资源简介

第2课时　聚合酶链式反应（PCR）技术
知识点一　聚合酶链式反应（PCR）技术
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是（　　）
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制
C.退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
2.（2024·江苏连云港高二期中）下列有关PCR的叙述，正确的是（　　）
A.PCR的原理是DNA复制，解旋和复制是同时进行的
B.PCR的过程主要包括变性→延伸→退火，温度逐渐降低
C.PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n－1对
D.每一循环都消耗引物和原料，需要在操作中及时补充
3.（2024·江苏连云港高二期中）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，相关叙述正确的是（　　）
A.DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
B.要尽量避免引物内部或引物之间存在碱基互补序列
C.PCR过程中使用的引物一般为单链RNA片段
D.引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
4.（2024·江苏阜宁中学高二期中）用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（　　）
5.PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是（　　）
①稳定的缓冲溶液环境　②DNA模板
③引物　④dNTP　⑤热稳定的DNA聚合酶
⑥解旋酶　⑦限制性内切核酸酶　⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥
B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑧
D.①②③④⑤⑧
知识点二　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
6.下列关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述中，不正确的是（　　）
A.PCR过程需要Taq酶
B.PCR过程需要DNA连接酶
C.PCR扩增区域由2种引物来决定
D.不同大小的DNA在电场中迁移速率不同
7.（2024·徐州高二质检）在PCR反应体系中，加入过量的只与双链而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在游离状态不发出荧光，只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光。下列分析错误的是（　　）
A.PCR体系中需要加入Mg2＋来激活Taq酶
B.若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因的两种引物
C.荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中
D.荧光信号强度与产物的数量呈正相关
8.用PCR技术特异性地拷贝X基因，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是（　　）
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C.第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个X基因
D.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
9.（多选）（2024·南京金陵中学高二学情调研）荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR体系中每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增1条链，就有1个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是（　　）
A.图示引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.Taq酶催化子链从3'端向5'端延伸，需要dNTP作为原料
C.若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶
D.原料充足时，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关
10.（多选）PCR技术可用于遗传多样性的研究。如图是对跳虫A和跳虫B的DNA分析实验过程，下列有关叙述正确的是（　　）
A.蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时，加入蛋白酶有助于释放出DNA
B.Taq酶能够耐高温，常在PCR中用于DNA链的合成
C.将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小
D.阴性对照是加入DNA模板和PCR扩增过程中所需的其他混合物，以检测是否有“污染”
11.（2024·盐城实验高级中学高二期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题：
（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过　　　　　获得DNA用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的　　　　　　　　切割位点。设计引物时需要避免引物之间形成　　　　　　，从而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表　　　　　　，步骤2代表退火，步骤3代表　　　　　　，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏　　　　　　　　　　　的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但　　　　　　　　的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有　　　　　　（填序号）。
①升高退火温度
②降低退火温度
③重新设计引物
第2课时　聚合酶链式反应（PCR）技术
1.D　PCR过程中需要模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶、Mg2＋等，D错误。
2.C　PCR的原理是DNA复制，该过程中解旋和复制不是同时进行的，A错误；PCR的过程主要包括高温变性→低温退火→中温延伸，可见该过程中不是温度逐渐降低，B错误；PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制产生的子代DNA数目为2n个，其中的单链数目为2（n＋1）个，每个子链的延伸都需要引物，即除了两条最初的模板链中没有引物，因此该过程中共需引物2n－1对，C正确；PCR过程中的引物和原料是一次性添加的，不需要补充，D错误。
3.B　DNA子链是从5'端向3'端进行延伸，因此DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误；要尽量避免引物内部或引物之间存在碱基互补序列，防止因引物内部或引物之间碱基互补降低目标DNA扩增效率，B正确；PCR过程中使用的引物一般为单链DNA片段，C错误；引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。
4.D　利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5'端到3'端，据此依题意和图示分析可知，扩增后得到的绝大部分DNA片段如图D所示。
5.D　PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳定的缓冲溶液环境，①正确；PCR反应需要一定量的模板DNA、引物对、4种dNTP（提供能量和原料）、热稳定的DNA聚合酶，②③④⑤正确；PCR反应过程中通过高温使DNA变性解旋，不需要解旋酶，⑥错误；PCR反应不需要限制性内切核酸酶，⑦错误；PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，⑧正确。
