）×　提示：因土壤中各种微生物的数量不同，因此测定不同的微生物数量要采用不同的稀释度。
（4）×　提示：在培养基表面和内部均可长出菌落。
（5）√
互动探究
1.（1）提示：葡萄糖和尿素。
（2）提示：该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
2.（1）提示：不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
（2）提示：105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为（212＋234＋287）/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为（244÷0.1）×105＝2.44×108（个）。
（3）提示：当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
学以致用
1.B　图中将10 g土样加入到90 mL的无菌水，已经稀释10倍，随后每次吸取1 mL菌液，加入到9 mL无菌水中，都是稀释10倍，因此可知3号试管是稀释104倍，A错误；菌落是单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定形态结构的子细胞的群落，因此甲图所测定的微生物数量一般用菌落数表示，B正确；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成乙图中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成乙图所示的操作过程共需灼烧接种环6次，C错误；据图可知，甲图表示稀释涂布平板法接种微生物，可以用来进行微生物的计数，乙图表示平板划线法接种微生物，不能用于计数，D错误。
2.C　5号试管的结果表明每克土壤中菌株数为（168＋175＋167）÷3÷0.1×106＝1.7×109，C错误；用这种计数方法得到的结果往往比活菌的实际数目低，因为有可能多个细菌形成一个菌落，D正确。
【过程评价·勤检测】
网络构建
　（1）在特定的琼脂平板表面划线稀释
（2）提示：不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不是简单地将结果舍弃后进行计数。
课堂演练
1.C　应该在倒平板之前将培养基进行湿热灭菌，将培养皿进行干热灭菌或湿热灭菌，A错误；倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，B错误；倒好培养基后，等培养基冷凝后再将平板倒过来放置，D错误。
2.D　应根据微生物代谢类型选择合适的培养基并控制好培养基的pH，这样才能确保培养的微生物能够正常生长，A正确；实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触，以防止杂菌污染，B正确；使用过的培养基应进行灭菌，不应直接丢弃，以免污染环境，C正确；培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，当感觉到锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板。操作时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，以防止瓶口的微生物污染培养基，D错误。
3.D　平板划线法和稀释涂布平板法均可用于微生物的分离纯化，但只有稀释涂布平板法适用于微生物的计数，A错误；平板划线法使用无菌接种环接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布，B错误；采用两种方法接种后，通常需要在皿底上注明相关信息，C错误。
4.BD　为了能彻底灭菌，配制的培养基需进行湿热灭菌，A正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，甲中d区域为划线的起始位置，a区域为划线的结束位置，B错误；由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，图示甲中共有4次划线接种，故接种过程中接种环灼烧了5次，D错误。
5.（1）④去除步骤③中培养皿里的B细菌并保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦观察A细菌的生长情况
（2）凝固剂（或琼脂）　高压蒸汽灭菌　平板划线法　稀释涂布平板法
解析：（1）该实验的目的是验证A细菌生长繁殖受到抑制的原因是B细菌产生了不利于（抑制）A细菌生存的物质，可以利用培养B细菌的培养基培养A细菌，看A细菌的繁殖是否受到影响，实验过程为：④去除步骤③中培养皿里的B细菌并保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦观察A细菌的生长情况。（2）题图所示培养基中加入了凝固剂（或琼脂），该培养基属于固体培养基。培养微生物前，所用培养基一般需采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，接种微生物常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
7 / 7(共78张PPT)
第2课时　
微生物分离、纯化和培养的无菌技术
导
学 聚
焦 1.能通过平板划线法和稀释涂布平板法的操作，掌握微生物分
离和纯化的基本方法。
2.学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌，并对实
验结果进行分析和评价
核心要点·巧突破
01
过程评价·勤检测
02
课时训练·提素能
03
目录
CONTENTS
核心要点·巧突破
01
精准出击 高效学习
知识点（一）　平板划线法分离和纯化微生物
1. 平板划线法
（1）概念：是指把含有多种微生物的 样品，通过在特
定的琼脂平板表面 ，从而获得
的方法。
（2）具体做法：将微生物样品在琼脂平板表面多次做“
”的稀释划线，经过这样的操作可得到较多独立分布
的 微生物。
杂菌　
划线稀释　
单个菌落　
由点到
线　
单个　
（3）操作步骤
2. 通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
（1）培养基和培养皿灭菌
将配制好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基装入 ，
用 塞紧，并用 包住棉塞扎在瓶口上，置
于 中；用牛皮纸将 包好后也
放入高压蒸汽灭菌锅中，与培养基一起灭菌。
锥形瓶　
棉塞　
牛皮纸　
高压蒸汽灭菌锅　
培养皿　
②取 ，在火焰旁将培养皿打开（
锥形瓶瓶口），将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中。
③等平板 后，将平板 备用。
无菌培养皿　
稍大于　
冷却凝固　
倒置　
（2）倒平板
①在 旁，打开装有培养基的锥形瓶瓶塞，
使 迅速通过火焰2～3次，并转动瓶口。
酒精灯火焰　
瓶口　
（3）划线和培养
①划线：利用平板划线法在平板上划线。
②培养酵母菌
划完线后盖上 ，置于 恒温箱内，
培养。通过培养可以得到由单个酵母菌增殖而形成的菌落。
皿盖　
28 ℃　
倒置　
（4）结果与分析
①酵母菌被纯化的标准：培养24 h后，在划线的 出
现 的单个菌落。
②纯化失败的原因
a.接种环灭菌后 直接在斜面上挑取菌体，菌体可
能因为接触高温接种环而死亡。
b.若第一次划线前挑取的菌体 ，则也有可能无法获
得由一个酵母菌形成的单个菌落。
末端　
不连续　
未冷却　
过多　
3. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）培养基分装到培养皿后再进行湿热灭菌。 （　×　）
提示：培养基湿热灭菌后再分装到培养皿。
（2）倒平板操作中，等待平板冷却凝固后，要将平板倒置。
（　√　）
（3）平板划线操作中，划完一个区域后要将接种环灼烧，再划下
一个区域。 （　√　）
（4）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用。
（　√　）
×
√
√
√
1. 阅读教材P22有关倒平板的内容，回答下列问题：
（1）倒平板时，为什么在酒精灯火焰旁操作？
提示：酒精灯火焰旁是无菌区域，可以避免周围环境中的微
生物的污染。
（2）倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
（3）平板冷凝后为何要倒置？
提示：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，避免培养基中的
水分过快蒸发。
2. 阅读教材P21有关平板划线法的内容，回答下列问题：
（1）平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
提示：①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②划线操
作在酒精灯火焰旁进行。③接种环挑取菌体前后，要将试管
口通过火焰。④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接
种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
（2）在琼脂平板表面多次做“由点到线”的稀释划线的目的是
什么？
提示：这样做可以得到较多独立分布的单个微生物增殖而成
的菌落。
（3）接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环，其目
的分别是什么？
提示：每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌
种。接种结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避
免污染环境和感染操作者。
1. 平板划线法的注意事项
（1）灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太
高杀死菌种。
（2）在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末
端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而
逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（3）划线时最后一区域不要与第一区域相连。
（4）划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
2. 平板划线灼烧接种环的目的
灼烧时期 目的
取菌种前 杀死接种环上原有的微生物
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
1. 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，下列关于倒平板的具体叙
述，正确的是（　　）
①待培养基冷却至40 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板　②
将灭菌后的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞　③右手拿锥形
瓶，使瓶口迅速通过火焰　④用左手的拇指和食指完全打开皿
盖　⑤右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培
养皿的皿盖　⑥等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置，使
皿盖在下，皿底在上
A. ①③④⑤ B. ④⑤⑥
C. ③⑤ D. ①②④⑥
解析： 　琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝
固，倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不能及时操作，
琼脂会凝固；无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气
中的微生物会进入培养基；等待平板冷却凝固（需5～10 min）
后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
2. （多选）为了获得纯化的酵母菌菌落，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基
上进行划线接种，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（　　）
A. 为保证无菌操作，接种环使用前必须灭菌
B. 倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
C. 图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单