6.B　PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以复制过程中要用热稳定的DNA聚合酶（Taq酶），A正确；PCR过程中用热稳定的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合，不需要DNA连接酶，B错误；PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3'端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物，由于DNA的两条模板链为反向平行，所以复制时需要两种引物，C正确；不同大小的DNA在电场中的迁移速率不同，因此可通过电泳的方法检测扩增产物，D正确。
7.B　在PCR体系中需要加入Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合酶，用于合成DNA子链，A正确；若要扩增一个DNA上的某基因，应加入该基因的两种引物，B错误；荧光染料只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光，在PCR反应的延伸阶段形成DNA双链，C正确；荧光染料可用来鉴定扩增结果，扩增的产物越多，则荧光信号强度越强，D正确。
8.D　PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增片段的特定序列，上一轮复制的产物为下一轮复制的模板。可根据DNA的半保留复制特点画出前两轮复制的产物的示意图，再找规律。据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；第二轮复制得到22＝4个DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；第三轮复制得到23＝8个DNA分子：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤，所以共有①②各1个，③④各2个，⑤2个（等长），也就是有2个X基因（⑤），C正确；第四轮复制得到24＝16个DNA分子：①复制得①和③、②复制得到②和④、2个③复制得2个③和2个⑤、2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤得到4个⑤，所以第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个⑤（X基因），D错误。
9.BD　图示引物与探针均为根据某条模板链设计的单链DNA，因而具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；根据图示中引物延伸的方向可以确定Taq酶可以催化子链沿着5'端向3'端的方向延伸，需要dNTP作为原料，B错误；若要用上述技术检测某基因的转录水平，需要以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成DNA后再进行PCR的扩增，因此要用到逆转录酶，C正确；由题干信息“每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针”“每扩增1条链，就有1个荧光分子生成”可知，原料充足时，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D错误。
10.ABC　蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，真核生物的DNA与蛋白质结合在一起，因此，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA，A正确；Taq酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的合成，B正确；阴性对照是未加入DNA模板但加入PCR扩增过程中所需的其他混合物，目的是检测试剂是否污染，D错误。
11.（1）逆转录　（2）限制性内切核酸酶（或限制酶）　碱基互补配对　（3）变性　延伸　（4）引物与模板　G—C含量高　（5）②③
解析：（1）PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶（限制酶）的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。（3）根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。（4）退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物时需要设定更高的退火温度。（5）如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低退火温度、重新设计引物等。
3 / 3第2课时　聚合酶链式反应（PCR）技术
导学 聚焦 1.根据细胞内DNA复制原理和过程，理解聚合酶链式反应的原理、条件和步骤。 2.利用PCR技术在体外对特定的DNA片段进行大量复制，并完成电泳鉴定
知识点（一）　聚合酶链式反应（PCR）技术
1.概念：是目的DNA片段（目的基因）的　　　　　　技术。
2.条件：在向PCR管中加入一定量的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等后，设置好反应程序，启动PCR仪，自动完成反应步骤。
3.聚合酶链式反应（PCR）步骤
（1）PCR的过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、退火和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
①变性：当温度上升到约　　　　，双链DNA解旋为　　　　　　　　。
②退火：当温度下降到　　　　　左右时，　　　　　　　　通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度回升到　　　　左右时，溶液中的4种　　　　　　　　在　　　　　　　　　　　　　　的作用下，根据碱基互补配对原则，连接到　　　　　　之后，使引物延长，合成新的DNA链。
（2）PCR反应的结果
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，热稳定的DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈　　　　扩增。
4.应用
（1）广泛应用于医学及分子生物学等领域，如：　　　　　　　、　　　　　　　、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。
（2）在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
5.基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）PCR过程不需要解旋酶。（　　）
（2）DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。（　　）
（3）每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，呈指数形式扩增。（　　）
（4）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。（　　）
　图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
（1）高温变性的目的是使　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）PCR所需引物是依据　　　　　　的一段已知序列设计而成的，图1中引物A与引物B　　　　（填“相同”或“不同”），其在PCR过程中　　　　（填“能”或“不能”）重复利用。
（3）DNA复制时为什么需要引物？
（4）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生等长的目的基因（可用相关图解解释）？
（5）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。
（6）如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种 引物的DNA 分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种 引物的DNA 分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷 酸链等长的 DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