菌落
D. 接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行
解析： 　为保证无菌操作，接种环使用前必须灭菌，A正确；
倒平板后无须间歇晃动，B错误；图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，
应从Ⅲ区挑取单菌落，C正确；酒精灯火焰附近是无菌区，接种和
划线操作需要在酒精灯火焰附近进行，D正确。
知识点（二）　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
1. 稀释涂布平板法
（1）用途：是常用的 微生物的方法，也可以对微
生物进行 。
（2）操作方法
将待分离的材料做一系列的 ，再取一定量
的 的菌液涂布平板，然后用
将菌液均匀涂布在整个平板表面，使其中的微生物充分
分散，培养后在平板培养基表面形成 。
分离和纯化　
计数　
梯度稀释　
某一稀释度　
无菌的涂布
器　
多个单菌落　
2. 混合平板法：将稀释的少量菌悬液与 左右的培养基混合
均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养，这样
在培养基 均可长出单个菌落。
3. 分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数
（1）实验目的
①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。
②学会采用 分离和培养分解尿素的细
菌，并进行计数。
50 ℃　
表面和内部　
稀释涂布平板法　
（2）实验原理
①利用 培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在 的条件下，于固体培养基上培养该微生
物，形成 菌落。单个菌落即为 ，通
过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
选择　
高度稀释　
单个　
纯化培养物　
（3）实验器材和试剂
①土壤样品。
②灭菌处理过的各种工具。
③配制以 为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及
调节pH的相关试剂。
尿素　
（4）实验步骤
（5）结果与分析：菌落数目在30～300的一组平板上一般可以获得
单个分解尿素的细菌菌落。
4. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
（　√　）
（2）稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数。 （　√　）
（3）测定不同微生物数量时，接种的土壤悬液的稀释度相同。
（　×　）
提示：因土壤中各种微生物的数量不同，因此测定不同的微
生物数量要采用不同的稀释度。
√
√
×
（4）采用混合平板法分离和纯化微生物时，仅在培养基的表面长
出菌落。 （　×　）
提示：在培养基表面和内部均可长出菌落。
（5）通过培养未接种的培养基，可以判断是否存在着杂菌污染。
（　√　）
×
√
探讨一　探究分离分解尿素的细菌
1. 筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方如表所示：
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
（1）在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别
是什么物质？
提示：葡萄糖和尿素。
（2）分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
提示：该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮
源，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
探讨二　探究测定微生物数量的方法
2. 甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。
在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
（1）甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该
同学的统计结果是否可靠？为什么？
提示：不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复
实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平
均值。
（2）某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌
落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板菌落数稀释度 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示：105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为（212＋234＋287）/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为（244÷0.1）×105＝2.44×108（个）。
（3）为什么统计的菌落数往往比活菌的实际数目低？
提示：当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是
一个菌落。
纯化方法的比较
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
主要步骤 接种环在固
体培养基表
面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布
平板操作 取稀释的少量菌
悬液与50 ℃左
右的培养基混合
均匀倒入无菌培
养皿中
接种工具 接种环 涂布器 －
方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法
能否用于
计数 不能计数 可以计数，但是操作复
杂，需涂布多个平板 可以计数
培养结果 菌落仅在平板表面 菌落出现在平板
表面和内部
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获
得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目