1.如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是（　　）
A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后，片段c的数量为230
2.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，下列有关叙述正确的是（　　）
A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D.理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
知识点（二）　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
1.实验目的
（1）尝试运用PCR仪扩增DNA片段。
（2）关注PCR技术的应用。
（3）学习　　　 　　　　　　检测DNA片段的方法和技术。
2.实验原理
（1）扩增DNA片段的过程包括　　　　、　　　　和　　　　等步骤的多次循环。
（2）理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加　　　　　，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的　　　　倍。
（3）PCR反应体系包括：DNA模板、　　　　　　　　、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、人工合成的　　　　　　　　　、Taq酶等。
（4）在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的　　　　温度。
（5）PCR和体内DNA复制的差异
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留　　　　局部区域复制 半保留　　　　　全链复制
起始位点 引物　　　端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶（　　　酶） 多种酶
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 　　　解旋 　　　　解旋
引物 　　 　　片段，　　　　在复制的子链中 　　　 　片段，　　　　在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
3.实验器材和试剂
（1）仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或　　　　　　　　、微孔加热器（微量恒温仪）等。
（2）试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
4.实验步骤
（1）PCR扩增目的基因AKP
①采用微量取液器，在0.2 mL PCR管内配制50 μL反应体系
dNTP 混合物 10×PCR 缓冲液 正向 引物 反向 引物 模板 DNA Taq酶 双蒸水
4 μL 5 μL 2 μL 2 μL 1 μL 1 μL 35 μL
②按下述程序进行扩增
程序 温度 时间
a预变性 94 ℃ 5 min
b变性 1 min
c退火 55 ℃ 1 min
d延伸 72 ℃
e重复步骤b～d — 30个循环
f延伸 72 ℃ 7～10 min
（2）电泳分析
①电泳：维持恒压　　　　 1.5～2 h。
②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或　　　　　　　　　　观察和记录电泳结果。
5.基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。（　　）
（2）DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率。（　　）
（3）利用PCR技术在体外扩增DNA，只需要提取少量的DNA即可。（　　）
（4）利用琼脂糖凝胶电泳可以检测PCR扩增产物。（　　）
1.在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
2.试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？
3.一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，应该从哪些方面进行分析？
1.影响DNA分子迁移速率的因素
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在PCR技术扩增DNA片段的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。
2.未出现扩增条带的主要原因
①Taq酶失活。
②引物出现质量问题。
③Mg2＋浓度过低。
④变性时的温度低，变性时间短。
3.出现非特异性扩增条带的主要原因
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
1.（多选）聚合酶链式反应（PCR）是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2＋。下列有关说法正确的是（　　）
A.细胞核内DNA复制的引物是一小段RNA，PCR的引物通常是一小段DNA
B.酶是指热稳定的DNA聚合酶，它能从引物的3'端羟基（—OH）开始延伸DNA链
C.dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、U、C、G 4种碱基
D.引物自身不应存在连续的互补序列，引物对之间也不应有较强的互补性
2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是（　　）
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
　
（1）PCR技术是　　　　　　　　　　　　　　　　技术。
（2）PCR技术需要的条件是模板DNA、　　　　、4种　　　　、缓冲液和热稳定的　　　　　　　　　、Mg2＋等。
（3）PCR不需要解旋酶的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）在利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定的过程中，为避免外源DNA等因素对实验结果的影响，可以采取的操作有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（　　）
A.二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
2.聚合酶链式反应（PCR）被广泛应用于遗传疾病的诊断、刑事侦查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基因。下列有关叙述错误的是（　　）
A.扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
B.PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温
C.PCR技术扩增时，两种引物的碱基序列要尽可能互补
D.若目的基因扩增5次，则需要消耗62个引物分子
3.下列有关电泳的叙述，不正确的是（　　）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
4.利用PCR扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下相关叙述错误的是（　　）
A.变性过程中断裂的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B.退火时引物a必须与引物b碱基互补配对
C.由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物b
D.延伸时需要热稳定的DNA聚合酶催化
5.利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是（　　）
A.引物越短，PCR扩增非目标DNA就越多
B.适温延伸过程中，需要提供ATP
C.引物中G/C含量越高，高温变性温度越高
D.共有2n－1对引物参与子代DNA分子的合成
第2课时　聚合酶链式反应（PCR）技术
【核心要点·巧突破】
知识点（一）
自主学习
1.体外扩增
2.模板DNA、引物对、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）、Mg2＋