的，也可用于观察菌落特征
1. （2024·江苏苏州检测）如图所示为两种微生物分离纯化的方法，
下列叙述正确的是（　　）
A. 甲图中3号试管的稀释倍数为10倍
B. 甲图所测定的微生物数量一般用菌落数表示
C. 乙图所示的操作过程中接种环需要灼烧3次
D. 甲、乙两种操作均可以用于微生物的计数
解析： 　图中将10 g土样加入到90 mL的无菌水，已经稀释10
倍，随后每次吸取1 mL菌液，加入到9 mL无菌水中，都是稀释10
倍，因此可知3号试管是稀释104倍，A错误；菌落是单个微生物在
适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见有
一定形态结构的子细胞的群落，因此甲图所测定的微生物数量一般
用菌落数表示，B正确；接种环在每次接种前和接种结束后都要通
过灼烧来灭菌，所以完成乙图中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接
种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成乙图
所示的操作过程共需灼烧接种环6次，C错误；据图可知，甲图表示稀释涂布平板法接种微生物，可以用来进行微生物的计数，乙图表示平板划线法接种微生物，不能用于计数，D错误。
2. 如图为“分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数”实验中样品稀释
示意图。据图分析下列描述错误的是（　　）
A. 在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的
橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀
B. 对4号试管中的稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能恰为5
号试管的10倍
C. 5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108
D. 该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低
解析： 　5号试管的结果表明每克土壤中菌株数为（168＋175＋
167）÷3÷0.1×106＝1.7×109，C错误；用这种计数方法得到的
结果往往比活菌的实际数目低，因为有可能多个细菌形成一个菌
落，D正确。
过程评价·勤检测
02
反馈效果 筑牢基础
　（1）平板划线法是指把含有多种微生物的杂菌样品，通过
，从而获得单个菌落的方法。
在特
定的琼脂平板表面划线稀释　
（2）某同学在某一浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结
果的处理是否合理？原因是什么？
提示：不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结
果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出
差异的原因，而不是简单地将结果舍弃后进行计数。
　　
1. 下列关于制备固体培养基时倒平板的叙述，正确的是（　　）
A. 倒好的培养基和培养皿要进行干热灭菌
B. 应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C. 为防止微生物侵入培养基，要在酒精灯火焰旁进行操作
D. 倒好培养基后，应立即将平板倒过来放置
解析： 　应该在倒平板之前将培养基进行湿热灭菌，将培养皿进
行干热灭菌或湿热灭菌，A错误；倒平板时，用左手将培养皿打开
一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左
手立即盖上培养皿的皿盖，B错误；倒好培养基后，等培养基冷凝
后再将平板倒过来放置，D错误。
2. （2023·江苏连云港高二期中）下列关于微生物分离和培养的叙
述，错误的是（　　）
A. 应根据微生物代谢类型选择合适的培养基并控制好培养基的pH
B. 实验操作时应避免已灭菌的材料用具与周围物品接触
C. 使用过的培养基应进行灭菌，不应直接丢弃
D. 待培养基冷却至室温后，在酒精灯火焰附近倒平板
解析： 　应根据微生物代谢类型选择合适的培养基并控制好培养
基的pH，这样才能确保培养的微生物能够正常生长，A正确；实验
操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触，以防
止杂菌污染，B正确；使用过的培养基应进行灭菌，不应直接丢
弃，以免污染环境，C正确；培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右
时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，当感觉
到锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板。操作时
应使锥形瓶的瓶口通过火焰，以防止瓶口的微生物污染培养基，D
错误。
3. （2023·淮安高二检测）将微生物接种到平板培养基上的方法主要
有平板划线法和稀释涂布平板法等。下列相关叙述正确的是
（　　）
A. 平板划线法只能用于微生物的分离纯化，稀释涂布平板法只能用
于微生物的计数
B. 平板划线法使用无菌接种针接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布
器涂布
C. 采用两种方法接种后，通常需要在皿盖上注明相关信息
D. 采用两种方法接种后，都需要将平板倒置放入恒温培养箱中培养
解析： 　平板划线法和稀释涂布平板法均可用于微生物的分离纯
化，但只有稀释涂布平板法适用于微生物的计数，A错误；平板划
线法使用无菌接种环接种，稀释涂布平板法使用无菌涂布器涂布，
B错误；采用两种方法接种后，通常需要在皿底上注明相关信息，
C错误。
4. （多选）在分离、纯化酵母菌实验中，划线接种（甲）、培养结果
（乙）如图所示，且甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的
是（　　）
A. 配制培养基时需进行湿热灭菌
B. 甲中a区域为划线的起始位置
C. 连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D. 图示接种过程中接种环灼烧了4次
解析： 　为了能彻底灭菌，配制的培养基需进行湿热灭菌，A