3.（1）①94 ℃时　两条单链DNA　②55 ℃　两条引物
③72 ℃　脱氧核苷酸　热稳定的DNA聚合酶　引物3'端
（2）指数式
4.（1）病原体鉴定　遗传病诊断
5.（1）√
（2）×　提示：DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）√
（4）√
互动探究
　（1）双链DNA解旋为单链　（2）目的基因　不同　不能
（3）提示：在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入两种引物。
（4）提示：第3轮，如图所示：
（5）提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
（6）提示：共需消耗（2n－1）对引物。
学以致用
1.C　图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环的产物中，C正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D错误。
2.D　只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×（2n－1）＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占（24－2）/16＝7/8，D正确。
知识点（二）
自主学习
1.（3）琼脂糖凝胶电泳
2.（1）变性　退火　延伸　（2）一倍　2n　（3）反应缓冲液　DNA引物对　（4）不同　（5）全连续　半不连续　3'　Taq
高温　解旋酶　DNA　保留　RNA　不保留　
3.（1）紫外透射仪
4.（1）②94 ℃　2 min　（2）①80 V　②紫外透射仪
5.（1）√　（2）√　（3）√　（4）√
互动探究
1.提示：可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2.提示：变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
3.提示：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件等。
学以致用
1.ABD　PCR过程中需要的酶是热稳定的DNA聚合酶（Taq酶），它能从引物的3'端羟基（—OH）开始延伸DNA链，以形成DNA子链，B正确；dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、T、C、G 4种碱基，C错误；设计的引物是用于目的基因的复制，因此，引物应能与目的基因的碱基互补配对，但每种引物自身不应存在互补性，引物对之间也不应有较强的互补性，防止引物自身配对，D正确。
2.B　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上都应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号为蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。
【过程评价·勤检测】
网络构建
　（1）目的DNA片段（目的基因）的体外扩增
（2）引物对　dNTP　DNA聚合酶（Taq酶）
（3）PCR中解旋是通过控制温度实现的，在约94 ℃高温下，DNA的双螺旋结构被打开
（4）微量离心管、一次性吸液枪头、蒸馏水等在使用前进行湿热灭菌处理
课堂演练
1.B　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。
2.C　PCR技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是根据这一序列合成引物，A正确；PCR技术需要使用Taq酶而不是普通的DNA聚合酶，主要原因是Taq酶耐高温，B正确；PCR技术中所用的两种引物的碱基序列不能互补，原因是若能互补则会发生配对，从而减小引物与目的基因的结合概率，C错误；若一个目的基因扩增5次，可得到32个DNA分子，共64条DNA单链，其中原目的基因两条单链不需要引物，所以共需消耗62个引物分子，D正确。
3.C　由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
4.B　在PCR变性过程中高温破坏的是DNA分子的双螺旋结构，使其碱基对之间的氢键断裂，A正确；退火时引物a、引物b需要与模板进行碱基互补配对，如果引物a和引物b发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，B错误；由于DNA复制方式为半保留复制，而引物为单链DNA片段，所以由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物b，C正确；延伸时的温度为72 ℃左右，所以要用热稳定的DNA聚合酶催化子链合成，D正确。
5.B　引物越短，与模板DNA非特异性结合的概率越高，因此扩增出来的非目标DNA就越多，A正确；PCR过程中不需要提供ATP，B错误；引物中G/C含量越高，则DNA模板中G/C的含量也越高，高温变性的温度就越高，C正确；PCR技术的原理是DNA复制，根据DNA分子半保留复制特点可知，共有2n－1对引物参与子代DNA分子的合成，D正确。
7 / 7(共78张PPT)
第2课时　
聚合酶链式反应（PCR）技术
导
学 聚
焦 1.根据细胞内DNA复制原理和过程，理解聚合酶链式反应的原
理、条件和步骤。
2.利用PCR技术在体外对特定的DNA片段进行大量复制，并完
成电泳鉴定
核心要点·巧突破
01
过程评价·勤检测
02
课时训练·提素能
03
目录
CONTENTS
核心要点·巧突破
01
精准出击 高效学习
知识点（一）　聚合酶链式反应（PCR）技术
1. 概念：是目的DNA片段（目的基因）的 技术。
2. 条件：在向PCR管中加入一定量的

等后，设置好反应程序，启动PCR仪，自动完成反
应步骤。
体外扩增　
模板DNA、引物对、4种脱氧
核苷三磷酸（dNTP）、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶（Taq
酶）、Mg2＋　
（1）PCR的过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、退
火和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增
加大分子模板DNA彻底变性的概率。
3. 聚合酶链式反应（PCR）步骤
①变性：当温度上升到约 ，双链DNA解旋为
。
94 ℃时　
两
条单链DNA　
②退火：当温度下降到 左右时， 通过
碱基互补配对与两条单链DNA结合。
55 ℃　
两条引物　
③延伸：当温度回升到 左右时，溶液中的4种
在 的作用下，根据碱基
互补配对原则，连接到 之后，使引物延长，合
成新的DNA链。
72 ℃　
脱
氧核苷酸　
热稳定的DNA聚合酶　
引物3'端　
（2）PCR反应的结果
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反
应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行
DNA的延伸，这样，热稳定的DNA聚合酶只能特异地复制处
于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列
呈 扩增。
指数式　
4. 应用
（1）广泛应用于医学及分子生物学等领域，如：
、 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾
病治疗等。
（2）在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
病原体鉴
定　
遗传病诊断　
5. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）PCR过程不需要解旋酶。 （　√　）
（2）DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。
（　×　）
提示：DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，呈指数形式扩
增。 （　√　）
（4）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR
反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 （　√　）
√
×
√
√
　图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