正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，甲中d区域为划线的起
始位置，a区域为划线的结束位置，B错误；由于每次使用接种环
前后都要灼烧灭菌，图示甲中共有4次划线接种，故接种过程中接
种环灼烧了5次，D错误。
5. （2024·江苏苏州检测）某中学生物兴趣小组在进行A细菌的培
养过程中，发现了另一种B细菌，在B细菌周围A细菌的生长繁
殖受到抑制，这有可能是B细菌产生了不利于（抑制）A细菌生
存的物质。
（1）现在请你在以下实验的基础上，继续完成验证A细菌生长繁
殖受到抑制的原因的实验过程：

（用序号、文字和箭头作答）。
去除步骤③中培养皿里的
B细菌并保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦
观察A细菌的生长情况 　
解析： 该实验的目的是验证A细菌生长繁殖受到抑制的
原因是B细菌产生了不利于（抑制）A细菌生存的物质，可以
利用培养B细菌的培养基培养A细菌，看A细菌的繁殖是否受
到影响，实验过程为：④去除步骤③中培养皿里的B细菌并
保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦观察A细
菌的生长情况。
（2）如图所示培养基中加入了 ，该培养基
属于固体培养基。培养微生物前，所用培养基一般需采
用 法进行灭菌，接种微生物常用的方法
有 、 。
解析： 题图所示培养基中加入了凝固剂（或琼脂），该
培养基属于固体培养基。培养微生物前，所用培养基一般需
采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，接种微生物常用的方法有平
板划线法和稀释涂布平板法。
凝固剂（或琼脂）
高压蒸汽灭菌
平板划线法
稀释涂布平板法
课时训练·提素能
03
分级练习 巩固提升
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
知识点一　平板划线法分离和纯化微生物
1. 下列有关用平板划线法接种的操作，错误的是（　　）
A. 将接种环放在火焰上灼烧
B. 用已冷却的接种环挑取菌体
C. 挑取菌体和划线都要在火焰旁进行
D. 接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连
解析： 　划线时，不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，
D错误。
2. 下列有关倒平板的操作，错误的是（　　）
A. 将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B. 使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C. 将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上
D. 待培养基冷却到50 ℃左右时进行倒平板操作
解析： 　倒平板时，培养皿的皿盖不能完全打开。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
3. （2024·江苏宿迁期中）下列关于实验室培养和纯化酵母菌过程中
的部分操作说法正确的是（　　）
A. 培养酵母菌的试剂和器具都要进行湿热灭菌
B. 配制培养基、倒平板、接种均需要在酒精灯火焰旁进行
C. 倒好的平板要立即使用，以免表面干燥，影响酵母菌生长
D. 对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿底标记
1
2
3
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6
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解析： 　培养酵母菌的试剂通常要进行湿热灭菌，实验器具可以
采用干热灭菌或灼烧灭菌，A错误；倒平板、接种需要在酒精灯火
焰旁进行，而配制培养基不需要在酒精灯的火焰旁进行，因为培养
基最后还需要灭菌，B错误；倒好的平板需要冷却后使用，且不宜
久存，以免表面干燥，影响接种后微生物的生长，C错误；由于是
倒置培养，对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔
在皿底标记，这样便于观察，D正确。
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4. 如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤。下列有关叙述正确的
是（　　）
A. 步骤①操作时，倒好平板后应立即将其倒置，防止冷凝水落在培
养基上
B. 步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环伸入菌种管无
菌体部位，待其冷却再挑取菌体
C. 步骤③沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现
的单个菌落计数
D. 步骤④将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都
是X细菌菌落
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解析： 　等平板冷却凝固后，将平板倒置备用，A错误；接种环
和试管口的灼烧都属于无菌操作，接种环伸入菌种管无菌体部位，
待其冷却后才能挑取菌体，B正确；计数一般使用稀释涂布平板
法，平板划线法不适合计数，C错误；步骤④培养后得到的菌落可
能还有杂菌，需要进一步纯化，D错误。
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知识点二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物
5. （2023·江苏扬州高二期中）某研究小组对非灭菌的一次性口罩中
的微生物进行检测，部分操作如下：从口罩上剪取总量9 cm2样品
（体积近似1 mL），剪碎后加入已灭菌的生理盐水中，定容至10
mL，充分混匀，得到样液。下列说法正确的是（　　）
A. 对培养基使用电热鼓风干燥箱灭菌处理后，倒4个平板冷却后倒放
搁置
B. 向前3个平板中分别加入1 mL样液，用涂布器将样液涂布均匀
C. 第4个平板接种等量已灭菌的生理盐水并培养，可用于检测是否有
杂菌污染
D. 若一段时间后，4个平板上长出的菌落数依次为31、42、35和0
个，可计算出1 cm2口罩样品中菌体数量为36个