（1）高温变性的目的是使 。
（2）PCR所需引物是依据 的一段已知序列设计而成
的，图1中引物A与引物B （填“相同”或“不
同”），其在PCR过程中 （填“能”或“不能”）重
复利用。
双链DNA解旋为单链　
目的基因　
不同　
不能　
（3）DNA复制时为什么需要引物？
提示：在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成
DNA，只能从引物的3'端延伸DNA链，因此DNA复制时应加
入两种引物。
（4）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生等长的目的基因（可用相关图解解释）？
提示：第3轮，如图所示：
（5）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合
理，请分别说明理由。
提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第
2组：引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
（6）如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
提示：共需消耗（2n－1）对引物。
PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的 DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的
DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等
长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
1. 如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是
（　　）
A. 片段a、b、c的长度均相同
B. 片段a、b只是第一次循环的产物
C. 片段c最早出现在第二次循环的产物中
D. 经过30次循环后，片段c的数量为230
解析： 　图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复
制而来，其长度比片段c长，A错误。由于原始模板在每次循环中
均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误。由于
第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最
早出现在第二次循环的产物中，C正确。经过30次循环后，得到的
DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D错误。
2. 利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，下列有关
叙述正确的是（　　）
A. 需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B. 共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
C. 应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D. 理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
解析： 　只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错
误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两
种引物的数量为2×（2n－1）＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的
反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种
引物的DNA片段占（24－2）/16＝7/8，D正确。
知识点（二）　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
1. 实验目的
（1）尝试运用PCR仪扩增DNA片段。
（2）关注PCR技术的应用。
（3）学习 检测DNA片段的方法和技术。
琼脂糖凝胶电泳　
2. 实验原理
（1）扩增DNA片段的过程包括 、 和 等
步骤的多次循环。
（2）理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加
，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循
环后，DNA片段数量可扩增至原来的 倍。
（3）PCR反应体系包括：DNA模板、 、dNTP
（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、人工合成的
、Taq酶等。
（4）在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的 温度。
变性　
退火　
延伸　
一
倍　
2n　
反应缓冲液　
DNA引物
对　
不同　
（5）PCR和体内DNA复制的差异
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
场所 试管中 细胞内
方式 半保留 局部区域复制 半保留 全链复制
起始位点 引物 端 复制起始位点
酶 仅一种DNA聚合酶 （ 酶） 多种酶
全连续　
半不连续　
3'　
Taq　
比较项目 PCR 细胞核内DNA复制
反应条件 温度变幅大 温和
解旋 解旋 解旋
引物 片段， 在复
制的子链中 片段，
在复制的子链中
产物 引物界定的片段 核基因组
循环次数 人为设置 与细胞分裂同步
高温　
解旋酶　
DNA　
保留　
RNA　
不保留　
解旋
3. 实验器材和试剂
（1）仪器：PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或
、微孔加热器（微量恒温仪）等。
（2）试剂：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR
缓冲液等。
紫外
透射仪　
（1）PCR扩增目的基因AKP
①采用微量取液器，在0.2 mL PCR管内配制50 μL反应体系
dNTP 混合物 10×PC
R 缓冲液 正向 引物 反向 引物 模板 DNA Taq酶 双蒸水
4 μL 5 μL 2 μL 2 μL 1 μL 1 μL 35 μL
4. 实验步骤
②按下述程序进行扩增
程序 温度 时间
a预变性 94 ℃ 5 min
b变性 1 min
c退火 55 ℃ 1 min
d延伸 72 ℃
e重复步骤b～d — 30个循环
f延伸 72 ℃ 7～10 min
94 ℃
2 min
（2）电泳分析
①电泳：维持恒压 1.5～2 h。
②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或 观察和记录
电泳结果。
80 V　
紫外透射仪　
5. 基于上述学习，判断下列相关表述的正误
（1）PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制
所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。 （　√　）
（2）DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率。 （　√　）
（3）利用PCR技术在体外扩增DNA，只需要提取少量的DNA即
可。 （　√　）
（4）利用琼脂糖凝胶电泳可以检测PCR扩增产物。 （　√　）
√
√
√
√
1. 在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
提示：可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分
布及粗细程度来评价扩增的效果。
2. 试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实
验结果分别产生什么影响？
提示：变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的
温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
3. 一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。
若出现与预期不一致的结果，应该从哪些方面进行分析？
提示：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及
PCR循环的条件等。
1. 影响DNA分子迁移速率的因素
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象。在PCR技术扩增DNA片段
的实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。
2. 未出现扩增条带的主要原因
①Taq酶失活。
②引物出现质量问题。
③Mg2＋浓度过低。
④变性时的温度低，变性时间短。
3. 出现非特异性扩增条带的主要原因
①模板DNA出现污染。
②引物特异性不强或形成引物二聚体。
③Mg2＋浓度过高。
④退火时的温度过低等。
1. （多选）聚合酶链式反应（PCR）是一种用于体外扩增特定的
DNA片段的分子生物学技术，参与PCR反应的物质主要为五种：
引物、酶、dNTP、模板和Mg2＋。下列有关说法正确的是（　　）
A. 细胞核内DNA复制的引物是一小段RNA，PCR的引物通常是一小
段DNA
B. 酶是指热稳定的DNA聚合酶，它能从引物的3'端羟基（—OH）开
始延伸DNA链
C. dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代表A、U、C、G 4种碱基
D. 引物自身不应存在连续的互补序列，引物对之间也不应有较强的
互补性
解析： 　PCR过程中需要的酶是热稳定的DNA聚合酶
（Taq酶），它能从引物的3'端羟基（—OH）开始延伸DNA
链，以形成DNA子链，B正确；dNTP是脱氧核苷三磷酸，N代
表A、T、C、G 4种碱基，C错误；设计的引物是用于目的基因
的复制，因此，引物应能与目的基因的碱基互补配对，但每种
引物自身不应存在互补性，引物对之间也不应有较强的互补
性，防止引物自身配对，D正确。
2. 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电
泳图谱。其中1号为DNA标准样液，10号为蒸馏水，PCR时加入的
模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是（　　）
A. PCR产物的分子大小在250～500
bp之间
B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
解析： 　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的
DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上都应包含目的基因，结
合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大
小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，
应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，
所以不是所需转基因植株，C正确；10号为蒸馏水，可排除反应体
系等对结果的干扰，D正确。
过程评价·勤检测
02
反馈效果 筑牢基础
（1）PCR技术是 技术。
目的DNA片段（目的基因）的体外扩增　
（2）PCR技术需要的条件是模板DNA、 、4
种 、缓冲液和热稳定的 、
Mg2＋等。
（3）PCR不需要解旋酶的理由是
。
（4）在利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定的过程中，为避
免外源DNA等因素对实验结果的影响，可以采取的操作有

。
引物对　
dNTP　
DNA聚合酶（Taq酶）　
PCR中解旋是通过控制温度实现
的，在约94 ℃高温下，DNA的双螺旋结构被打开　
微
量离心管、一次性吸液枪头、蒸馏水等在使用前进行湿热灭菌
处理　
1. 下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是
（　　）
A. 二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端
B. 二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C. 体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D. 二者遵循的碱基互补配对原则相同
解析： 　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸
方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不
需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利
用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正
确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对
原则相同，D正确。
2. 聚合酶链式反应（PCR）被广泛应用于遗传疾病的诊断、刑事侦
查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基
因。下列有关叙述错误的是（　　）
A. 扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
B. PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温
C. PCR技术扩增时，两种引物的碱基序列要尽可能互补
D. 若目的基因扩增5次，则需要消耗62个引物分子
解析： 　PCR技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的
基因的核苷酸序列，其目的是根据这一序列合成引物，A正确；
PCR技术需要使用Taq酶而不是普通的DNA聚合酶，主要原因是
Taq酶耐高温，B正确；PCR技术中所用的两种引物的碱基序列不
能互补，原因是若能互补则会发生配对，从而减小引物与目的基因
的结合概率，C错误；若一个目的基因扩增5次，可得到32个DNA
分子，共64条DNA单链，其中原目的基因两条单链不需要引物，
所以共需消耗62个引物分子，D正确。
3. 下列有关电泳的叙述，不正确的是（　　）
A. 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B. 待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA
在电泳中的迁移速率
C. 进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D. PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
解析： 　由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电
荷相反的电极移动，C错误。
4. 利用PCR扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下相关叙述错误的是（　　）
A. 变性过程中断裂的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B. 退火时引物a必须与引物b碱基互补配对
C. 由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引
物b
D. 延伸时需要热稳定的DNA聚合酶催化
解析： 　在PCR变性过程中高温破坏的是DNA分子的双螺旋结
构，使其碱基对之间的氢键断裂，A正确；退火时引物a、引物b需
要与模板进行碱基互补配对，如果引物a和引物b发生碱基互补配
对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，B错误；由
于DNA复制方式为半保留复制，而引物为单链DNA片段，所以由
原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物
b，C正确；延伸时的温度为72 ℃左右，所以要用热稳定的DNA聚
合酶催化子链合成，D正确。
5. 利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是
（　　）
A. 引物越短，PCR扩增非目标DNA就越多
B. 适温延伸过程中，需要提供ATP
C. 引物中G/C含量越高，高温变性温度越高
D. 共有2n－1对引物参与子代DNA分子的合成
解析： 　引物越短，与模板DNA非特异性结合的概率越高，因此
扩增出来的非目标DNA就越多，A正确；PCR过程中不需要提供