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解析： 　对培养基使用高压蒸汽灭菌法灭菌处理，A错误；用稀
释涂布平板法统计细菌数量时，滴加到培养基表面的菌悬液的量一
般不超过0.1 mL，其原因是避免培养基表面的菌液出现积液，导
致菌体堆积，影响分离效果，B错误；培养接种等量已灭菌的生理
盐水的固体培养基是为了作为对照组，第4个平板接种等量已灭菌
的生理盐水并与前3个平板共同培养，可用于检测是否有杂菌污
染，C正确；第4个平板没有菌落形成，说明没有杂菌污染，且前
三个平板长出的菌落数均在30～300之间，说明操作中的稀释倍数
（10倍）是合适的。若接种的样液是0.1 mL，则9 cm2口罩样品中菌体数量为（31＋42＋35）÷3÷0.1×10＝3 600个，则1 cm2口罩样品中菌体数量为400个，D错误。
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6. 下列关于菌种计数方法的叙述，错误的是（　　）
A. 若空白对照组中有7个菌落，则需要重新进行实验
B. 应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据
C. 为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D. 在某一浓度下至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果
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解析： 　若空白对照组中有7个菌落，则说明培养基灭菌不彻
底，需要重新进行实验，A正确；计数时应该选取培养基表面菌落
数目稳定时的记录作为有效数据，B正确；为了保证结果准确，一
般采用菌落数为30～300的平板进行计数，C错误；在某一浓度下
至少涂布三个平板，以它们的平均值作为统计结果，D正确。
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7. （多选）（2024·南通高二期中）研究小组利用稀释涂布平板法来
探究某河流中大肠杆菌的数量。每一个浓度涂布四个平板，并且设
置空白对照组。下列关于操作步骤的叙述，错误的是（　　）
A. 涂布前，将取有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，燃尽后还要冷
却
B. 涂布完成后，将培养皿倒置于室温培养1～2 d
C. 计算平板上的菌落数时，四个培养皿上的菌落数无论多少，都要
全部平均
D. 若空白对照组上有5个菌落，则实验组数据基础上减去5，以获得
最准确数据
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解析： 　使用涂布器在酒精灯下涂布时，要先将涂布器取少
量酒精进行灼烧灭菌，燃尽后还要冷却再进行涂布，A正确；涂布
完成后，将培养皿倒置于37 ℃恒温箱中培养1～2 d，B错误；计算
平板上的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，并
取其平均值，C错误；若空白对照组上有5个菌落，说明培养基灭
菌不彻底，需要重新进行实验，D错误。
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8. （2024·江苏泰州一模）某种物质A（一种含有C、H、N的有机
物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究
人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌
株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0.1 mL涂布到平板
上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个。相关叙述
正确的是（　　）
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A. 实验时，淤泥及盛有培养基的摇瓶通常采用高压蒸汽灭菌法进行
灭菌
B. 乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设
置空白对照
C. ③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂
布于平板上
D. 若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105
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解析： 　实验时，要从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌
株，则①为淤泥取样进行稀释，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，
淤泥中有菌种，因此不能进行灭菌处理；盛有培养基的摇瓶通常采
用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，A错误；识图分析可知，③是稀释涂
布平板法接种到以A为唯一碳源和氮源的选择培养基上，因此乙为
固体培养基，需要加琼脂和物质A等，为了提高准确度，实验需设
平行重复实验，且需要另外设置空白对照，检测培养基配制是否合
格，B错误；③接种方法为稀释涂布平板法，接种工具是涂布器，但是不能用涂布器蘸取菌液，应该将菌液用微量移液管加入到培养基中，用涂布器进行均匀涂抹，C错误；若乙平板上长出的菌落数平均为240个，假设稀释倍数为a，根据摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2.4×108个，在每个平板上涂布0.1 mL稀释后的菌液，则有240×a÷0.1＝2.4×108，则稀释倍数a＝105，D正确。
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9. （2024·江苏阶段练习）用纸片扩散法测定某病原菌对各种抗生素
敏感性的实验，是在某病原菌均匀分布的平板上，铺设含有不同种
抗生素的纸片后进行培养。如图为培养的结果，其中抑菌圈是在纸
片周围出现的透明区域。下列分析正确的是（　　）
A. 不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结