ATP，B错误；引物中G/C含量越高，则DNA模板中G/C的含量也越
高，高温变性的温度就越高，C正确；PCR技术的原理是DNA复
制，根据DNA分子半保留复制特点可知，共有2n－1对引物参与子
代DNA分子的合成，D正确。
课时训练·提素能
03
分级练习 巩固提升
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
知识点一　聚合酶链式反应（PCR）技术
1. 下列有关PCR技术的说法，错误的是（　　）
A. PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B. PCR技术的原理是DNA分子半保留复制
C. 退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
解析： 　PCR过程中需要模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核
苷三磷酸、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶、Mg2＋等，D错误。
2. （2024·江苏连云港高二期中）下列有关PCR的叙述，正确的是
（　　）
A. PCR的原理是DNA复制，解旋和复制是同时进行的
B. PCR的过程主要包括变性→延伸→退火，温度逐渐降低
C. PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n－1对
D. 每一循环都消耗引物和原料，需要在操作中及时补充
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　PCR的原理是DNA复制，该过程中解旋和复制不是同时
进行的，A错误；PCR的过程主要包括高温变性→低温退火→中温
延伸，可见该过程中不是温度逐渐降低，B错误；PCR技术扩增
时，一个DNA分子经过n轮复制产生的子代DNA数目为2n个，其
中的单链数目为2（n＋1）个，每个子链的延伸都需要引物，即除了
两条最初的模板链中没有引物，因此该过程中共需引物2n－1对，
C正确；PCR过程中的引物和原料是一次性添加的，不需要补充，
D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
3. （2024·江苏连云港高二期中）引物的设计是影响PCR扩增反应的
效率和特异性的关键因素，相关叙述正确的是（　　）
A. DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
B. 要尽量避免引物内部或引物之间存在碱基互补序列
C. PCR过程中使用的引物一般为单链RNA片段
D. 引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　DNA子链是从5'端向3'端进行延伸，因此DNA聚合酶能
够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误；要尽量避免引物内
部或引物之间存在碱基互补序列，防止因引物内部或引物之间碱基
互补降低目标DNA扩增效率，B正确；PCR过程中使用的引物一般
为单链DNA片段，C错误；引物的GC含量越高，结合特异性越
强，但GC含量过高，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，D
错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
4. （2024·江苏阜宁中学高二期中）用PCR技术将DNA分子中的A1片
段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制
酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（　　）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物
与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5'端到3'
端，据此依题意和图示分析可知，扩增后得到的绝大部分DNA片
段如图D所示。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
5. PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常
规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下
列符合在体外进行PCR反应条件的一组是（　　）
①稳定的缓冲溶液环境　②DNA模板　③引物　④dNTP　⑤热稳
定的DNA聚合酶　⑥解旋酶　⑦限制性内切核酸酶　⑧温控设备
A. ①②③④⑤⑥ B. ①②③④⑤⑥⑦⑧
C. ③④⑤⑥⑧ D. ①②③④⑤⑧
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳
定的缓冲溶液环境，①正确；PCR反应需要一定量的模板
DNA、引物对、4种dNTP（提供能量和原料）、热稳定的DNA
聚合酶，②③④⑤正确；PCR反应过程中通过高温使DNA变性
解旋，不需要解旋酶，⑥错误；PCR反应不需要限制性内切核
酸酶，⑦错误；PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，
因此需要温控设备，⑧正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
知识点二　利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
6. 下列关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述中，
不正确的是（　　）
A. PCR过程需要Taq酶
B. PCR过程需要DNA连接酶
C. PCR扩增区域由2种引物来决定
D. 不同大小的DNA在电场中迁移速率不同
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以复制过程中要
用热稳定的DNA聚合酶（Taq酶），A正确；PCR过程中用热稳定
的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合，不需要DNA连接酶，B错
误；PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引
物的3'端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物，由于DNA的两条
模板链为反向平行，所以复制时需要两种引物，C正确；不同大小
的DNA在电场中的迁移速率不同，因此可通过电泳的方法检测扩
增产物，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
7. （2024·徐州高二质检）在PCR反应体系中，加入过量的只与双链
而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在
游离状态不发出荧光，只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才
发出荧光。下列分析错误的是（　　）
A. PCR体系中需要加入Mg2＋来激活Taq酶
B. 若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因
的两种引物
C. 荧光染料在每个循环的延伸阶段掺入双链DNA中
D. 荧光信号强度与产物的数量呈正相关
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　在PCR体系中需要加入Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合
酶，用于合成DNA子链，A正确；若要扩增一个DNA上的某基因，
应加入该基因的两种引物，B错误；荧光染料只有在DNA复制过程
中掺入DNA双链中才发出荧光，在PCR反应的延伸阶段形成DNA
双链，C正确；荧光染料可用来鉴定扩增结果，扩增的产物越多，
则荧光信号强度越强，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
8. 用PCR技术特异性地拷贝X基因，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是（　　）
A. 第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B. 第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C. 第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个X
基因
D. 第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增片段的特定序
列，上一轮复制的产物为下一轮复制的模板。可根据DNA的半保
留复制特点画出前两轮复制的产物的示意图，再找规律。据图分析
可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；第
二轮复制得到22＝4个DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和
④，即得到①②③④各一个，B正确；第三轮复制得到23＝8个
DNA分子：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和
④、④复制得④和⑤，所以共有①②各1个，③④各2个，⑤2个
（等长），也就是有2个X基因（⑤），C正确；第四轮复制得到24＝16个DNA分子：①复制得①和③、②复制得到②和④、2个③复制得2个③和2个⑤、2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤得到4个⑤，所以第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个⑤（X基因），D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
9. （多选）（2024·南京金陵中学高二学情调研）荧光定量PCR技术
可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR体系中每加入1
对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催
化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信
号，即每扩增1条链，就有1个荧光分子生成。下列相关叙述错误的
是（　　）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A. 图示引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对
原则
B. Taq酶催化子链从3'端向5'端延伸，需要dNTP作为原料
C. 若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶
D. 原料充足时，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负
相关
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　图示引物与探针均为根据某条模板链设计的单链DNA，因而具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；根据图示中引物延伸的方向可以确定Taq酶可以催化子链沿着5'端向3'端的方向延伸，需要dNTP作为原料，B错误；若要用上述技术检测某基因的转录水平，需要以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成DNA后再进行PCR的扩增，因此要用到逆转录酶，C正确；由题干信息“每加入1对引物的同时加入1个与某条模板链互补的荧光探针”“每扩增1条链，就有1个荧光分子生成”可知，原料充足时，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
10. （多选）PCR技术可用于遗传多样性的研究。如图是对跳虫A和跳虫B的DNA分析实验过程，下列有关叙述正确的是（　　）
A. 蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时，加入蛋白酶有
助于释放出DNA
B. Taq酶能够耐高温，常在PCR中用于DNA链的合成
C. 将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA
片段的大小
D. 阴性对照是加入DNA模板和PCR扩增过程中所需的其他混合物，
以检测是否有“污染”
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
解析： 　蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，真核生物的DNA
与蛋白质结合在一起，因此，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释
放出DNA，A正确；Taq酶能够耐高温，高温下不会变性，常在
PCR中用于DNA链的合成，B正确；阴性对照是未加入DNA模板
但加入PCR扩增过程中所需的其他混合物，目的是检测试剂是否
污染，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
11. （2024·盐城实验高级中学高二期中）金属硫蛋白（MT）是一
类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答
下列问题：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过
获得DNA用于PCR扩增。
解析： PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不
能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR
扩增。
逆转
录
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引
物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当
的 切割位点。设计引物
时需要避免引物之间形成 ，从而造成引物
自连。
限制性内切核酸酶（或限制酶）
碱基互补配对
解析： 设计一对与MT基因两端序列互补配对的引
物（引物1和引物2），需要在引物中增加适当的限制性
内切核酸酶（限制酶）的识别序列，便于构建重组质
粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间
形成碱基互补配对。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
（3）图中步骤1代表 ，步骤2代表退火，步骤3代表
，这三个步骤组成一轮循环。
解析： 根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤
2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。
变性
延
伸
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高
会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物
长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物
需要设定更高的退火温度。
解析： 退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，
退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间
氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物
时需要设定更高的退火温度。
引物与模板
G—C含量高
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
（5）如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施
有 （填序号）。
①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物
解析： 如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是
退火温度过高使扩增效率降低；也可能是未按照目的基因两
端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的
措施有降低退火温度、重新设计引物等。
②③
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
感 谢 观 看!

展开更多......

收起↑