果造成影响
B. 在图示固体培养基上可用平板划线法或稀释涂布
平板法接种病原菌
C. 未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生
抗性变异
D. 形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
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解析： 　纸片所含的药物吸取平板中的水分溶解后便不断向纸片
周围区域扩散，不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果
造成影响，A正确；图示固体培养基上用的是稀释涂布平板法接种
病原菌，B错误；病原菌发生抗性变异在接触之前，未出现抑菌圈
可能是病原菌对该抗生素不敏感，C错误；微生物对药物较敏感形
成的抑菌圈应较大，形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物
敏感程度较低，D错误。
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10. （多选）（2024·江苏南京一模）A、B、C、D四种抗生素均可治
疗金黄色葡萄球菌（Sau）引起的肺炎，为选出有最佳疗效的抗生
素，研究者将分别含等剂量抗生素的四张大小相同的滤纸片a、
b、c、d置于Sau均匀分布的平板培养基上，在适宜条件下培养48
h，结果如图。下列叙述正确的是（　　）
A. 实验中一般采用干热灭菌的方法对培养皿进行灭菌
处理
B. 四种抗生素中，抗生素A治疗Sau感染引起的肺炎效
果最好
C. 滤纸片b周围抑菌圈中出现的菌落，离抑菌圈越远抗药性越强
D. 接种涂布后的培养皿倒置于37 ℃的恒温箱中培养
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解析： 　干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）
进行灭菌的技术，可以对培养皿进行灭菌处理，A正确；据抑菌
圈的大小，抗生素D的抑菌圈最小，治疗Sau感染引起的肺炎效果
最差；而抗生素A抑菌圈最大，则治疗Sau感染引起的肺炎效果最
好，B正确；滤纸片b周围抑菌圈中出现的菌落，离抑菌圈越远，
药性变弱，说明菌落抗药性越弱，C错误；接种涂布后的培养皿
倒置于37 ℃的恒温箱中培养，防止冷凝水滴落引发杂菌污染，D
正确。
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11. （2024·江苏泰州期中）某生物活动小组为探究当地农田土壤中分
解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平
板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下：
请分析并回答下列问题：
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（1）该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于
培养基，从功能上来说，属于 培养基，琼脂在培养
基中的作用是 。
解析： 琼脂可作为凝固剂，故从物理性质来说，含琼
脂的培养基属于固体培养基；该实验中用于筛选分解尿素的
细菌的培养基为选择培养基。
固体
选择
作为凝固剂
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（2）该培养基中只选择了 作为唯一氮源。氮源在菌体内
可以参与合成 （答出2种即可）等生物大
分子。
解析： 该实验中用于筛选分解尿素的细菌的选择培养
基应选择以尿素作为唯一氮源，氮源主要是提供氮元素，在
菌体内可以用于合成蛋白质、核酸等大分子含氮有机物。
尿素
蛋白质、核酸
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（3）琼脂培养基灭菌后，冷却至温度 ℃左右时，倒入培
养皿中，冷凝后倒置，从而获得平板培养基，倒置的原因
是
。
解析： 琼脂培养基灭菌后，冷却至温度50 ℃左右开始
倒平板，温度太高会烫手，温度太低培养基会凝固；待平板
冷凝后将平板倒置，目的是防止培养皿盖上的水珠落入培养
基，造成污染，以及防止培养基中的水分蒸发。
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防止培养皿盖上的水珠落入培养基，造成污染（或防止
培养基中的水分蒸发）　
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（4）分解尿素的细菌能产生 酶，将尿素分解为
。
解析： 分解尿素的细菌产生的脲酶能将尿素分解为
NH3和CO2。
（5）在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，涂布器的灭菌
方法是 。
解析： 在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，
涂布器的灭菌方法是火焰灼烧灭菌法。
脲
NH3和
CO2
（火焰）灼烧灭菌法
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（6）实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、
688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号
试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样
品中含有分解尿素的细菌的估算数目是 个。
7.6×1011　
解析： 由于平板计数的适宜值在30～300之间，所以应选择7号试管涂布的平板进行计数，其平均菌落数为（58＋73＋97）/3＝76，据图可知，10 g土壤样品经梯度稀释至7号试管，稀释度为108倍，而不是107倍，因为在锥形瓶中已经稀释10倍，所以利用公式计算每克土壤样品中的菌落数为（C÷V）×M＝（76÷0.1）×108＝7.6×1010，但要特别注意，此时求出的是1 g土壤中的微生物数量，所以该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的数目是7.6×1010×10＝7.6×1011个。
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